Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) er en fremtrædende forsøgsdyr anvendt i et stigende antal videnskabelige discipliner, herunder, men ikke begrænset til udviklingsmæssige genetik, toksikologi, adfærd, akvakultur, regenerativ biologi og modellering af mange menneskelige lidelser 1 - 5. Selvom arten er relativt let at vedligeholde i laboratoriet, er der en række ledelsesmæssige udfordringer forbundet med deres kultur 6. Den mest fremtrædende af disse er larveopdræt, især når fiskene først begynder at fodre efter gas blære inflation 7. Under normale, kontrollerede forhold, denne udviklingsmæssige begivenhed indtræffer på ~ 5 dage efter befrugtning (DPF), med de følgende 3 - 5 dages vækst er særligt kritiske 7. Den centrale tekniske vanskeligheder i løbet af denne fase er i tilstrækkelig grad at opfylde de ernæringsmæssige krav til første fodring larver - foder elementer skal være af passende størrelse, Digestible, attraktiv og tilgængelig på en næsten kontinuerlig basis, uden at skabe overdreven affald i dyrkning tanke. Historisk dette er opnået typisk ved at levere en lang række små mængder foder til fisk i tanke, sammen med rutinemæssig vandudskiftning 8,9. Mens disse metoder er til en vis grad en succes, er de ineffektive, kræver høje arbejdskraft input, og returnere eneste variabel og begrænsede vækstrater og overlevelse 10.
I naturen, zebrafisk larver formentlig foder på rigelige små zooplankton til stede i vandsøjlen 11. Af denne grund, larviculture protokoller, der inkorporerer live feeds såsom Paramecium, hjuldyr, Artemia og er typisk mest effektive 7. I 2010, Bedste og medforfattere viste, at det var muligt at dyrke larvernes zebrafisk i statisk, brakvand sammen med saltvand hjuldyr for de første 5 dage af eksogen fodring 12. Denne tilgang, som udnytteres den naturlige høje produktivitet hjuldyr kulturer til at give rigelig, meget nærende bytte uden at forurene vandet, udbytter meget høje larvernes vækst og overlevelse med lav arbejdskraft 12,13. I de senere år har et stigende antal laboratorier rundt om i verden vedtaget variationer af denne protokol, og mange er nu dyrkning hjuldyr i en kontinuerlig måde at støtte planteskole systemer 14.
I løbet af de sidste mange år, har metoder til både hjuldyr / zebrafisk polykultur og hjuldyr produktion blevet forfinet og forbedret til at blive mere standardiseret og let skalerbar. Denne artikel indeholder trin-for-trin instruktioner til 1) kontinuerlig og robust hjuldyr produktion og 2) etablering af hjuldyr / zebrafisk polykultur system, der anvendes til at understøtte robust vækst af fisk i de første 5 dage af eksogen fodring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hjuldyr Kultur
- Grundlæggende elementer i en kultur system ved hjælp af en 100 L dyrkningsbeholder
- Saml alle komponenter til opsætningen hjuldyr kultur. Opsætning af hjuldyr kultur består af en kultur fartøj (CV) for at dyrke hjuldyr; en lignende fartøj til at opretholde feedout hjuldyr (feedout kultur fartøj, FCV); en rundbundet udrugning jar (Feed Reservoir, FR) til opbevaring af alger fødeblandingen (AFM); en luftforsyning (AS) for at lufte CV, FCV og FR; en peristaltisk pumpe med en måling timer (PMT) til at styre levering af alger foder ind i CV og FCV; og en tandtråd partikelfilter (FPF), der sidder inde i CV.
BEMÆRK: En komplet liste over forbrugsvarer og komponenter findes i Materials List.
- Saml alle komponenter til opsætningen hjuldyr kultur. Opsætning af hjuldyr kultur består af en kultur fartøj (CV) for at dyrke hjuldyr; en lignende fartøj til at opretholde feedout hjuldyr (feedout kultur fartøj, FCV); en rundbundet udrugning jar (Feed Reservoir, FR) til opbevaring af alger fødeblandingen (AFM); en luftforsyning (AS) for at lufte CV, FCV og FR; en peristaltisk pumpe med en måling timer (PMT) til at styre levering af alger foder ind i CV og FCV; og en tandtråd partikelfilter (FPF), der sidder inde i CV.
