Introduction
דג הזברה (Danio rerio) היא בחיות מעבדה מראש יחסני מנוצלות במספר הולך וגדל של דיסציפלינות מדעיות, כולל אך לא מוגבל לגנטיקה התפתחותית, טוקסיקולוגיה, התנהגות, חקלאות ימית, ביולוגיה משובי, והמודלים של הפרעות אנושיות רבות 1 - 5. למרות שהמין הוא קל יחסית כדי לשמור על במעבדה, יש מספר אתגרי ניהול המזוהים עם תרבותם 6. הבולט ביותר הוא גידול זחל, במיוחד כאשר הדגים יתחילו ראשון להאכיל לאחר האינפלציה שלפוחית גז 7. בתנאים רגילים, בשליטה, אירוע התפתחותי זה מתרחש ב ~ 5 ימים לאחר הפריה (DPF), עם 3 הבאים - 5 הימים של צמיחה להיות 7 קריטיים במיוחד. הקושי הטכני המרכזי בשלב זה הוא לענות כראוי את הדרישות התזונתיות של זחלי ההאכלה הראשונים - פריטי מזון חייבים להיות בגודל מתאים, digestible, אטרקטיבי, וזמין על בסיס כמעט רציף, ללא יצירת פסולת מוגזמת בטנקי culturing. מבחינה הסטורית זו הושגה בדרך כלל על ידי מתן כמויות קטנות של מזון רבות לדגים בטנקים, יחד עם 8,9 תחלופת מים שיגרתי. בעוד שיטות אלה הן במידה מסוימת מוצלחות, הם לא יעילים, דורשים תשומות עבודה גבוהות, ולחזור רק משתנה ושיעורים מוגבלים של צמיחה והישרדות 10.
בטבע, זחלי דג הזברה ככל הנראה להאכיל בהווה זואופלנקטון קטן בשפע בעמודת המים 11. מסיבה זו, פרוטוקולי larviculture שלשלב הזנות חיות כגון הסנדלית, rotifers, והארטמיה הם בדרך כלל יעילים ביותר 7. בשנת 2010, בסט והמחברים הוכיחו שזה אפשרי לגדל דג הזברה זחל במי סטטי, מליחים יחד עם rotifers המים המלוחים במשך 5 הימים הראשונים של האכלת אקסוגני 12. גישה זו, הרותמת אתes הפרודוקטיביות הגבוהה הטבעית של תרבויות rotifer לספק טרף בשפע, ערך תזונתי גבוהה מבלי לזהם את המים, תשואות שיעורים גבוהים מאוד של צמיחת זחל והישרדות עם תשומת עבודה נמוכה 12,13. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מעבדות ברחבי העולם אימץ וריאציות של פרוטוקול זה, ורבים מהם עכשיו culturing rotifers באופן רציף לתמיכה במערכות משתלת 14.
בשנים האחרונות, שיטות לשני rotifer / פוליקולטורה דג הזברה וייצור rotifer כבר מעודנת והשתפרו להיות יותר סטנדרטי וניתן להרחבה בקלות. מאמר זה מספק הוראות צעד-אחר-צעד ל1) ייצור rotifer רציף וחזק ו 2) הקמת rotifer / מערכת פוליקולטורה דג הזברה משמשת לתמיכה בצמיחה חזקה של דגים במשך 5 הימים הראשונים של האכלת אקסוגני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rotifer תרבות
- רכיבים בסיסיים של מערכת תרבות באמצעות כלי 100 L תרבות
- אסוף את כל הרכיבים להתקנת תרבות rotifer. התקנת תרבות rotifer מורכבת מכלי תרבות (CV) לגדול rotifers; כלי דומה כדי לשמור על rotifers feedout (כלי תרבות feedout, FCV); צנצנת בקיעה עגולה תחתית (Feed מאגר, FR) לאחסון של התערובת להאכיל אצות (AFM); אספקת אוויר (AS) ללאוורר את קורות החיים, וFCV FR; משאבת peristaltic עם טיימר מדידה (PMT) לשלוט משלוח של מזון אצות לקורות החיים וFCV; ומסנן חלקיקי חוט (FPF) שיושב בתוך קורות החיים.
הערה: רשימה של ציוד ורכיבים מלא מסופקת ברשימת חומרים.
