Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) är en framstående försöksdjurs används i ett växande antal vetenskapliga discipliner, inklusive, men inte begränsat till utvecklingsgenetik, toxikologi, beteende, vattenbruk, regenerativ biologi och modellering av många mänskliga sjukdomar 1 - 5. Även arten är relativt lätt att underhålla i laboratoriet, det finns ett antal utmaningar för ledningen som är förknippade med deras kultur 6. Den mest framträdande av dessa är larv uppfödning, särskilt när fisken börjar först att mata efter gas blåsan inflationen 7. Under normala, kontrollerade förhållanden, denna utvecklings händelse inträffar på ~ 5 dagar efter befruktningen (DPF), med följande 3 - 5 dagars tillväxt är särskilt kritisk 7. Den centrala tekniska svårigheter under detta skede är att på ett adekvat möta näringsbehov i den första matnings larver - foder objekt måste vara lämplig storlek, Digesliga, attraktiv och tillgänglig på en nästan kontinuerlig basis, utan att skapa alltför avfall i odlingstankar. Historiskt har detta uppnåtts typiskt genom att leverera ett stort antal små mängder av foder för fisken i tankar, tillsammans med rutinvattenutbyte 8,9. Även om dessa metoder är till viss del framgångsrika, de är ineffektiva, kräver hög arbetsinsats, och åter enda variabel och begränsade tillväxttakt och överlevnad 10.
I naturen, zebrafisk larver förmodligen äter rikligt små djurplankton som finns i vattenmassan 11. Av denna anledning, larviculture protokoll som innehåller live-flöden såsom Paramecium, hjuldjur och Artemia är oftast mest effektiva 7. Under 2010, bäst och medförfattare visade att det var möjligt att odla larver zebrafisk i statisk, bräckt vatten tillsammans med saltvatten hjuldjur för de första 5 dagarna av exogen utfodring 12. Detta tillvägagångssätt, som utnyttjaes naturliga hög produktivitet av hjuldjur kulturer för att ge gott, mycket näringsrik byte utan att förorena vattnet, ger mycket höga hastigheter av larv tillväxt och överlevnad med låg arbetsinsats 12,13. Under de senaste åren har ett ökande antal laboratorier runt om i världen antog varianter av detta protokoll, och många är nu odling hjuldjur på ett kontinuerligt sätt för att stödja förskolor system 14.
Under de senaste åren har metoder för både hjuldjur / zebrafisk polyculture och rotifer produktion förfinats och förbättrats för att bli mer standardiserade och lätt skalbar. Den här artikeln innehåller steg-för-steg-instruktioner för 1) kontinuerlig och robust rotifer produktion och 2) inrättandet av hjuldjur / zebrafisk polyculture system som används för att stödja en stark tillväxt av fisk under de första 5 dagarna av exogen utfodring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rotifer Kultur
- Grundläggande inslagen i en kultursystem med hjälp av en 100 L odlingskärl
- Samla alla komponenter för rotifer kultur setup. Den hjuldjur kultur inställning består av ett odlingskärl (CV) att odla rotatorierna; ett liknande fartyg skall kunna behålla utportioneringsrörelse hjuldjur (utportioneringsrörelse odlingskärl, FCV); en rundbottnad kläckning burk (Feed Reservoir, FR) för lagring av alger foderblandning (AFM); en lufttillförsel (AS) att lufta CV, FCV och FR; en peristaltisk pump med en doserings timer (PMT) för att styra leverans av alger feed in CV och FCV; och en tandtråd partikelfilter (FPF) som sitter inne i CV.
OBS: En fullständig lista över förbrukningsartiklar och komponenter finns i materiallistan.
- Samla alla komponenter för rotifer kultur setup. Den hjuldjur kultur inställning består av ett odlingskärl (CV) att odla rotatorierna; ett liknande fartyg skall kunna behålla utportioneringsrörelse hjuldjur (utportioneringsrörelse odlingskärl, FCV); en rundbottnad kläckning burk (Feed Reservoir, FR) för lagring av alger foderblandning (AFM); en lufttillförsel (AS) att lufta CV, FCV och FR; en peristaltisk pump med en doserings timer (PMT) för att styra leverans av alger feed in CV och FCV; och en tandtråd partikelfilter (FPF) som sitter inne i CV.