- Konfiguration
- Løfte CV og FCV på et stativ eller bord, så kulturerne let kan høstes via et afløb passer ind i en samling container (figur 1). Brug fleksibel luftforsyningsslange at forbinde AS til en længde på stift rør i hvert dyrkningsbeholderen. Sørge for, at slangen er lang nok til at levere luft til bunden af CV eller FCV.
- Brug en lille kapacitet luftledningen at forbinde AS til en længde af stift rør, der strækker sig til bunden af FR, der indeholder AFM. Installer en ventil i hver luftledning for at regulere luftstrømmen. Slut FR til PMT med fødningssystem slanger og køre slangen fra PMT i et hul boret i siden af CV / FCV, nær toppen. Figur 1.
- Start op
- Fyld dyrkningsbeholderen til 90% af det tilgængelige volumen med omvendt osmose vand (RO). Hvis RO ikke er tilgængelig, kan du bruge ren, dechlorerede kommunale vand; Imidlertid bør en biosikkerhed risikovurdering udføres for at sikre, at ingen potentielt patogene organismer er til stede i kilden vand. BEMÆRK: En sådan analyse kan udføresaf enhver kvalificeret vand prøvningslaboratorium.
- Dosis dyrkningsbeholderen vand med akvariet salt at nå en saltholdighed på 15 g / l. Indstil luftstrømmen ind i beholderen, så den holder en "rullende kog", og tilsæt derefter langsomt den målte mængde af salt til dyrkningsbeholderen indtil den er helt opløst ved beluftningen. Fortsæt med beluftning vandet til> 1 time for at sikre, at den fuldt ud er iltet.
- Gør algerne fødeblandingen. Til 3 liter rent, dechloreret frisk (0 ppm) vand tilsættes 100 g NaHCO3 og 100 g ammoniak neutraliseringsmiddel (natrium hydroxymethylsulfonate). Denne sidste reagens giver den yderligere fordel at neutralisere eventuelle resterende klor fra hanen vand eller blegemiddel rester fra desinfektion kultur udstyr. Det er afgørende at sikre, at disse forbindelser er helt opløst. Derefter tilsættes 1 l af alger koncentrat (biomasse tørvægt ~ 15%). Tilføj fødeblandingen til FR og opbevares ved 4 ° C.
- Tilføj en starterkultur af 5 - 10 mio
- Tænd for PMT og begynde at pumpe algerne foder i hjuldyr dyrkningsbeholderen. Anvendelse af timer funktion af PMT, indstille tilførselshastighed på alger foderblanding, således at ~ 1,6 ml alger fødeblanding leveres per million hjuldyr i kultur, per dag. Fordel fodringer i små portioner med regelmæssige mellemrum i løbet af en 24 timers periode; de mere hyppige fodringer, jo bedre.
- Kalibrere tilførselshastighed på pumpen ved manuelt at dreje på PMT for en fastsat periode (f.eks, 1 min) og indsamle de alger, det pumper i dette interval i en gradueret cylinder eller bægerglas. For eksempel, hvis de PMT doser 5 ml af alger i 1 min, derefter dosishastigheden ville være5 ml alger / min.
- Beregn den krævede daglige fodring sats ved at gange antallet af hjuldyr til stede, i millioner, med 1,6 ml. For eksempel ville en hjuldyr kultur med en befolkning på 100 millioner hjuldyr kræver ~ 160 ml foder om dagen (100 x 1,6 ml).
- Indstil PMT at dosere den samlede daglige foder behov med jævne mellemrum gennem en 24 timers periode. For eksempel kunne levering af en samlet daglig fodermængde af 160 ml leveres i portioner hver 3. time over en 24 timers periode ved hjælp af en PMT sæt med en doseringspumpe på 5 ml / min for 4 min, 8 gange dagligt (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 fodringer = 160 ml).
- Tillad kulturen at vokse, indtil det genererer den ønskede population, typisk i 48 - 72 timer, før høst. Ved 24 timer efter opstart, tilsæt tandtråd partikelfiltre til dyrkningsbeholderen og begynde normal vedligeholdelse.