- אסוף את כל הרכיבים להתקנת תרבות rotifer. התקנת תרבות rotifer מורכבת מכלי תרבות (CV) לגדול rotifers; כלי דומה כדי לשמור על rotifers feedout (כלי תרבות feedout, FCV); צנצנת בקיעה עגולה תחתית (Feed מאגר, FR) לאחסון של התערובת להאכיל אצות (AFM); אספקת אוויר (AS) ללאוורר את קורות החיים, וFCV FR; משאבת peristaltic עם טיימר מדידה (PMT) לשלוט משלוח של מזון אצות לקורות החיים וFCV; ומסנן חלקיקי חוט (FPF) שיושב בתוך קורות החיים.
- תְצוּרָה
- להעלות את קורות החיים וFCV על דוכן או שולחן, כך שהתרבויות יכולות להיות שנקטפו בקלות באמצעות ניקוז ההולם להמשך אוסףainer (איור 1). השתמש בצינורות אספקת האוויר גמישים להתחבר AS לאורכו של צינור קשיח בכל כלי תרבות. ודא שהצינור הוא מספיק זמן כדי לספק אוויר לתחתית קורות החיים או FCV.
- השתמש בקו אוויר קטן-יכולת להתחבר AS לאורכו של צינור קשיח המשתרע עד לתחתית של FR המכיל את AFM. התקן שסתום לכל שורת אוויר להסדיר את זרימת אוויר. חבר את FR לPMT עם צינורות אספקת מזון, ומפעיל את הצינור מPMT לתוך חור שנקדח בצד של קורות החיים / FCV, בחלקו העליון. איור 1.
- לִקְפּוֹץ
- מלא את כלי התרבות עד 90% מההיקף הזמינים במי אוסמוזה ההפוך (RO). אם RO אינו זמין, להשתמש במים נקיים, dechlorinated עירוניים; עם זאת, הערכת סיכוני ביטחון ביולוגי צריכה להתבצע כדי לוודא ששום אורגניזמים שעלולים להיות פתוגניים נמצאים במי המקור. הערה: ניתוח כזה יכול להתבצעבכל מעבדת בדיקה מוסמכת מים.
- מינון המים כלי התרבות במלח אקווריום להגיע מליחות של 15 גר '/ ל'. הגדר את זרימת האוויר לתוך הכלי, כך שהוא שומר על "רתיחה מתגלגלת", ולאחר מכן להוסיף לאט כמות המדודה של מלח לכלי התרבות עד שהוא נמס לגמרי על ידי האוורור. המשך aerating מים ל> 1 שעה כדי לוודא שהוא הוא מחומצן באופן מלא.
- הפוך את התערובת להאכיל אצות. עד 3 ליטר נקי, dechlorinated מים מתוקים (0 ppm) להוסיף של NaHCO 3 100 גרם ושל מנטרל אמוניה (hydroxymethylsulfonate נתרן) 100 גרם. מגיב אחרון זה מספק את היתרון נוסף של נטרול כל כלור שיורי משאריות מים ברז או אקונומיקה מהחיטוי של ציוד התרבות. זה קריטי כדי להבטיח כי תרכובות אלה להמסה מלאה. ואז להוסיף 1 ליטר של תרכיז אצות (משקל יבש ביומסה ~ 15%). מוסיף את תערובת המזון לFR ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
- הוסף תרבות המתנע של 5-10,000,000
- הפעל PMT ולהתחיל שאיבה להאכיל אצות לתוך כלי תרבות rotifer. באמצעות תכונת טיימר של PMT, להגדיר את קצב האספקה של תערובת מזון לאצות כדי ש~ 1.6 מיליליטר של תערובת להאכיל אצות מועבר למיליון rotifers בתרבות, בכל יום. להפיץ את ההאכלות במנות קטנות במרווחי זמן קבועים במהלך תקופה של 24 שעות; תכוף יותר ההאכלות, טוב יותר.
- כייל את שיעור המסירה של המשאבה ידנית על ידי סיבוב על PMT לתקופה קצובה (למשל, 1 דקות) ולאסוף את האצות שמשאבות בפרק זמן זה לגליל או כוס סיים. לדוגמא, אם במינוני PMT 5 מיליליטר של אצות בדקות 1, ולאחר מכן את שיעור המינון יהיה5 מיליליטר אצות / דקה.