- Konfiguration
- Höj CV och FCV på ett stativ eller ett bord så att odlingarna kan lätt skördas via ett avlopp passar in i en samling fortsainer (Figur 1). Använd flexibel lufttillförselslangen för att ansluta AS till en längd av stela rörledningen i varje odlingskärl. Se till att slangen är tillräckligt lång för att leverera luft till bottnen av CV eller FCV.
- Använd en liten kapacitet luftledning för att ansluta AS till en längd av stela rörledningen som sträcker sig till botten av FR som innehåller AFM. Installera en ventil i varje luftledning för att reglera luftflödet. Anslut FR till PMT med foderslangen och köra slangen från PMT i ett hål borrat i sidan av CV / FCV, nära toppen. Figur 1.
- Börja
- Fyll odlingskärlet till 90% av den tillgängliga volymen med omvänd osmos vatten (RO). Om RO är inte tillgänglig, använd rena, avklorerat kommunalt vatten; dock bör ett biosäkerhet riskbedömning utföras för att säkerställa att inga potentiellt patogena organismer är närvarande i källan vatten. OBS: En sådan analys kan utförasav någon kvalificerad vattenprovningslaboratorium.
- Dos odlingskärlet vatten med akvarium salt för att nå en salthalt av 15 g / I. Ställ in luftflödet in i kärlet, så att det upprätthåller en "rullande koka", och sedan långsamt till den uppmätta mängden av salt till odlingskärlet, tills den är helt upplöst av luftningen. Fortsätt lufta vatten> 1 timme för att säkerställa att det är helt syresatt.
- Gör algerna foderblandningen. Till 3 liter ren, avklorerat färska (0 ppm) vatten och tillsätt 100 g NaHCO 3 och 100 g ammoniak neutraliserande (natrium hydroxymethylsulfonate). Denna sista reagens ger den ytterligare fördelen att neutralisera eventuell återstående klor från kranvatten eller blekmedelsrester från sanitizing odlingsutrustning. Det är avgörande för att säkerställa att dessa föreningar är fullständigt upplöst. Tillsätt sedan en L av alger koncentrat (biomassa torrvikt ~ 15%). Lägg matarblandningen till FR och förvara vid 4 ° C.
- Lägg en startkultur av fem - tio miljoner
- Slå på PMT och börja pumpa algerna foder i rotifer odlingskärlet. Användning av timer särdrag hos PMT, ställer avgivningshastigheten för alger tillförselblandningen så att ~ 1,6 ml alger matarblandning avges per miljon hjuldjur i kulturen, per dag. Fördela matning i små portioner med regelbundna intervall under loppet av en 24 h period; den mer frekventa matning, desto bättre.
- Kalibrera leveranshastigheten hos pumpen genom att manuellt slå på PMT under en fastställd period (t.ex. en minut) och samla upp alger som det pumpar under detta intervall i en graderad cylinder eller bägare. Till exempel, om PMT doserna 5 ml av alger i en min, därefter dosraten skulle vara5 ml alger / min.
- Beräkna dagligen krävs matningshastighet genom att multiplicera antalet hjuldjur närvarande, i miljoner, med 1,6 ml. Till exempel skulle en rotifer kultur med en befolkningsmängd på 100 miljoner hjuldjur kräver ~ 160 ml av foder per dag (100 x 1,6 ml).
- Ställ PMT att dosera den totala dagliga behovet matning med jämna mellanrum under en 24 timmarsperiod. Exempelvis skulle leveransen av en total daglig matning av 160 ml levereras i portioner en gång varje 3 timmar under en 24 h period med användning av en PMT-apparat med en doseringspump hastighet av 5 ml / min under 4 minuter, 8 gånger dagligen (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 utfodringar = 160 ml).
- Låt kulturen växa tills den genererar den erforderliga befolkningen, typiskt för 48-72 timmar före skörd. Vid 24 timmar efter start, tillsätt tandtråd partikelfilter till odlingskärlet och börja normalt underhåll.