- Opretholdelse
BEMÆRK: kulturen fungerer på en kontinuerlig basis og kræver routine vedligeholdelse, som ideelt set bør udføres på samme tidspunkt hver dag, i følgende rækkefølge.- Fyld FCV til 90% af den tilgængelige volumen med ren, dechlorinated ferskvand, doseret med 10 g / L akvarium salte. Sikre, at vandet er godt blandet, og at alle saltet er helt opløst. Indstil luftstrømmen ind i beholderen, så den holder en "rullende koge". Mål saltholdighed med et refraktometer og sikre, at saltindholdet er 10 g / l. Det er afgørende for at opfylde dette mål og ikke at overskride den.
- Prøve hjuldyr i CV: Sørg for, at kulturen er godt blandet, derefter indsamle 3 prøver af en 2 - 3 ml hver bruger en overførsel pipette eller autopipettor, fra forskellige dele af kulturen. Kombiner disse prøver i et rør eller et hætteglas af passende størrelse (f.eks 10 ml).
- Transfer 1 - 2 ml af den kombinerede prøven på en petriskål, således at den kan visualiseres under et dissektionsmikroskop. Kontroller kvaliteten af kulturen (svømning adfærdhjuldyr, tilstedeværelse af fritliggende æg, forurener protozoer).
- Immobilisere hjuldyr i det resterende kombinerede prøve ved tilsætning af 100 pi 50% Lugols iodopløsning til prøven. Inden for få sekunder efter tilsætning af Lugols, observere hjuldyr at stoppe svømning. Nu let tælle hjuldyr.
BEMÆRK: Ethanol, fortyndet blegemiddel eller eddike kan anvendes i stedet for Lugols. Eddike (2 dråber / 10 ml) har fordelene ved at være ufarligt, ikke at miste styrke i opbevaring som blegemiddel og jod løsninger kan, og ikke gør hjuldyr kontrakten, så korona af cilier og "fod" forbliver forlænget og dyr ser mere naturligt. - Sikres, at prøven er godt blandet (immobiliserede hjuldyr vil bosætte sig hurtigt), derefter hurtigt tage en ~ 2 ml delprøve i en plastik pipette og dispensere 1 ml i en Sedgewick-Rafter tælle slide (20 x 50 1 mm firkanter) (Figur 2 ). Ved hjælp af en dissekere eller sammensat mikroskop, tæller de intakte hjuldyr og total antal æg er knyttet til disse hjuldyr (figur 2). Tæl så meget af diasområdet som nødvendigt at tælle ~ 100 hjuldyr. Beregn antallet af hjuldyr per ml, og registrere dette i et regneark eller logbog.
- Harvest ~ 30% af mængden af hjuldyr i CV: Fjern indblæsningsluften og tandtråd filter, langsomt åbne ventilen i bunden af CV og lade vandet til at flyde ind i en plankton opkøber med en 53 um mesh sigte. Opsamle vandet strømmer ud af bunden af opsamleren efter filtrering i en spand eller afløb. Brug en mild til moderat flow for at undgå at beskadige hjuldyr. Lad ikke de hjuldyr til tørre på skærmen.
- Af hensyn til ensartetheden er det tilrådeligt at etablere FCV med en standard antal hjuldyr hver dag. Derfor baseret på den kendte CV hjuldyr densitet og høst volumen, justere FCV samlede volumen for at opnå en ensartet slutdensitet (f.eks., 1500 hjuldyr / ml). Tilsæt høstede rotiviser til FCV: overføre forsigtigt hjuldyr fra skærmen samlingen med en vaskeflaske fyldt med rent saltvand (10 - 15 g / L). Vend skærmen over FCV og vask hjuldyr i FCV med en blid strøm af saltvand. Start PMT til at levere foder (~ 1,57 ml per million hjuldyr pr dag) til FCV.
- Skrub hele indersiden af CV med en ren, blød nylonbørste eller krat pad.
- Lav en ny blanding af 15 g / l vand ved at tilsætte den passende mængde af salt til en afmålt mængde rent RO vand i en 5 gallon spand til at erstatte den mængde vand tabte til høst. Tilsæt salt til vandet i spanden og rør kraftigt, indtil den er helt opløst, og derefter tilføje til CV.