- לחשב את שיעור ההאכלה היומי הנדרש על ידי הכפלת מספר rotifers הנוכחי, במיליון, ב- 1.6 מיליליטר. לדוגמא, תרבות rotifer עם גודל אוכלוסייה של 100 מיליון rotifers תדרוש ~ 160 מיליליטר של מזון ליום (100 x 1.6 מיליליטר).
- הגדר את PMT למינון דרישת עדכונים היומי הכוללת במרווחים קבועים לאורך תקופה של 24 שעות. לדוגמא, אספקה של כמות מזון יומית כוללת של 160 מיליליטר יכולה להיות מועברת במנות פעם אחת כל 3 שעות במשך 24 שעות באמצעות סט PMT עם שיעור משאבת מינון של 5 מיליליטר / דקה במשך 4 דקות, 8 פעמים ביום (5 מיליליטר / דקה x 4 דקות = 20 מיליליטר x 8 האכלות = 160 מיליליטר).
- לאפשר לתרבות לגדול עד שהוא מייצר אוכלוסייה הנדרשת, בדרך כלל עבור 48-72 שעות, לפני הקציר. ב 24 שעות שלאחר להתחיל, להוסיף מסנני חלקיקי חוט לכלי התרבות ולהתחיל תחזוקה רגילה.
- תַחזוּקָה
הערה: התרבות פועלת באופן רציף ודורשת routinתחזוקת דואר שבאופן אידיאלי צריכה להתבצע באותו הזמן בכל יום, ברצף הבא.- מלא את FCV 90% מנפח זמין עם נקי, dechlorinated מים מתוקים, במינון עם מלחי אקווריום L / 10 גרם. ודא שהמים הוא גם מעורבים, וכי כל מלח מתמוסס באופן מלא. הגדר את זרימת האוויר לתוך הכלי, כך שהוא שומר על "רתיחה מתגלגלת". מדוד את המליחות עם refractometer ולהבטיח שהמליחות היא 10 גר '/ L. זה קריטי כדי לעמוד ביעד זה ושלא יעלה על זה.
- לדוגמא rotifers בקורות החיים: ודא שהתרבות היא מעורבת היטב, לאחר מכן לאסוף 3 דגימות של 2 - 3 מיליליטר כל אחד באמצעות פיפטה העברה או autopipettor, מחלקים שונים של התרבות. לשלב דגימות אלה בצינור או בקבוקון של גודל נוח (למשל, 10 מיליליטר).
- העברת 1 - 2 מיליליטר של המדגם המשולב על צלחת פטרי, כדי שניתן דמיינה אותו תחת מיקרוסקופ לנתח. בדוק את האיכות של התרבות (שחייה התנהגות שלrotifers, נוכחות של ביצים מנותקות, פרוטוזואה זיהום).
- לשתק את rotifers במדגם בשילוב שנותר על ידי הוספה של 50% תמיסת יוד Lugols 100 μl למדגם. בתוך שניות לאחר תוספת של Lugols, להתבונן rotifers להפסיק חייה. עכשיו, בקלות לספור את rotifers.
הערה: אתנול, אקונומיקה מדוללת, או חומץ יכולה לשמש במקום של Lugols. חומץ (2 טיפות / 10 מיליליטר) יש את היתרונות של להיות לא מסוכן, לא לאבד את הכוח באחסון כפתרונות אקונומיקה ויוד יכול, ולא מה שהופך את חוזה rotifers, כך העטרה של cilia ו" הרגל "יישארו מורחבת ו בעלי חיים נראים טבעיים יותר. - ודא שהמדגם הוא גם מעורב (rotifers המשותק יישב במהירות), ואז לקחת במהירות subsample מיליליטר ~ 2 בpipet פלסטיק ולוותר 1 מיליליטר לשקופית לספור Sedgewick-Rafter (20 x 50 ריבועים 1 מ"מ) (איור 2 ). באמצעות מיקרוסקופ לנתח או תרכובת, לספור את rotifers שלם ולאמספר otal של ביצים המצורפות לrotifers אלה (איור 2). ספירה כמה שיותר משטח השקופית כצורך לספור ~ 100 rotifers. לחשב את מספר rotifers לכל מיליליטר, ולהקליט את זה בגיליון אלקטרוני או יומן.
