Introduction
الزرد (دانيو rerio) هو حيوان مختبر البارز تستخدم في عدد متزايد من التخصصات العلمية، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على الوراثة التنموية، وعلم السموم، والسلوك وتربية الأحياء المائية، البيولوجيا التجديدي، ونمذجة العديد من الاضطرابات الإنسان 1-5. على الرغم من أن الأنواع من السهل نسبيا للحفاظ في المختبر، وهناك عدد من التحديات الإدارية المرتبطة ثقافتهم 6. وأبرز هذه هي تربية اليرقات، خاصة عندما الأسماك لأول مرة تبدأ في وقت لاحق لتغذية التضخم المثانة الغاز 7. تحت الظروف العادية، التي تسيطر عليها، وهذا الحدث التنموي يحدث في ~ 5 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية)، مع 3 التالية - 5 أيام من النمو يجري حاسما بشكل خاص 7. الصعوبات الفنية المركزية خلال هذه المرحلة في الاستجابة على نحو كاف لمطالب الغذائية من اليرقات التغذية الأولى - يجب أن البنود تغذية تكون بحجم مناسب، digestible، جذابة، ومتاحة على أساس مستمر تقريبا، دون خلق النفايات المفرطة في خزانات زراعة. تاريخيا قد تحقق هذا عادة من خلال تقديم العديد من كميات صغيرة من الأعلاف للأسماك في صهاريج، جنبا إلى جنب مع روتين 8،9 صرف المياه. في حين أن هذه الأساليب هي إلى حد ناجحة، فهي غير فعالة، تتطلب مدخلات العمل عالية، والعودة المتغير الوحيد ومعدلات محدودة للنمو والبقاء على قيد الحياة 10.
في الطبيعة، اليرقات الزرد إطعام يفترض على وفرة صغيرة الحاضر العوالق الحيوانية في عمود الماء 11. لهذا السبب، بروتوكولات تربية اليرقات التي تتضمن لقطات حية مثل المتناعلة، الدوارات، والأرتيميا وعادة ما تكون الأكثر فعالية 7. في عام 2010، أظهر أفضل والمشاركين فيها أنه كان من الممكن أن تنمو اليرقات الزرد في ثابت، والمياه المالحة مع المياه المالحة الدوارات لمدة 5 أيام الأولى من التغذية الخارجية (12). هذا النهج الذي تسخيروفاق إنتاجية عالية الطبيعية الثقافات حيدة الخلية والروتيفر لتوفير وافرة، فريسة ذات قيمة غذائية عالية دون تلويث المياه، والمحاصيل معدلات عالية جدا من نمو اليرقات والبقاء على قيد الحياة مع مدخلات العمل منخفضة 12،13. في السنوات الأخيرة، تبنت عددا متزايدا من المختبرات حول العالم أشكال مختلفة من هذا البروتوكول، والعديد من زراعة الآن الدوارات بطريقة مستمرة لدعم نظم الحضانة 14.
على مدى السنوات القليلة الماضية، تم تنقيح طرق لكلا حيدة الخلية والروتيفر / متعدد الأنواع الزرد والإنتاج حيدة الخلية والروتيفر وتحسينها لتصبح أكثر توحيدا وقابلة بسهولة. توفر هذه المقالة خطوة بخطوة تعليمات ل1) إنتاج حيدة الخلية والروتيفر المستمر والقوي و2) إنشاء حيدة الخلية والروتيفر / الزرد نظام متعدد الأنواع المستخدمة لدعم النمو القوي من الأسماك لمدة 5 أيام الأولى من التغذية الخارجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. حيدة الخلية والروتيفر الثقافة
- المكونات الأساسية لنظام الثقافة باستخدام سفينة 100 L الثقافة
- جمع كل المكونات لإعداد ثقافة حيدة الخلية والروتيفر. يتكون الإعداد الثقافة حيدة الخلية والروتيفر سفينة الثقافة (CV) لزراعة الدوارات. سفينة مشابهة للحفاظ على الدوارات feedout (سفينة الثقافة feedout، FCV)؛ جرة ذهابا والقاع الفقس (تغذية الخزان، FR) لتخزين الخليط تغذية الطحالب (AFM)؛ إمدادات الهواء (AS) لتهوية CV، FCV وFR؛ مضخة تحوي جهاز توقيت القياس (PMT) للسيطرة على تسليم تغذية الطحالب في السيرة الذاتية وFCV. ومرشح خيط الجسيمات (الاتحاد البرتغالي) أن يجلس داخل السيرة الذاتية.
وهناك قائمة كاملة من اللوازم والمكونات في قائمة المواد: ملاحظة.