- Ved hjælp af en højtryks spray i en vask, skyl floss filter, indtil den er fri for snavs, og derefter returnere det til CV.
- Juster tilspændingshastigheder af alger leveret til CV ved at ændre varigheden af hver dosering begivenhed, i henhold til den daglige optælling af hjuldyr / ml.Brug beregninger i trin 1.3.8, ovenfor for at bestemme den passende mængde af foder, der skal leveres.
- Ca. 24 timer senere, gentage processen. Start ved at høste hjuldyr tilbage i FCV (der ikke var nødvendige for den foregående dag) på samme måde som beskrevet ovenfor (trin 1.4.2 - 1.4.10). Koncentrer dem i 2 I frisk, rent dechloreret vand (5 g / l salt). Disse kan opbevares ved 4 ° C som en backup levering, eller anvendes til foder senere stadier af fisk, end hvad der er beskrevet i denne protokol.
BEMÆRK: Denne protokol tillader op til 2 - 3 dages reduceret vedligeholdelse kultur (med normal automatisk fodring), fordi hjuldyr i CV kan tåle udeladelse af høsten uden alvorlige konsekvenser.
2. polykultur
- Opsætning
- Saml zebrafisk embryoner fra en gydning begivenhed ved at hælde opfostrede embryoner gennem en te-si og derefter forsigtigt skylning med sterile fish vand (eller enhver anden ikke-forurenet kilde til passende konditioneret opløsning, fx, embryo medium, E3, etc.) fra en vaskeflaske i petriskåle.
- Inkubér embryoner ved 25 - 28 ° C i petriskåle ved en tæthed på 40 - 50 embryoer pr skål for 5 dage.
- Begynd polykulturudstyr fase på dag 5 post-befrugtning, eller når mere end 90% af den skraverede larver aktivt svømmer op i vandsøjlen.
- Podning
- Tilføj 500 ml hjuldyr kultur direkte fra FCV til en 3,5 L planteskole tanken; inddragelse af hjuldyr kultur vand giver algefoder der opretholder det ernæringsmæssige indhold af hjuldyr under polykultur.
- Hæld forsigtigt larverne fra en petriskål i børnehaven tanken. Sikre, at ingen larver forbliver i skålen.
- Tilføj 500 ml ren, konditioneret fisk vand fra et recirkulerende system eller dedikeret vandkilde til tanken for at nå et endeligt volumen på 1 liter og en endelig salinity af 5 g / l.
BEMÆRK: Denne saltholdighed er kritisk, fordi zebrafisk larver overlevelse vil blive negativt påvirket, hvis saltholdigheden er> 7 g / l og hjuldyr overlevelse vil blive negativt påvirket, hvis saltholdighed <2 g / l.
- Polykultur fase
BEMÆRK: polykultur fase skal vare i op til 4 dage efter podning (i alt 5 dage, svarende til dage 5-9 post-befrugtning).- Overhold polykultur tanken mindst en gang om dagen i denne periode for at sikre, at hjuldyr og fisk er til stede og voksende. Sørg for, at hjuldyr er synlige i hele vandsøjlen. Sørg for, at de fishs er også synlige i vandsøjlen, svømning blandt hjuldyr.
- Start normale vandstrøm gennem tanken. Placer en skærm eller hus over drænporten at sikre, at larverne ikke skylles ud af tanken.
BEMÆRK: Ved slutningen af denne fase vil fiskene være store nok til at forbruge større bytte elementer såsom Artemianauplier eller forarbejdede foder poster i størrelsen intervallet 75-125 um.
BEMÆRK: hjuldyr populationsdynamik inden for et repræsentativt polykultur tank, blev målt ved prøveudtagning / tælle hjuldyr fra tanken på samme måde som beskrevet i trin 1.4.2 - 1.4.5. Dette blev gjort en gang om dagen fra begyndelsen af polykultur fase, indtil det blev afsluttet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kontinuerlige hjuldyr kultur her beskrevne system er dynamisk, og det er normalt for hjuldyr numre til at svinge til en lille grad over tid, hvis der er variationer i den daglige fodring og høst satser. Befolkningen i de hjuldyr i en af de aktive kulturer i akvakulturanlæg i Boston børnehospital, som opbevares i den ovenfor beskrevne måde, blev overvåget i 30 dage (Figur 3). Den gennemsnitlige kultur tæthed i denne periode var 932 hjuldyr / ml, med et maksimum på 1.330 hjuldyr / ml og mindst 510 hjuldyr / ml. Dette repræsenterer den typiske udførelse af en hjuldyr kultur vedligeholdt i overensstemmelse med denne protokol.