- Underhåll
OBS: Kulturen fungerar på en kontinuerlig basis och kräver Routine underhåll som helst ska utföras vid samma tid varje dag, i följande ordning.- Fyll FCV till 90% av tillgänglig volym med rent, avklorerat färskvatten, doserad med 10 g / L akvarium alter. Se till att vattnet är väl blandat, och att alla av saltet är helt upplöst. Ställ in luftflödet in i kärlet, så att det upprätthåller en "rullande koka". Mät salthalten med en refraktometer och se till att salthalten är 10 g / L. Det är kritiskt att uppfylla detta mål och att inte överskrida den.
- Prov hjuldjur i CV: Se till att kulturen är väl blandat, samla 3 provexemplar av en 2-3 ml vardera med hjälp av en pipett eller autopipettor, från olika delar av kulturen. Kombinera dessa prover i ett rör eller ampull av lämplig storlek (t.ex., 10 ml).
- Överför 1 - 2 ml av det kombinerade provet på en petriskål, så att den kan visualiseras under ett dissektionsmikroskop. Kontrollera kvaliteten av kulturen (simning beteendehjuldjur, närvaro av fristående ägg, förorenande protozoer).
- Immobilisera hjuldjur i den kvarvarande kombinerade provet genom tillsats av 100 pl av 50% Lugols jodlösning till provet. Inom några sekunder efter tillsats av Lugols, observera rotatorierna att sluta simma. Nu, enkelt räkna hjuldjuren.
OBS: Etanol, utspädd blekmedel eller vinäger kan användas i stället för Lugols. Vinäger (2 droppar / 10 ml) har fördelarna av att vara icke-farligt, inte förlora styrka i lagring blekmedel och jodlösningar kan, och inte göra hjuldjur kontraktet, så korona av cilier och "fot" förblir utvidgas och Djuren ser mer naturligt. - Se till att provet är väl blandat (immobiliserade hjuldjur kommer att bosätta sig snabbt), sedan snabbt ta en ~ 2 ml delprov i en plastpipett och avstå en ml i en Sedgewick-Rafter räknar slide (20 x 50 1 mm kvadrater) (Figur 2 ). Med hjälp av en dissekera eller förening mikroskop, räkna intakta rotatorier och totalt antal ägg knutna till dessa hjuldjur (fig 2). Räkna så mycket av bildområdet som nödvändigt att räkna ~ 100 hjuldjur. Beräkna antalet hjuldjur per ml, och spela in det i ett kalkylblad eller loggbok.
- Harvest ~ 30% av volymen av rotatorierna i CV: Ta bort lufttillförseln och tandtråd filter, långsamt öppna ventilen i botten av CV och låta vattnet rinna in i ett plankton samlare med en 53 um mesh sikt. Samla upp vattnet som strömmar ut från botten på uppsamlaren efter filtrering i en hink eller avlopp. Använd en mild till måttlig flöde för att undvika skador på rotatorierna. Låt inte rotatorierna torka på skärmen.
- För konsekvensens skull är det lämpligt att fastställa FCV med en standard antal hjuldjur varje dag. Därför, baserat på den kända CV rotifer täthet och skörd volym, justera FCV totala volymen för att uppnå en konsekvent slutlig densitet (t ex., 1500 hjuldjur / ml). Lägg den skördade rotitransfereringar till FCV: överföra försiktigt hjuldjur från samlingen skärmen med hjälp av en tvättflaska fylld med rent saltvatten (10-15 g / L). Vänd skärmen över FCV och tvätta hjuldjur i FCV med en svag ström av saltvatten. Starta PMT att leverera foder (~ 1,57 ml per miljon hjuldjur per dag) till FCV.
- Skrubba hela insidan av CV med en ren, mjuk nylonborste eller skurdyna.
- Gör en ny blandning av 15 g / liter vatten genom tillsats av den lämpliga mängden av salt till en uppmätt mängd av ren RO-vatten i en 5 liters hink för att ersätta den volym av vattenförlusten för att skörda. Tillsätt salt i vattnet i hinken och rör om kraftigt tills den är helt upplöst, och lägg sedan till CV.