- جمع كل المكونات لإعداد ثقافة حيدة الخلية والروتيفر. يتكون الإعداد الثقافة حيدة الخلية والروتيفر سفينة الثقافة (CV) لزراعة الدوارات. سفينة مشابهة للحفاظ على الدوارات feedout (سفينة الثقافة feedout، FCV)؛ جرة ذهابا والقاع الفقس (تغذية الخزان، FR) لتخزين الخليط تغذية الطحالب (AFM)؛ إمدادات الهواء (AS) لتهوية CV، FCV وFR؛ مضخة تحوي جهاز توقيت القياس (PMT) للسيطرة على تسليم تغذية الطحالب في السيرة الذاتية وFCV. ومرشح خيط الجسيمات (الاتحاد البرتغالي) أن يجلس داخل السيرة الذاتية.
- ترتيب
- رفع السيرة الذاتية وFCV على الوقوف أو الجدول بحيث الثقافات يمكن حصادها بسهولة عن طريق استنزاف المناسب إلى جمع تابعainer (الشكل 1). استخدام مرنة أنابيب العرض الجوي لتوصيل AS على طول الأنبوب جامدة في كل سفينة الثقافة. تأكد من أن أنابيب طويلة بما فيه الكفاية لإيصال الهواء إلى أسفل CV أو FCV.
- استخدام خط الهواء ذات السعة الصغيرة لتوصيل AS على طول الأنبوب جامدة الذي يمتد إلى أسفل FR الذي يحتوي على AFM. تثبيت صمام في كل سطر الهواء لتنظيم تدفق الهواء. ربط FR إلى PMT مع تسليم تغذية الأنابيب، وتشغيل أنابيب من PMT في حفرة حفرها إلى جانب CV / FCV، بالقرب من أعلى الشكل 1.
- أبدء
- ملء وعاء الثقافة إلى 90٪ من حجم المتاحة مع التناضح العكسي المياه (RO). إذا RO غير متوفر، واستخدام المياه البلدية النظيفة، وإزالة الكلور. ومع ذلك، ينبغي إجراء تقييم للمخاطر الأمن الحيوي لضمان عدم الكائنات الحية المسببة للأمراض قد تكون موجودة في المياه مصدر. ملاحظة: يمكن إجراء مثل هذا التحليلمن قبل أي مختبر المياه المؤهلين.
- جرعة الثقافة السفينة المياه مع الملح الحوض للوصول إلى الملوحة من 15 غرام / L. ضبط تدفق الهواء في الإناء بحيث تحافظ على "الغليان"، وبعد ذلك ببطء إضافة يقاس مقدار الملح في وعاء الثقافة حتى يذوب تماما من قبل التهوية. تواصل تهوية الماء ل> 1 ساعة للتأكد من الاوكسيجين بشكل كامل.
- جعل الخليط تغذية الطحالب. 3 L نظيفة، إزالة الكلور النقي (0 جزء في المليون) المياه إضافة 100 غرام من NaHCO 3 و 100 غرام من الأمونيا التعادل (hydroxymethylsulfonate الصوديوم). يوفر هذا كاشف الماضي فائدة إضافية تتمثل في القضاء على أي الكلور المتبقي من ماء الصنبور أو التبييض بقايا من تعقيم المعدات الثقافة. فمن الأهمية بمكان لضمان أن هذه المركبات يتم حله بشكل كامل. ثم يضاف 1 لتر من التركيز الطحالب (الكتلة الحيوية الوزن الجاف ~ 15٪). يضاف خليط العلف إلى FR وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إضافة الثقافة بداية من 5-10٬000٬000
- بدوره على PMT والبدء في ضخ تغذية الطحالب في سفينة الثقافة حيدة الخلية والروتيفر. باستخدام ميزة الموقت للPMT، تعيين معدل الولادة من خليط العلف الطحالب بحيث ~ 1.6 مل من الطحالب خليط العلف يتم تسليمها لكل مليون الدوارات في الثقافة، في اليوم الواحد. توزيع الوجبات في أجزاء صغيرة على فترات منتظمة على مدى فترة 24 ساعة. وأكثر تواترا الرضاعة، كلما كان ذلك أفضل.
- معايرة معدل تسليم المضخة عن طريق تحويل يدويا على PMT لفترة محددة (على سبيل المثال، 1 دقيقة) وجمع الطحالب أنه يضخ خلال هذه الفترة إلى الاسطوانة أو الكأس. على سبيل المثال، إذا كان جرعات PMT 5 مل من الطحالب في 1 دقيقة، ثم معدل الجرعة ستكون5 مل الطحالب / دقيقة.