Dynamikken i hjuldyr befolkningen i en polykultur tank med zebrafisk er vist i figur 4. En 3,5 L akvarium blev podet med 500 ml hjuldyr kultur fra FCV, 500 ml steriliseret fish vand, og 40 5-dage gamle vildtype (stamme Tubingen) larver, at vise, hvordan hjuldyr og zebrafisk udføre i en typisk polykultur tank. Hjuldyr befolkning i polykultur tanken toppede på andendagen med en densitet på 747 hjuldyr / ml (figur 4). Tætheden af de hjuldyr i polykultur tanken faldt i 5 dag polykultur periode til mindst 481 hjuldyr / ml på dag 5. Men den gennemsnitlige hjuldyr tæthed i hele perioden var 589.4 hjuldyr / ml, og den mindste værdi af 481 hjuldyr / ml er ~ 10 gange større end hjuldyr densitet ved udgangen af polykultur periode i tidligere offentliggjorte arbejde 12.
Zebrafisk vækst i perioden fem dage er vist i figur 5. Fisken viste stabil vækst hver dag, fra en gennemsnitlig samlet længde på 3,904 mm ± 0,063 SEM, da de blev tilføjet til polykultur tanken til en gennemsnitlig samlet længde på 5,423 ± 0,063 SEM påden sidste dag i polykultur fase. Overlevelse var 95% (38/40).
Kvalitetsparametre blev målt dagligt i den repræsentative polykultur tanken, og er vist i tabel 1. Værdierne af disse parametre svarer til tidligere offentliggjorte arbejde 12, og udgør betingelser, der bidrager til vækst og overlevelse af både hjuldyr og fisk i den periode, hvor polykultur 5 dagen.
| Dag | Dag | Saltholdighed | TAN | NO 2 | NO3 | pH | Alkalinitet | Hårdhed | Temperatur |
| (Aktuel) | (post-befrugtning) | g / L | mg / l | mg / l | mg / l | mg / L (CaCO 3) | mg / L (CaCO 3) | ° Celsius </ td> | |
| mandag | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| tirsdag | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23.3 |
| onsdag | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22.3 |
| torsdag | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22.8 |
| Fredag | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
Tabel 1. kvalitetsparametre ina repræsentant zebrafisk polykultur Tank.
Figur 1. hjuldyr Kultur Opsætning Forklaring:. Kultur Vessel (CV), Feedout Kultur Vessel (FCV), Air Supply (AS), Floss Partikelfilter (FPF), Alger foderblanding (AFM), Feed Reservoir (FR), Programmerbar lysmåling Timer (PMT). Fuldt optrukne linier repræsenterer levering alger foder. Stiplede linjer repræsenterer luft levering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Påfyldning af et Sedgewick-Rafter Counting Slide. Klik her for at se etstørre udgave af dette tal.
. Figur 3. hjuldyr populationsdynamik i Kultur over en 30 dages periode Forklaring: Antallet af optalte hjuldyr (hunner + æg) per ml er på x-aksen. Antallet af dage i kultur er på y-aksen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. hjuldyr Befolkning Dynamics løbet en 5 dages polykultur Forklaring:. Antallet af optalte hjuldyr (hunner + æg) per ml er på x-aksen. Antallet af dage i polykultur er på y-aksen. Klik her til view en større version af dette tal.
. Figur 5. zebrafisk vækst i en 5 dages polykultur Legend: Værdier er gennemsnitlige totale længde i mm; fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En vellykket gennemførelse af hjuldyr polykultur metode til fodring tidlige larve zebrafisk kræver effektive protokoller for to opgaver: etablering og vedligeholdelse af et kontinuerligt hjuldyr kultur system til at fodre fisk, og dyrkning første fodring zebrafisk larver sammen med hjuldyr i samme tank.