- Med hjälp av en högtrycksspruta i ett handfat, skölja tandtråd filtret tills det är fritt från skräp, och sedan tillbaka till CV.
- Justera matningshastigheter av alger som levereras till CV genom att ändra varaktigheten för varje doserings händelse, enligt den dagliga räkningen av hjuldjur / ml.Använd de beräkningar som avses i steg 1.3.8, ovan att bestämma lämplig mängd foder som skall levereras.
- Ungefär 24 timmar senare, upprepa processen. Börja genom att skörda rotatorierna kvar i FCV (som inte behövdes för den föregående dagen) på samma sätt som beskrivits ovan (steg 1.4.2 - 1.4.10). Koncentrera dem i 2 liter färskt, rent avklorerat vatten (5 g / L salt). Dessa kan lagras vid 4 ° C som en backup leverans, eller användas för att mata senare stadier av fisk, utöver vad som beskrivs i detta protokoll.
OBS: Detta protokoll tillåter upp till 2 - 3 dagar med reducerad kultur underhåll (med normal automatisk matning), eftersom hjuldjuren i CV kan tolerera utelämnandet av skördar utan allvarliga konsekvenser.
2. polyculture
- Inrätta
- Samla zebrafisk embryon från en lek händelse genom att hälla spawned embryon genom en te-sil och sedan försiktigt skölja med sterila fish vatten (eller någon annan icke-förorenad källa lämpligt rade lösning, till exempel, embryo medium, E3, etc.) från en tvättflaska i petriskålar.
- Inkubera embryon vid 25 - 28 ° C i petriskålar med en täthet av 40 - 50 embryon per skål i 5 dagar.
- Börja polyculture fasen på dag 5 efter befruktning, eller när mer än 90% av den kläckta larverna aktivt simmar upp i vattenmassan.
- Ympning
- 500 ml rotifer kultur direkt från FCV till 3,5 L plantskola tank; inkludering av hjuldjur odlingsvatten ger algfoder som bibehåller näringsinnehållet i hjuldjuren under blandodling.
- Häll försiktigt larverna från en petriskål i barnkammaren tanken. Se till att inga larver kvar i skålen.
- 500 ml ren, kondition fisk vatten från en cirkulationssystemet eller dedikerad vattenkälla till tanken att nå en slutlig volym på 1 liter och en slutlig salinity av 5 g / I.
OBS: Denna salthalt är avgörande eftersom zebrafisk larver överlevnad kommer att påverkas negativt om salthalten är> 7 g / L och rotifer överlevnad kommer att påverkas negativt om salthalt <2 g / L.
- Polyculture fas
OBS: polyculture Fasen ska pågå i upp till fyra dagar efter ympning (totalt 5 dagar, motsvarande dagar 5-9 efter befruktning).- Observera polyculture tanken minst en gång per dag under denna period för att se till att hjuldjur och fisk är närvarande och växer. Se till att hjuldjuren är synliga i hela vattenmassan. Se till att de fishs är också synliga i vattnet, simma bland rotatorierna.
- Starta normal vattenflödet genom tanken. Placera en skärm eller baffel över dräneringsöppningen för att säkerställa att larver inte spolas ut ur tanken.
OBS: I slutet av denna fas, kommer fisken att vara tillräckligt stor för att konsumera större byten såsom Artemianauplii eller bearbetat foder poster i storleksintervallet 75-125 pm.
OBS! Rotifer populationsdynamik inom en representativ polyculture tank mättes genom provtagning / räkna hjuldjur från tanken på samma sätt som beskrivs i steg 1.4.2 - 1.4.5. Detta gjordes en gång per dag från början av blandodling fasen tills den var färdig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kontinuerliga rotifer odlingssystemet som beskrivs här är dynamisk, och det är normalt för hjuldjur nummer att fluktuera i liten utsträckning över tiden om det finns variationer i dagliga utfodring och skörd priser. Befolkningen i de rotatorierna i en av de aktiva kulturer i vattenbruksanläggningar vid Boston Barnsjukhus, upprätthålls på det sätt som beskrivits ovan, följdes i 30 dagar (Figur 3). Den genomsnittliga kulturtätheten under denna period var 932 hjuldjur / ml, med högst 1,330 hjuldjur / ml och minst 510 hjuldjur / ml. Detta representerar den typiska prestanda för en hjuldjur kultur upprätthålls i enlighet med detta protokoll.