- קציר ~ 30% מהיקף rotifers בקורות החיים: הסירו את אספקת האוויר ומסנן חוט, לפתוח לאט את השסתום בחלק התחתון של קורות החיים ולאפשר למים לזרום לאספן פלנקטון עם מסך רשת 53 מיקרומטר. לאסוף את המים זורמים החוצה של החלק התחתון של האספן לאחר הסינון לדלי או ניקוז. השתמש בעדין לזרימה מתונה כדי למנוע נזק לrotifers. אל תאפשר rotifers לייבוש על המסך.
- מסיבות עקביות, רצוי להקים FCV עם מספר סטנדרטי של rotifers בכל יום. לכן, בהתבסס על הצפיפות הידועה rotifer קורות חיים וקציר הנפח, להתאים כולל FCV הנפח להשיג צפיפות סופית עולה בקנה אחד (למשל., 1500 rotifers מיליליטר /). הוסף את רוטי נקטףfers לFCV: בעדינות להעביר את rotifers מהמסך הגבייה באמצעות בקבוק לשטוף מלאים במים נקיים מלח (10 - L / 15 גר '). הפוך את המסך מעל FCV ולשטוף את rotifers לFCV עם זרם עדין של מים מלוחים. התחל PMT כדי לספק מזון (~ 1.57 מיליליטר למיליון rotifers ליום) לFCV.
- לשפשף את כל החלק הפנימי של קורות החיים עם, מברשת נקייה רכה ניילון או כרית קרצוף.
- הפוך תערובת חדשה של מים / L 15 גרם על ידי הוספת הכמות המתאימה של מלח לכמות מדודה של מי RO נקיים בדלי 5 ליטר להחליף את נפח מים איבד למסוק. מוסיף את המלח למים בדלי ומערבבים נמרצות עד שהוא נמס לגמרי, ולאחר מכן להוסיף לקורות החיים.
- שימוש בתרסיס בלחץ גבוה בכיור, לשטוף את מסנן החוט עד שהוא נקי מפסולת, ולאחר מכן להחזיר אותו לקורות החיים.
- התאם שיעורי הזנה של אצות נמסרו לקורות החיים על ידי שינוי משך הזמן של כל אירוע מינון, על פי הספירה היומית של rotifers מיליליטר /.השתמש בחישובים הניתנים בשלב 1.3.8, לעיל כדי לקבוע את הכמות המתאימה של מזון כדי להיות מועברת.
- כ 24 שעות מאוחר יותר, לחזור על התהליך. התחל על ידי קצירת rotifers שנותר בFCV (שלא היה זקוק ליום הקודם) באותו אופן כפי שתוארו לעיל (שלבים 1.4.2 - 1.4.10). לרכז אותם ב 2 ליטר של מים טריים, נקיים dechlorinated (מלח L / 5 ז). אלה יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס כפי שאספקת גיבוי, או נהגו להאכיל שלבים מאוחר יותר של דגים, מעבר למה שמתואר בפרוטוקול זה.
הערה: פרוטוקול זה מאפשר עד 2 - 3 ימים של תחזוקה מופחתת תרבות (עם הזנה אוטומטית רגילה), כי rotifers בקורות החיים יכול לסבול מחדל של יבולים ללא השלכות חמורות.
2. פוליקולטורה
- להכין
- לאסוף עוברי דג הזברה מאירוע השרצה על ידי שפיכת עוברים הולידו דרך תה מסננת ולאחר מכן בעדינות שטיפה עם FIS סטריליהמים h (או כל מקור אחר שאינם מזוהם של פתרון מותנה כראוי; למשל, בינוני עובר, E3, וכו ') מבקבוק לשטוף לתוך צלחות פטרי.
- דגירה עובר ב25 - 28 מעלות צלזיוס בצלחות פטרי בצפיפות של 40 - 50 עובר לכל צלחת במשך 5 ימים.
- תתחיל את שלב פוליקולטורה ביום 5 לאחר הפריה, או כאשר יותר מ -90% מהזחלים שבקעו באופן פעיל בחייה בעמודת המים.
- הַרכָּבָה
- הוסף 500 מיליליטר של תרבות rotifer ישירות מFCV לטנק משתלת 3.5 L; הכללה של מים תרבות rotifer מספקת הזנה של אצות ששומרת על הערך התזונתי של rotifers במהלך פוליקולטורה.
- בעדינות לשפוך את הזחלים מצלחת פטרי אחת לתוך טנק חדר הילדים. ודא שאין זחלים יישארו בצלחת.