- حساب معدل التغذية اليومي المطلوبة بضرب عدد من الدوارات الحالية، في الملايين، بنسبة 1.6 مل. على سبيل المثال، فإن ثقافة حيدة الخلية والروتيفر مع حجم السكان من 100 مليون الدوارات تتطلب ~ 160 مل من العلف يوميا (100 × 1.6 مل).
- تعيين PMT إلى إعطاء جرعات من مجموع الاحتياجات العلف اليومي على فترات منتظمة طوال فترة 24 ساعة. على سبيل المثال، يمكن أن يتم تسليمها الولادة من إجمالي كمية العلف اليومي من 160 مل في أجزاء مرة واحدة كل ساعة 3 خلال فترة 24 ساعة باستخدام مجموعة PMT مع معدل ضخ جرعات من 5 مل / دقيقة لمدة 4 دقائق، 8 مرات يوميا (5 مل / دقيقة × 4 دقيقة = 20 مل × 8 = 160 مل الرضاعة).
- السماح للثقافة أن تنمو حتى يولد السكان المطلوب، وعادة 48-72 ساعة، قبل الحصاد. في 24 ساعة بعد بدء، إضافة مرشحات الجسيمات الخيط إلى سفينة الثقافة والبدء الصيانة العادية.
- صيانة
ملاحظة: الثقافة تعمل على أساس مستمر ويتطلب routinالصيانة الإلكترونية التي ينبغي من الناحية المثالية أن يؤديها في نفس الوقت كل يوم، في التسلسل التالي.- ملء FCV إلى 90٪ من حجم المتاحة مع نظيفة، إزالة الكلور المياه العذبة، مداوي مع 10 جم / لتر أملاح الحوض. تأكد من أن الماء هو تمتزج جيدا، وأن كل من الملح يذوب تماما. ضبط تدفق الهواء في الإناء بحيث تحافظ على "الغليان". قياس الملوحة مع الإنكسار والتأكد من أن الملوحة 10 غرام / L. فمن الأهمية بمكان لتحقيق هذا الهدف ولا تزيد على ذلك.
- أخذ عينات من الدوارات في السيرة الذاتية: تأكد من أن الثقافة هي جيدة الامتزاج، ثم جمع 3 عينات من 2-3 مل لكل منهما باستخدام ماصة نقل أو autopipettor، من مناطق مختلفة من الثقافة. الجمع بين هذه العينات في أنبوب أو قارورة من حجم مناسب (على سبيل المثال، 10 مل).
- نقل 1-2 مل من العينة مجتمعة على طبق بتري بحيث يمكن تصور تحت المجهر تشريح. تحقق من جودة الثقافة (السباحة سلوكالدوارات، وجود البيض منفصلة، وتلويث البروتوزوا).
- لشل حركة الدوارات في العينة مجتمعة المتبقية عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 50٪ Lugols محلول اليود إلى العينة. في غضون ثوان بعد إضافة Lugols، ومراقبة الدوارات لوقف السباحة. الآن، عد بسهولة الدوارات.
ملاحظة: الإيثانول ومواد التبييض المخفف، أو الخل يمكن استخدامها في مكان Lugols. الخل (2 قطرات / 10 مل) لديها مزايا كونه غير خطرة، لا تفقد قوتها في التخزين كما التبييض واليود حلول يمكن، وعدم جعل العقد الدوارات، لذلك تبقى الهالة من أهداب و "القدم" الموسعة و الحيوانات تبدو أكثر طبيعية. - تأكد من أن العينة المختلطة جيدا (والدوارات يجمد يستقر بسرعة)، ثم سرعان ما أخذ مل عينة فرعية ~ 2 في الماصة البلاستيكية والاستغناء 1 مل في شريحة العد سيدجويك-رافتر (20 × 50 1 ملم الساحات) (الشكل 2 ). باستخدام تشريح أو مركب المجهر، والاعتماد على الدوارات سليمة ورعدد املجموع البيض تعلق على هذه الدوارات (الشكل 2). عد أكبر قدر من ناحية الشريحة عند الضرورة إلى الاعتماد ~ 100 الدوارات. حساب عدد من الدوارات لكل مل، وسجل ذلك في جدول بيانات أو دفتر.
- الحصاد ~ 30٪ من حجم الدوارات في السيرة الذاتية: إزالة العرض الجوي وتصفية الخيط، فتح الصمام ببطء في الجزء السفلي من السيرة الذاتية، والسماح لتدفق المياه إلى أحد هواة جمع العوالق مع شاشة شبكة 53 ميكرون. جمع المياه المتدفقة من الجزء السفلي من جامع بعد تصفية في دلو أو نزيف. استخدام لطيف لتدفق معتدلة لتجنب إتلاف الدوارات. لا تسمح الدوارات حتى يجف على الشاشة.