Opsætningen i en sammenhængende saltvands hjuldyr produktionssystem for zebrafisk laboratorier først beskrevet af Lawrence og medforfattere 14 er blevet ændret og udvidet i en række måder at gøre det både mere robust og universel i anvendelse. Den nye protokol indeholder forbedringer både i udstyr og metode.
Lagersystemet for alger foderblandingen beskæftiger nu klækning krukker, der anvendes i havkat produktionssystemer 15. Opbevaring af foderet i disse rundbundede krukker letter grundig blanding af alger feed, så at den ikke stratificere eller klumpe og føre til tilstoppeging af transportledninger, et problem som ofte plaget den oprindelige protokol. Ligeledes brug af en alt-i-en programmerbar timer / doseringspumpe reducerer det samlede antal komponenter, og forenkler den afmålte levering af foder til hjuldyr. Det tillader også dosering af foder til hjuldyr på timebasis over 24-timers periode, som er at foretrække frem for færre, større fodringer, fordi foderet er assimileret mere effektivt.
En metode til at tælle hjuldyr, der tillader finjustering af levering foder til hjuldyr kulturen er blevet inkluderet i denne protokol. Fodring af hjuldyr baseret på en nøjagtig, realtid vurdering af deres befolkningstal sikrer stabil produktion på højt niveau. En sekundær Feedout Kultur Vessel er også blevet tilføjet til protokollen. En kontinuerlig kultur-system kan producere en daglig overskud af millioner af hjuldyr ud over, hvad der er behov for endnu en stor børnehave operation, på grund af variationer i børnehaven aktivitet. Dette Feedout CuLTURE Vessel bruges til at holde hjuldyr til daglig podning af polycultures, og de resterende hjuldyr kan føres som en høj kvalitet ernæringstilskud til senere larver og tidlige juvenile stadier af fisk. Den reducerede saltholdighed (10 g / l) i FCV også pre-acclimates de hjuldyr til forholdene i polykultursystemer tanke, så de opretholder energisk svømning aktivitet, når overføres.
Vigtigere, at disse ændringer i hjuldyr dyrkning protokollen bly direkte forbedringer i polykultur tilgang, især med hensyn til arbejdskraft. Den tidligere metode udgivet af Best og medforfattere involverede ikke blot en indledende podning af hjuldyr på dag 5, men også daglige tilføjelser af hjuldyr, indtil den statiske polykultur fase sluttede på dag 9 12. Mean hjuldyr tætheder i denne periode toppede på 333 hjuldyr / ml på dagen for podning og endte under 50 hjuldyr / ml ved afslutningen af polykultur fasen på dag 9 12. I modsætning hertil, Den nuværende protokol fastholder meget højere tætheder overalt, typisk starter ved ~ 665 hjuldyr / ml, og slutter med ~ 481 hjuldyr / ml på dag 9.
Der er to faktorer, der gør det muligt disse meget højere hjuldyr tætheder. 1) Den overordnede robusthed af hjuldyr kultur anvendes til podning er langt større. Den reviderede trinnet podning af polykultur med lige store volumener af alger / hjuldyr ved 10 g / L saltholdighed og ~ 0 g / L saltindhold fiskevand, resulterer i et mellemprodukt saltholdighed på 5 g / L, der opretholdes i hele polykultur. Startende med en større samlet volumen på vand (1 l) også er mere befordrende for hjuldyr vækst og overlevelse i polykultursystemer tanke. I den tidligere offentliggjorte metode, lavere udgangspunkt hjuldyr tætheder i et mindre volumen nødvendiggjorde daglige tilføjelser af hjuldyr til at genopbygge tab ved nedslidning (formentlig på grund af dårlig vandkvalitet) og forbrug ved at udvikle fiskelarver. Resultaterne af disse justeringer af protokollen dramattisk reducere arbejdskraft indgange (én fodring over 4 dage i forhold til 4 fodringer i 4 dage med den tidligere metode). Larvernes vækst og overlevelse resultater i den indledende 5 dage polykultur periode er sammenlignelig med tidligere offentliggjorte 12.