- הוסף 500 מיליליטר של מים נקיים, ממוזגים דגים ממערכת הסירקולציה המחודשת או מקור מים ייעודי לטנק להגיע נפח סופי של 1 ליטר ושל אחרוןalinity של 5 גר '/ ל'.
הערה: מליחות זה קריטי כי הישרדות זחלי דג הזברה תושפע לרעה אם המליחות היא> 7 גרם / L והישרדות rotifer יושפע לרעה אם מליחות <2 g / L.
- שלב פוליקולטורה
הערה: שלב פוליקולטורה צריך להימשך עד 4 ימים לאחר חיסון (כולל של 5 ימים, מתאים לימים 5-9 לאחר הפריה).- שים לב למכל פוליקולטורה לפחות פעם ביום בתקופה זו על מנת להבטיח שrotifers ודגים נמצאים וגדל. ודא שrotifers גלוי לאורך כל עמודת המים. ודא שfishs הם גם נראים בתוך עמודת המים, שחיה בין rotifers.
- התחל זרימת מים רגילה באמצעות הטנק. הנח מסך או לבלבל מעל נמל הניקוז כדי להבטיח זחלים שאינם סמוקים מהטנק.
הערה: בסופו של שלב זה, הדגים יהיו גדולים מספיק כדי לצרוך פריטי טרף גדולים יותר כגון הארטמיהפריטי מזון Nauplii או מעובד בטווח הגודל של 75-125 מיקרומטר.
הערה: דינמיקת אוכלוסיית rotifer בתוך טנק פוליקולטורה נציג נמדדה על ידי דגימה / ספירת rotifers מהמכל באותו אופן כפי שתואר בצעדים 1.4.2 - 1.4.5. זה נעשה פעם אחת בכל יום מההתחלה של שלב פוליקולטורה עד שהושלם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת תרבות rotifer רציפה המתוארת כאן היא דינמית, וזה נורמלי למספרי rotifer להשתנות במידה מועטת לאורך זמן אם יש וריאציות בשיעורי האכלה וקציר יומיים. האוכלוסייה של rotifers באחת התרבויות הפעילה במתקני החקלאות הימית בבית החולים לילדים בבוסטון, נשמר באופן מתואר לעיל, היה במעקב במשך 30 ימים (איור 3). הצפיפות הממוצעת התרבות בתקופה זו הייתה 932 rotifers / מ"ל, עם מקסימום של 1,330 מיליליטר / rotifers ומינימום של 510 מיליליטר / rotifers. זה מייצג את הביצועים האופייניים של תרבות rotifer תישמר בהתאם פרוטוקול זה.
הדינמיקה של אוכלוסיית rotifer בטנק פוליקולטורה עם דג הזברה מוצגת באיור 4. האקווריום 3.5 L היה מחוסנת עם 500 מיליליטר של תרבות rotifer מFCV, 500 מיליליטר של f מעוקרתמים איש, וwild-type 40 יום 5-ישן (זן טובינגן) זחלים, כדי להדגים כיצד rotifers ודג זברה לבצע בטנק טיפוסי פוליקולטורה. אוכלוסיית rotifer במכל פוליקולטורה הגיעה לשיא ביום השני עם צפיפות של 747 מיליליטר rotifers / (איור 4). הצפיפות של rotifers במכל פוליקולטורה ירד לאורך תקופת פוליקולטורה 5 ימים עד למינימום של 481 rotifers / מיליליטר ביום 5. עם זאת, צפיפות rotifer הממוצע לאורך כל התקופה הייתה 589.4 מיליליטר rotifers /, ואת הערך המינימאלי של 481 rotifers / מיליליטר הוא ~ 10 פעמים כי צפיפות rotifer בסוף תקופת פוליקולטורה בעבודה שפורסמה בעבר 12.
צמיחת דג הזברה בתקופה של חמישה הימים מוצגת באיור 5. הדגים הראו צמיחה יציבה בכל יום, מאורך כולל ממוצע של 3.904 מ"מ ± SEM .063 כאשר הם נוספו לטנק פוליקולטורה לאורך כולל ממוצע של 5.423 ± SEM .063 עַלביום האחרון של שלב פוליקולטורה. ההישרדות הייתה 95% (38/40).