- لأسباب الثبات، فإنه من المستحسن أن إنشاء FCV مع عدد قياسي من الدوارات كل يوم. لذلك، بناء على CV الكثافة حيدة الخلية والروتيفر والحصاد حجم المعروفة، وضبط حجم إجمالي FCV لتحقيق الكثافة النهائية متناسقة (على سبيل المثال، 1500 الدوارات / مل). إضافة روتي تحصدFERS إلى FCV: بلطف نقل الدوارات من الشاشة جمع باستخدام زجاجة غسل مملوء بالماء والملح نظيفة (10-15 جم / لتر). عكس الشاشة على FCV وغسل الدوارات في FCV مع تيار لطيف من المياه المالحة. بدء PMT لتقديم الأعلاف (~ 1.57 مل لكل مليون الدوارات في اليوم) إلى FCV.
- فرك داخل كامل من السيرة الذاتية مع نظيفة، لينة فرشاة النايلون أو وسادة فرك.
- جعل مزيج جديد من 15 جم / لتر ماء عن طريق إضافة كمية مناسبة من الملح لقياس كمية المياه RO نظيفة في دلو 5 غالون ليحل محل حجم المياه المفقودة لموسم الحصاد. إضافة الملح إلى الماء في دلو ويحرك بقوة حتى يذوب تماما، ثم تضاف إلى السيرة الذاتية.
- استخدام رذاذ الضغط العالي في بالوعة، وشطف تصفية الخيط حتى أنها خالية من الحطام، ومن ثم إعادته إلى السيرة الذاتية.
- ضبط معدلات التغذية من الطحالب تسليمها إلى السيرة الذاتية عن طريق تغيير مدة كل حدث الجرعات، وفقا لتعداد اليومي من الدوارات / مل.استخدام العمليات الحسابية المقدمة في خطوة 1.3.8، أعلاه لتحديد كمية مناسبة من العلف ليتم تسليمها.
- وبعد نحو 24 ساعة، وتكرار هذه العملية. تبدأ من خلال حصاد الدوارات المتبقية في FCV (أنه لا توجد حاجة لليوم السابق) بنفس الطريقة كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1.4.2 - 1.4.10). التركيز عليها في 2 لتر من المياه العذبة، نظيفة إزالة الكلور (5 ز / L الملح). ويمكن تخزينها في 4 ° C باعتبارها إمدادات النسخ الاحتياطي، أو تستخدم لتغذية مراحل لاحقة من الأسماك، وراء ما يوصف في هذا البروتوكول.
ملاحظة: هذا البروتوكول يسمح ما يصل إلى 2-3 أيام من خفض صيانة الثقافة (مع التغذية التلقائية العادية)، وذلك لأن الدوارات في السيرة الذاتية يمكن أن يتسامح مع إغفال المحاصيل دون عواقب وخيمة.
2. الاستزراع متعدد الأنواع
- التثبيت
- جمع الأجنة الزرد عن حدث التبويض عن طريق سكب أجنة ولدت من خلال الشاي مصفاة ثم الشطف بلطف مع الجبهة الاسلامية للانقاذ معقمةح الماء (أو أي مصدر آخر غير الملوثة من حل مكيفة بشكل مناسب، على سبيل المثال، المتوسط الجنين، E3، وما إلى ذلك) من زجاجة غسل في أطباق بتري.
- احتضان الأجنة في 25-28 درجة مئوية في أطباق بتري في مناطق ذات كثافة من 40-50 الأجنة في طبق لمدة 5 أيام.
- تبدأ المرحلة متعدد الأنواع في يوم 5 بعد الإخصاب، أو عندما يزيد عن 90٪ من اليرقات والسباحة بنشاط في عمود الماء.
- تلقيح
- إضافة 500 مل من ثقافة حيدة الخلية والروتيفر مباشرة من FCV إلى خزان الحضانة 3.5 L؛ إدراج المياه ثقافة حيدة الخلية والروتيفر يوفر تغذية الطحالب التي تحافظ على المحتوى الغذائي من خلال الدوارات متعدد الأنواع.
- صب بلطف اليرقات من طبق بتري واحد في خزان الحضانة. ضمان عدم وجود اليرقات لا تزال في الطبق.
- إضافة 500 مل من المياه النظيفة والأسماك مكيفة من نظام إعادة تدوير أو مصدر للمياه مخصص لخزان للوصول إلى الحجم النهائي من 1 L والصورة النهائيةalinity من 5 ز / L.