Dynamiken i hjuldjur befolkningen i ett blandodlingssystem tank med zebrafisk visas i figur 4. En 3,5 L akvarium ympades med 500 ml rotifer kultur från FCV, 500 ml steriliserat fish vatten och 40 5 dagar gamla vildtyp (Tübingen stam) larver, för att visa hur hjuldjur och zebrafisk utför i en typisk polyculture tank. Den hjuldjur befolkningen i blandodlingssystem tanken nådde en topp på den andra dagen med en densitet av 747 hjuldjur / ml (Figur 4). Densiteten av rotatorierna i polyculture tanken minskade under 5 dagars polyculture period till minst 481 hjuldjur / ml på dag 5. dock i genomsnitt rotifer densitet under hela perioden var 589.4 hjuldjur / ml, och det lägsta värdet av 481 hjuldjur / ml är ~ 10 gånger större än den rotifer tätheten i slutet av polyculture period tidigare publicerade arbeten 12.
Zebrafisk tillväxt under fem dagar visas i figur 5. Fisken visade stadig tillväxt varje dag, från en genomsnittlig total längd av 3,904 mm ± 0,063 SEM när de sattes till polyculture tanken till en genomsnittlig total längd på 5,423 ± 0,063 SEM påden sista dagen av polyculture fasen. Överlevnad var 95% (38/40).
Vatten kvalitetsparametrar mättes dagligen i den representativa polyculture tanken, och visas i tabell 1. Värdena för dessa parametrar liknar tidigare publicerade arbeten 12, och representerar förhållanden som främjar tillväxt och överlevnad både rotatorierna och fisk under den period då den blandodling 5 dag.
| Dag | Dag | Salthalt | SOLBRÄNNA | NR 2 | NR 3 | pH | Alkalinitet | Hårdhet | Temperatur |
| (Faktisk) | (post-befruktning) | g / L | mg / l | mg / l | mg / l | mg / l (CaCO 3) | mg / l (CaCO 3) | ° Celsius </ td> | |
| måndag | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8,4 | 120 | 425 | 23,2 |
| tisdag | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8,4 | 180 | 425 | 23,3 |
| onsdag | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8,3 | 240 | 425 | 22,3 |
| torsdag | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8,4 | 240 | 425 | 22,8 |
| fredag | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7,9 | 240 | 425 | 22,2 |
Tabell 1. parametrar för vattenkvalitet ina Representativa Zebrafisk polyculture tank.
Figur 1. Rotifer Kultur Setup Legend. Odlingskärl (CV), utportioneringsrörelse odlingskärl (FCV), Air Supply (AS), Floss partikelfilter (FPF), Alger Feed Blandning (AFM), Feed Reservoir (FR), Programmerbar Mätning Timer (PMT). Heldragna linjer representerar alger foderleverans. Streckade linjer representerar lufttillförsel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fyllning av en Sedgewick-Rafter Räkna Slide. Klicka här för att se enstörre version av denna figur.
. Figur 3. rotifer populationsdynamik i kultur under en 30-dagarsperiod Legend: Antalet räknade hjuldjur (honor + ägg) per ml är på x-axeln. Antalet dagar i kultur är på y-axeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. rotifer populationsdynamik under en 5 dagars polyculture Förklaring:. Antalet räknade hjuldjur (honor + ägg) per ml är på x-axeln. Antalet dagar i blandodling ligger på y-axeln. Klicka här för att view en större version av denna figur.
. Figur 5. Zebrafish Tillväxten under en 5 dagars polyculture Förklaring: Värdena är genomsnittliga totala längd i mm; felstaplarna representerar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett framgångsrikt genomförande av hjuldjur polyculture metoden för att mata tidigt larver zebrafisk kräver effektiva protokoll för två uppgifter: att inrätta och upprätthålla en kontinuerlig rotifer kultursystem för att mata fiskarna och odling första utfodring zebrafisk larver tillsammans med hjuldjur i samma tank.