Produktiviteten i hjuldyr kulturer nødvendigvis er begrænset af input-feed. Hjuldyr densiteter på 2.000 - 3.000 ml / kan opnås med disse metoder blot ved at øge leveringen foder. Når hjuldyr udbytte pr foder er kendt, kan tilspænding justeres til at matche hjuldyr produktion til forventede behov. I weekender og på helligdage, kan fodring reduceres, og høsten udeladt for en dag eller to uden at skade hjuldyr, selv om deres produktive potentiale vil være suboptimal indtil den normale daglige fodring og høste rutinemæssige genoptages.
Når der er en uventet behov for flere hjuldyr end normalt, kan en større del af befolkningen høstes uden at skade culklatur, men afhængig af størrelsen af høsten kulturen kan kræve en dag eller mere for at genvinde sin sædvanlige massefylde. Hvis hjuldyr efterspørgsel vil blive reduceret for mere end en dag eller to, er produktionen bedst reduceres ved at reducere leveringen foder, snarere end faldende høsten. En høst på mindst 25% / dag opretholder en yngre hjuldyr aldersprofilen så hjuldyr er mere energisk og frugtbar, forbedre deres præstationer i polykultursystemer tanke.
Denne protokol kan let tilpasses til mindre skalaer for mindre zebrafisk faciliteter. For eksempel en 15 L kultur, som bekvemt kan oprettes i en standard 5 US gallon (20 L) spand med hånd-fodring to gange om dagen, kan let nå en densitet på 1.000 hjuldyr / ml. Anvendelse af en fødepumpe giver densiteter på 2.000-3.000 / ml. En enkelt spand høstet ved 30% / dag kan derfor give 5-15 millioner hjuldyr / dag, nok til at starte 10 - 30 polycultures. To spande kan anvendes på samme CV + FCV protokol som beskrevet enBove. En alger + ammoniak controller + pH-buffer pre-mix-feed er tilgængelig (se tabel for specifikke reagenser / udstyr), der er bekvemt for små applikationer. Det har tilstrækkelig viskositet, at alger celler ikke udfældes hurtigt og så det ikke kræver kontinuerlig blanding i foderet reservoiret.
Hvis hjuldyr kultur produktivitet falder, eller en usædvanlig ophobning af døde hjuldyr findes i kulturen, alle kvalitetsparametre (temperatur, saltholdighed, pH, NH3 koncentration) bør kontrolleres. Brachionus plicatilis normalt udøver sine æg, før de udklækkes, og tilstedeværelsen af mange separate æg (som normalt ikke udklækkes) i kulturen er et tegn på stress, oftest på grund af akkumuleret ammoniak.
Hvis hjuldyr kultur vand er en mere intens grøn end normalt, så enten tilspænding er for høj, eller hjuldyr ikke forbruge fødevarer på deres sædvanlige sats. Normalt er caanvendes af enten en stressfaktor eller kulturen er overharvested uden tilpasning tilspænding ifølge den reducerede befolkning. I tætte kulturer er det normalt for en brunfarvning at ophobe sig i vandet som alger pigmenter metaboliseres af hjuldyr.
Brugen af saltvand hjuldyr i den første fodring fase er blevet bredt vedtaget på tværs af zebrafisk forskningsmiljø da metoden først blev offentliggjort i 2010 12. De foretaget i polykultur opdræt metode, der er skitseret i denne protokol modifikationer vil tillade et endnu større antal laboratorier til at vedtage denne fremgangsmåde, uanset skala. Disse fremskridt er rettidig; udviklingen i gen-knockout-teknologi (f.eks., CRISPR, Talens, etc.) til zebrafisk vil kræve strømlinede og effektive protokoller opdrætsmetoder at dyrke tusindvis af nye stammer af genetisk modificerede fisk til brug i forskellige områder af videnskaben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
EF Henry er ansat af Reed Mariculture, Inc., et selskab, der leverer hjuldyr, alger koncentrater og andre forsyninger til akvakultur og fisk hobbyist markeder.
Acknowledgments
Pleje og brug af fisk genereret for repræsentative resultater, der er beskrevet i denne protokol blev udført i fuld overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Boston Børnehospital, protokol # 14-05-2673R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
- Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , CRC Press. (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
- Biology and Culture of Channel Catfish. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. 34, 634-657 (2004).