ملاحظة: هذه الملوحة أمر بالغ الأهمية لبقاء اليرقات الزرد وسوف تتأثر سلبا إذا الملوحة> 7 ز / L والبقاء على قيد الحياة حيدة الخلية والروتيفر ستتأثر سلبا إذا الملوحة <2 ز / L.
- مرحلة الاستزراع متعدد الأنواع
ملاحظة: يجب أن تستمر المرحلة متعدد الأنواع لمدة تصل إلى 4 أيام بعد التلقيح (أي ما مجموعه 5 أيام، الموافق 5-9 أيام بعد الإخصاب).- مراقبة الخزان متعدد الأنواع مرة واحدة يوميا على الأقل خلال هذه الفترة لضمان الدوارات والأسماك موجودة ومتنامية. تأكد من أن الدوارات واضحة في جميع أنحاء عمود الماء. تأكد من أن لfishs واضحة أيضا في عمود الماء، والسباحة بين الدوارات.
- بدء تدفق المياه الطبيعي عن طريق الخزان. وضع الشاشة أو يربك عبر منفذ استنزاف لضمان أن اليرقات لا يخرجوا من الخزان.
ملاحظة: في نهاية هذه المرحلة، فإن الأسماك تكون كبيرة بما يكفي لاستهلاك المواد فريسة أكبر مثل الأرتيمياتغذية بنود البعد يرقية أو معالجتها في نطاق حجم 75-125 ميكرون.
ملاحظة: تم قياس ديناميات السكان حيدة الخلية والروتيفر في خزان متعدد الأنواع تمثيلي عن طريق اخذ عينات / عد الدوارات من الخزان بنفس الطريقة كما هو موضح في الخطوات 1.4.2 - 1.4.5. وقد تم ذلك مرة واحدة يوميا من بداية مرحلة الاستزراع متعدد الأنواع حتى تم الانتهاء منه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النظام الثقافة حيدة الخلية والروتيفر المستمر الموصوفة هنا هو دينامية، وأنه من الطبيعي لأعداد حيدة الخلية والروتيفر لتتقلب إلى حد صغير مع مرور الوقت إذا كان هناك اختلافات في معدلات التغذية والحصاد اليومي. سكان الدوارات في واحدة من الثقافات العاملة في مرافق تربية الأحياء المائية في مستشفى الأطفال في بوسطن، حافظت على النحو المبين أعلاه، تم رصدها لمدة 30 يوما (الشكل 3). كانت كثافة ثقافة المتوسط خلال هذه الفترة 932 الدوارات / مل، وبحد أقصى 1330 الدوارات / مل والحد الأدنى من 510 الدوارات / مل. ويمثل هذا الأداء النموذجي للثقافة حيدة الخلية والروتيفر المحافظة وفقا لهذا البروتوكول.
وأظهرت ديناميات السكان حيدة الخلية والروتيفر في خزان متعدد الأنواع مع الزرد في الشكل (4) و ذلك بحقن خزان الأسماك 3.5 لتر مع 500 مل من ثقافة حيدة الخلية والروتيفر من FCV، 500 مل من و تعقيمهاالمياه العش، و 40 لمدة 5 أيام البالغ من النوع البري (سلالة توبنجن) اليرقات، لشرح كيفية الدوارات والزرد أداء في خزان متعدد الأنواع نموذجي. بلغ ذروته السكان حيدة الخلية والروتيفر في خزان متعدد الأنواع في اليوم الثاني مع كثافة 747 الدوارات / مل (الشكل 4). انخفضت كثافة الدوارات في خزان متعدد الأنواع خلال الفترة متعدد الأنواع 5 يوم لمدة لا تقل عن 481 الدوارات / مل في اليوم 5. ومع ذلك، كانت كثافة حيدة الخلية والروتيفر يعني طوال فترة 589.4 الدوارات / مل، والحد الأدنى لقيمة 481 الدوارات / مل هو ~ 10 مرات من كثافة حيدة الخلية والروتيفر في نهاية الفترة متعدد الأنواع في الأعمال المنشورة سابقا 12.
وأظهرت نموا الزرد خلال فترة خمسة أيام في الشكل (5). وأظهرت الأسماك نموا مطردا كل يوم، من إجمالي طول متوسط من 3.904 مم ± 0.063 SEM عندما أضيفت إلى خزان متعدد الأنواع إلى إجمالي طول متوسط من 5.423 ± 0.063 SEM علىفي اليوم الأخير من المرحلة متعدد الأنواع. كان البقاء على قيد الحياة 95٪ (38/40).