Inställningarna för en kontinuerlig saltvatten rotifer produktionssystem för zebrafisk laboratorier först beskrivits av Lawrence och medförfattare 14 har ändrats och förbättrats i ett antal olika sätt att göra det både mer robust och universell tillämpning. Det nya protokollet innehåller förbättringar både i utrustning och metoder.
Systemet för algerna foderblandningen lagring sysselsätter nu kläckning burkar som används i havskatt produktionssystem 15. Lagring av fodret i dessa rundbottnade burkar underlättar noggrann blandning av algerna foder så att den inte skikta eller klumpar och leda till täppaging av tryckrören, ett problem som ofta plågat det ursprungliga protokollet. På samma sätt användningen av en allt-i-en programmerbar timer / doseringspump minskar det totala antalet komponenter, och förenklar doserad leverans av foder till rotatorierna. Det tillåter också doseringen av foder till rotatorierna på timbasis under 24-timmarsperiod, som är att föredra framför färre, större matning eftersom fodret assimileras mer effektivt.
En metod för att räkna hjuldjur som tillåter finjustering av foder leverans till hjuldjur kulturen har tagits med i detta protokoll. Feeding the rotatorierna baseras på en noggrann, realtid bedömning av deras befolkningsstorlek garanterar jämn, produktion av hög nivå. En sekundär utportioneringsrörelse odlingskärl har också lagts till protokollet. En kontinuerlig odlingssystem kan producera en daglig överskott av tiotals miljoner hjuldjur utöver vad som krävs för ännu en stor plantskola operation på grund av variationer i plantskola aktivitet. Denna utportioneringsrörelse Culture Vessel används för att hålla hjuldjur för daglig ympning av polycultures, och de återstående hjuldjur kan ges som en högkvalitativ näringstillskott till senare larver och tidiga ungdoms stadier av fisk. Den reducerade salthalten (10 g / L) i FCV även pre-acclimates rotatorierna till villkoren i polyculture tankar, så att de upprätthåller kraftfull simning aktivitet när de överförs.
Viktigt är att dessa ändringar av hjuldjur odling protokoll bly direkta förbättringar i polyculture tillvägagångssätt, särskilt när det gäller arbetsinsatsen. Den tidigare metoden publiceras av bästa och medförfattare inblandade inte bara en inledande ympning av hjuldjur på dag 5, men också dagliga tillägg av hjuldjur tills den statiska polyculture fasen avslutades den dag 9 12. Genomsnittlig hjuldjur densiteter under denna period nådde en topp på 333 rotiferer / ml på dagen för ympning och slutade under 50 hjuldjur / ml vid slutet av polyculture fasen dag 9 12. I motsatsUpprätthåller det nuvarande protokollet mycket högre densiteter hela typiskt börjar vid ~ 665 hjuldjur / ml, och slutar med ~ 481 hjuldjur / ml dag 9.
Det finns två faktorer som gör det möjligt dessa mycket högre hjuldjur täthet. 1) Den totala robusthet hjuldjur kulturen används för ympning är mycket större. Vidare den reviderade steget att inokulera blandodling med lika stora volymer av alger / hjuldjur vid 10 g / I salthalt och ~ 0 g / L salthalt fisk vatten, resulterar i en mellanliggande salthalt 5 g / I som bibehålls under hela blandodling. Börjar med en större total volym vatten (1 liter) är också mer gynnsam för rotifer tillväxt och överlevnad i polyculture tankarna. I den tidigare publicerade metoden, lägre start rotifer tätheten i en mindre volym nödvändig dagliga tillsatser av hjuldjur för att fylla förluster genom nötning (förmodligen på grund av dålig vattenkvalitet) och konsumtion genom att utveckla fiskyngel. Resultaten av dessa justeringar av protokoll Dramatmatiskt minska arbets ingångar (en matning över 4 dagar jämfört med 4 matning i 4 dagar med den tidigare metoden). Larv tillväxt och överlevnad prestanda över den initiala 5 dagars polyculture perioden är jämförbar med den som tidigare 12 publicerade.
Produktiviteten av hjuldjur kulturer nödvändigtvis begränsas av matningsingång. Hjuldjur densiteter av 2.000 - 3000 / ml kan uppnås med dessa metoder helt enkelt genom att öka matnings leverans. När rotifer avkastning per enhet foder är känd, kan matningshastigheten justeras för att passa rotifer produktionen till beräknade behov. Under helger och helgdagar, kan utfodring minskas och skördar utelämnade för en dag eller två utan att skada rotatorierna, även om deras produktionspotential kommer att bli suboptimal tills normala dagliga utfodring och skörda rutin återupptas.
När det finns en oväntad behov av fler hjuldjur än vanligt, kan en större del av befolkningen skördas utan att skada culTure, men beroende på storleken på skörden kulturen kan kräva en dag eller mer för att återfå sin normala densitet. Om efterfrågan hjuldjur kommer att minska mer än en dag eller två, produktionen bäst minskas genom att minska matnings leverans, snarare än att minska skörden. En skörd av minst 25% / dag har en yngre rotifer åldersprofil så att hjuldjuren är mer kraftfull och frukt, förbättra sina resultat i polyculture tankarna.
Detta protokoll är lätt anpassas till mindre skalor för mindre zebrafisk anläggningar. Till exempel kan en 15 L kultur, som lämpligen kan inrättas i en standard 5 US gallon (20 liter) hink med hand-mata två gånger per dag, med lätthet kan uppnå en densitet av 1.000 hjuldjur / ml. Användning av en matarpump möjliggör densiteter av 2000-3000 / ml. En enda hink skördades vid 30% / dag kan därför ge 5-15 miljoner hjuldjur / dag, tillräckligt för att starta 10 - 30 polycultures. Två hinkar kan användas i samma CV + FCV protokoll som beskrivs enBove. En alger + ammoniak controller + pH-buffert förblandning foder är tillgänglig (se tabell av specifika reagens / utrustning) som är lämpligt för småskalig användning. Den har tillräcklig viskositet att de alger cellerna inte sedimentera snabbt och så att den inte kräver kontinuerlig blandning i matningsbehållaren.
Om hjuldjur kultur produktivitet minskar, eller en ovanlig anhopning av döda hjuldjur återfinns i odlingen, alla vatten kvalitetsparametrar (temperatur, salthalt, pH, NH3 koncentration) bör kontrolleras. Brachionus plicatilis bär normalt sina ägg tills de kläcks, och förekomsten av många obundna ägg (som vanligtvis inte kläcks) i kulturen är ett tecken på stress, oftast på grund av ackumulerad ammoniak.
Om hjuldjur odlingsvatten är en mer intensiv grön än vanligt, då antingen matningen är för hög eller hjuldjur är inte konsumerar mat på sin vanliga takt. Vanligtvis är caanvändas av antingen en stressfaktor, eller kulturen har overharvested utan att justera matningshastigheten i enlighet med den reducerade populationen. I täta kulturer är det normalt att en brunfärgning att ackumuleras i vattnet som alger pigment metaboliseras av rotatorierna.
Användningen av saltvatten hjuldjur under första matningsfasen har fått stor spridning över zebrafisk forskarsamhället eftersom förfarandet publicerades första gången 2010 12. De ändringar som gjorts i polyculture uppfödningsmetod som beskrivs i detta protokoll kommer att möjliggöra ett ännu större antal laboratorier för att anta detta synsätt, oavsett skala. Dessa framsteg är tid; utvecklingen gen knockout-teknik (t ex., crispr, Talens, etc.) för zebrafisk kommer att kräva enhetliga och effektiva uppfödnings protokoll för att odla tusentals nya stammar av genetiskt modifierad fisk för användning i olika vetenskapsområden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
EG Henry är anställd av Reed Mariculture, Inc., ett företag som tillhandahåller rotiferer, alger koncentrat och andra förnödenheter till vattenbruk och fisk hobby marknaderna.
Acknowledgments
Vården och användning av fisk som genereras för representativa resultat som beskrivs i detta protokoll utfördes i full överensstämmelse med de riktlinjer som anges av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Boston Barnsjukhus, protokoll # 14-05-2673R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
- Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , CRC Press. (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
- Biology and Culture of Channel Catfish. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. 34, 634-657 (2004).