تم قياس معايير الجودة المياه يوميا في خزان متعدد الأنواع التمثيلي، وتظهر في الجدول 1. القيم من هذه المعايير هي مماثلة لالأعمال المنشورة سابقا 12، وتمثل الظروف التي تساعد على نمو وبقاء كل من الدوارات والأسماك خلال فترة 5 أيام من متعدد الأنواع.
| يوم | يوم | التملح | TAN | NO 2 | NO 3 | درجة الحموضة | القلوية | صلابة | درجة الحرارة |
| (الفعلية) | (ما بعد الإخصاب) | ز / L | ملغ / L | ملغ / L | ملغ / L | ملغم / لتر (كربونات الكالسيوم 3) | ملغم / لتر (كربونات الكالسيوم 3) | ° مئوية </ td> | |
| الإثنين | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| الثلاثاء | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23.3 |
| الأربعاء | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22.3 |
| الخميس | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22.8 |
| الجمعة | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
الجدول 1. معلمات نوعية المياه طالممثل غ الزرد الاستزراع متعدد الأنواع دبابات.
الشكل 1. إعداد حيدة الخلية والروتيفر الثقافة مفتاح: الثقافة سفينة (CV)، Feedout الثقافة سفينة (FCV)، توريد الهواء (AS)، الخيط الجسيمات تصفية (الاتحاد البرتغالي)، الطحالب تغذية خليط (AFM)، تغذيه خزان (FR)، قياس للبرمجة توقيت (PMT). خطوط الصلبة تمثل تسليم تغذية الطحالب. الخطوط المتقطعة تمثل توصيل الهواء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التعبئة من عد الشريحة سيدجويك-رافتر. الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 3. حيدة الخلية والروتيفر ديناميات السكان في الثقافة على مدى فترة 30 يوما المجموعات: عدد الدوارات عدها (إناث + البيض) لكل مل على محور س. عدد الأيام في الثقافة هو على المحور الصادي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. حيدة الخلية والروتيفر الديناميات السكانية خلال الاستزراع متعدد الأنواع يوم 5 مفتاح: عدد الدوارات عدها (إناث + البيض) لكل مل على محور س. عدد الأيام في الاستزراع متعدد الأنواع هو على المحور الصادي. يرجى النقر هنا لالسادسEW نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 5. الزرد النمو خلال الاستزراع متعدد الأنواع 5 أيام المجموعات: القيم هي متوسط الطول الكلي في مم؛ أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التنفيذ الناجح لأسلوب متعدد الأنواع حيدة الخلية والروتيفر لتغذية أوائل الزرد اليرقات يتطلب بروتوكولات فعالة لمهمتين: إنشاء وصيانة نظام الثقافة حيدة الخلية والروتيفر المستمر لتغذية الأسماك، وزراعة تغذية أول اليرقات الزرد جنبا إلى جنب مع الدوارات في الدبابة نفسها.
تم تعديل الإعداد لنظام إنتاج المياه المالحة حيدة الخلية والروتيفر المستمر للمختبرات الزرد وصف لأول مرة من قبل لورانس والمشاركين فيها 14 وعززت في عدد من الطرق لجعلها على حد سواء أكثر قوة وعالمية في الطلب. ويتضمن البروتوكول الجديد تحسينات على حد سواء في المعدات والمنهجية.
نظام التخزين لخليط تغذية الطحالب يعمل الآن الفقس الجرار المستخدمة في نظم الإنتاج سمك السلور 15. تخزين الأعلاف في هذه الجرار ذهابا والقاع يسهل خلط دقيق لتغذية الطحالب بحيث لا تطبق أو تتجمع وتؤدي إلى تسدجينج خطوط تسليم، وهي مشكلة تعاني في كثير من الأحيان البروتوكول الأصلي. وبالمثل، فإن استخدام جهاز توقيت برمجة الكل في واحد مضخة / القياس يقلل من عدد من المكونات، ويبسط تسليم أجهزة الاستنشاق من العلف إلى الدوارات. كما يسمح للالجرعات من العلف إلى الدوارات على مدار الساعة خلال فترة 24 ساعة، والذي هو أفضل من أقل، رضعات أكبر لأن استيعابهم للتغذية بشكل أكثر كفاءة.
وقد أدرجت طريقة لحساب الدوارات التي تسمح صقل التسليم تغذية لثقافة حيدة الخلية والروتيفر في هذا البروتوكول. تغذية الحيوانات الدوارة على أساس دقيق، وتقييم الوقت الحقيقي لحجم سكانها يضمن ثابت والإنتاج على مستوى عال. كما تم إضافة سفينة Feedout الثقافة الثانوية للبروتوكول. نظام الثقافة المستمر قد تنتج فائض اليومي لعشرات الملايين من الدوارات وراء ما هو مطلوب حتى لعملية الحضانة كبيرة، بسبب الاختلافات في النشاط الحضانة. هذا Feedout النحاسيستخدم lture سفينة لعقد الدوارات لتلقيح اليومي من الزراعة المتعددة، والدوارات المتبقية يمكن تغذية كمكمل غذائي عالي الجودة لمراحل الأحداث اليرقات وأوائل في وقت لاحق من الأسماك. انخفاض الملوحة (10 جم / لتر) في FCV أيضا قبل يتأقلم على الدوارات للشروط في خزانات متعدد الأنواع، بحيث حفاظ على نشاط السباحة قوي عند نقلها.
الأهم من ذلك، هذه التغييرات حيدة الخلية والروتيفر بروتوكول زراعة تؤدي إلى تحسينات في نهج متعدد الأنواع مباشر، وخاصة فيما يتعلق مدخلات العمل. الطريقة السابقة التي نشرتها وأفضل مؤلفي المعنية ليس فقط التلقيح الأولي من الدوارات في يوم 5، ولكن أيضا الإضافات اليومية من الدوارات حتى انتهت مرحلة الاستزراع متعدد الأنواع ثابتة في يوم 9 12، وكان متوسط الكثافة حيدة الخلية والروتيفر خلال بلغت ذروتها هذه الفترة في 333 الدوارات / مل في اليوم من التلقيح، وانتهى أقل من 50 الدوارات / مل عند انتهاء مرحلة الاستزراع المختلط يوم 9 12. وفي المقابل، ويحافظ على البروتوكول الحالي كثافة أعلى من ذلك بكثير في جميع أنحاء، وعادة ما تبدأ من ~ 665 الدوارات / مل، وتنتهي مع ~ 481 الدوارات / مل في اليوم 9.
هناك نوعان من العوامل تمكين هذه الكثافة حيدة الخلية والروتيفر أعلى من ذلك بكثير. 1) والمتانة الشاملة للثقافة حيدة الخلية والروتيفر المستخدمة في التلقيح هو أكبر بكثير. وعلاوة على ذلك، فإن الخطوة منقحة من بتلقيح الإستزراع المختلط مع كميات متساوية من الطحالب / الدوارات في 10 جم / لتر الملوحة و~ 0 ز / L أسماك المياه ملوحة، والنتائج في الملوحة المتوسطة من 5 ز / L التي يتم الاحتفاظ في جميع أنحاء متعدد الأنواع. بدءا من إجمالي حجم أكبر من الماء (1L) هو أكثر ملاءمة لنمو حيدة الخلية والروتيفر والبقاء على قيد الحياة في خزانات متعددة الأنواع أيضا. في طريقة المنشورة سابقا، وانخفاض كثافة انطلاق حيدة الخلية والروتيفر في حجم أصغر استدعت الإضافات اليومية من الدوارات لتجديد الخسائر عن طريق الاستنزاف (ويفترض بسبب سوء نوعية المياه) والاستهلاك عن طريق وضع يرقات الأسماك. نتائج هذه التعديلات على بروتوكول dramatأما من الناحية خفض مدخلات العمل (التغذية واحدة على مدى 4 أيام مقارنة ب 4 رضعات في 4 أيام مع الطريقة السابقة). نمو اليرقات والأداء البقاء على قيد الحياة خلال الفترة متعدد الأنواع الأولية 5 اليوم هو مشابه لذلك نشرت سابقا 12.
إنتاجية الثقافات حيدة الخلية والروتيفر يقتصر بالضرورة على مدخلات الأعلاف. لا يمكن أن يتحقق 3000 / مل مع هذه الأساليب ببساطة عن طريق زيادة تسليم تغذية - الكثافة حيدة الخلية والروتيفر من 2000. عندما العائد حيدة الخلية والروتيفر لكل وحدة من العلف هو معروف، معدل التغذية يمكن تعديلها لتتناسب مع إنتاج حيدة الخلية والروتيفر إلى الاحتياجات المتوقعة. خلال عطلة نهاية الأسبوع والأعياد، والتغذية ويمكن تخفيض والمحاصيل حذفت لمدة يوم أو يومين دون الإضرار الدوارات، على الرغم من إمكاناتها الإنتاجية ستكون دون المستوى الأمثل حتى التغذية اليومية العادية وحصاد يستأنف روتينية.
عندما تكون هناك حاجة غير متوقعة لمزيد من الدوارات من المعتاد، وجزء كبير من السكان يمكن حصاده دون الإضرار طريق مسدودتلح، ولكن اعتمادا على حجم المحصول ثقافة قد يتطلب يوم أو أكثر لاستعادة الكثافة المعتادة. إذا كان سيتم خفض الطلب حيدة الخلية والروتيفر لأكثر من يوم أو يومين، من الأفضل خفض الإنتاج عن طريق الحد من نقل الأعلاف، بدلا من خفض الحصاد. معدل الحصاد لا يقل عن 25٪ / اليوم يحتفظ الأصغر بحسب العمر حيدة الخلية والروتيفر بحيث الدوارات هي اكثر قوة وخصبة، وتحسين أدائها في خزانات متعدد الأنواع.
يتكيف هذا البروتوكول بسهولة إلى مستويات أصغر لمرافق الزرد أصغر. على سبيل المثال، ثقافة 15 L، التي يمكن وضعها بسهولة حتى في معيار 5 غالون الولايات المتحدة (20 L) دلو مع ومن ناحية التغذية مرتين يوميا، يمكن أن يحقق بسهولة كثافة 1000 الدوارات / مل. استخدام مضخة تغذية تمكن كثافة 2،000-3،000 / مل. دلو واحد تحصد 30٪ / يوم وبالتالي يمكن أن توفر 5-15٬000٬000 الدوارات / اليوم، وهو ما يكفي لبدء 10-30 الزراعة المتعددة. دلوين يمكن استخدامها في نفس CV + FCV البروتوكول كما هو موضح فيبوف. الطحالب + تحكم الأمونيا + درجة الحموضة عازلة قبل مزيج العلف المتاحة (انظر الجدول الكواشف محددة / المعدات) التي هي مريحة للتطبيقات على نطاق صغير. لديها ما يكفي من اللزوجة أن خلايا الطحالب لا يستقر بسرعة وحتى أنها لا تتطلب الاختلاط المستمر في خزان تغذية.
إذا انخفضت إنتاجية ثقافة حيدة الخلية والروتيفر، أو تراكم غير عادي من الدوارات الميتة وجدت في الثقافة و(درجة الحرارة والملوحة، ودرجة الحموضة، NH 3 تركيز) ينبغي فحص جميع المعلمات نوعية المياه. plicatilis Brachionus وعادة ما تحمل بيوضها حتى يفقس، و وجود الكثير من البيض غير مرتبط (والتي عادة لا يفقس) في الثقافة هو علامة على الإجهاد، وغالبا ما يرجع إلى أمونيا المتراكمة.
إذا كان الماء ثقافة حيدة الخلية والروتيفر هو الأخضر أكثر كثافة من المعتاد، ثم إما معدل التغذية مرتفع جدا أو الدوارات لا تستهلك المواد الغذائية في معدلاتها المعتادة. عادة هذا هو كاليفورنيايستخدم من قبل أي عامل الإجهاد، أو ثقافة قد overharvested دون تعديل معدل التغذية وفقا لخفض عدد السكان. في الثقافات كثيفة أنه من الطبيعي لتلوين البني لتتراكم في الماء كما يستقلبان أصباغ الطحالب من الدوارات.
اعتمد استخدام الدوارات المياه المالحة خلال مرحلة الرضاعة الأولى على نطاق واسع في جميع أنحاء المجتمع البحثي الزرد منذ نشرت الطريقة لأول مرة في عام 2010 (12). إن التعديلات التي أدخلت على طريقة الزراعة المتعددة تربية الموضحة في هذا البروتوكول يسمح لعدد أكبر من مختبرات لتبني هذا النهج، بغض النظر عن الحجم. هذه التطورات هي في الوقت المناسب؛ التطورات في تكنولوجيا بالضربة القاضية جين (على سبيل المثال، كريسبر، TALENs، الخ) لالزرد سيتطلب بروتوكولات تربية مبسطة وفعالة لزراعة الآلاف من سلالات جديدة من الأسماك المعدلة وراثيا للاستخدام في مختلف المجالات العلمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعمل EC هنري ريد تربية الأحياء البحرية، وشركة، وهي الشركة التي توفر الدوارات ومركزات الطحالب، وغيرها من الإمدادات لتربية الأحياء المائية والأسماك أسواق الهاوي.
Acknowledgments
تم إجراء الرعاية واستخدام الأسماك ولدت لنتائج ممثلة الموصوفة في هذا البروتوكول بما يتفق تماما مع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في مستشفى بوسطن للأطفال، بروتوكول # 14-05-2673R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
- Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , CRC Press. (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
- Biology and Culture of Channel Catfish. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. 34, 634-657 (2004).