פרמטרים של איכות מים נמדדו מדי יום בטנק פוליקולטורה הנציג, ומוצגים בטבלה 1. הערכים של פרמטרים אלה דומים לעבודה שפורסמה בעבר 12, ומייצגים תנאים שהם תורמים לצמיחה וההישרדות של שני rotifers והדגים בתקופה של 5 הימים של פוליקולטורה.
| יְוֹם | יְוֹם | מְלִיחוּת | לְהִשְׁתַזֵף | NO 2 | NO 3 | pH | בסיסי | קַשִׁיוּת | טֶמפֶּרָטוּרָה |
| (מַמָשִׁי) | (לאחר הפריה) | g / L | מ"ג / ליטר | מ"ג / ליטר | מ"ג / ליטר | מ"ג / ליטר (קאקו 3) | מ"ג / ליטר (קאקו 3) | מעלות צלזיוס </ Td> | |
| יוֹם שֵׁנִי | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| יוֹם שְׁלִישִׁי | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23.3 |
| יום רביעי | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22.3 |
| יוֹם חֲמִישִׁי | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22.8 |
| יוֹם שִׁישִׁי | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
1. אני פרמטרי איכות המים שולחןנה נציג דג הזברה פוליקולטורה טנק.
התקנת 1. Rotifer תרבות איור מקרא:. כלי תרבות, כלי Feedout תרבות (FCV) (CV), Air Supply (AS), מסנן החלקיקים Floss (FPF), תערובת הזנת אצות (AFM), להאכיל מאגר (FR), שיטת מדידה לתכנות טיימר (PMT). קווים מוצקים מייצגים משלוח להאכיל אצות. קווים מקווקווים מייצגים אספקת אוויר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מילוי של שקופיות ספירת Sedgewick-Rafter. אנא לחץ כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 3. דינמיקה של אוכלוסיות Rotifer בתרבות על פני תקופה של 30 יום מקרא: מספר rotifers נספר (נקבות + ביצים) לכל מיליליטר הוא על ציר x. מספר הימים בתרבות הוא על ציר y. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. דינמיקה של אוכלוסיות Rotifer במהלך פוליקולטורה 5 ימים מקרא:. מספר rotifers נספר (נקבות + ביצים) לכל מיליליטר הוא על ציר x. מספר הימים בפוליקולטורה הוא על ציר y. אנא לחץ כאן כדי VIEW גרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 5. דג הזברה צמיחה במהלך פוליקולטורה 5 ימים מקרא: ערכים הם אורך כולל ממוצע במ"מ; ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יישום מוצלח של שיטת פוליקולטורה rotifer האכלה דג הזברה זחל מוקדם דורש פרוטוקולים יעילים לשתי משימות: ההקמה ותחזוקה של מערכת תרבות rotifer רציפה כדי להאכיל את הדגים, וculturing הראשון-האכלת זחלי דג הזברה יחד עם rotifers באותו הטנק.
ההתקנה למערכת ייצור rotifer המים המלוחים רציפה למעבדות דג הזברה תוארו לראשונה על ידי לורנס ומחברים 14 שונתה ומשופר במספר הדרכים לעשות את זה יותר חזק ואוניברסלי הן ביישום. הפרוטוקול החדש משלב שיפורים הן בציוד ומתודולוגיה.
מערכת האחסון לתערובת להאכיל אצות מעסיקה כיום בקיעת צנצנות בשימוש במערכות ייצור שפמנון 15. אחסון של המזון בצנצנות עגולות תחתית אלה מאפשר ערבוב יסודי של הזנת האצות, כך שזה לא רבד או גוש ולהוביל ללסתוםגינג של קווי אספקה, בעיה שלעתים קרובות הטרידה את הפרוטוקול המקורי. כמו כן, השימוש במשאבה / מדידת טיימר כל אחד ב-לתכנות מפחית את המספר הכולל של רכיבים, ומפשט את משלוח מודד האויר של מזון לrotifers. זה גם מאפשר המינון של מזון לrotifers על בסיס שעות על פני תקופת 24 שעות, שהוא עדיף על האכלות פחות, גדולות יותר, כי ההזנה נטמעה בצורה יעילה יותר.
שיטה לספירת rotifers המאפשרת כוונון עדין של משלוח מזון לתרבות rotifer נכללה בפרוטוקול זה. האכלת rotifers מבוסס על הערכה מדויקת, בזמן אמת של גודל האוכלוסייה שלהם מבטיחה ייצור יציב, ברמה גבוהה. כלי Feedout תרבות משניים גם נוספו לפרוטוקול. מערכת תרבות רציפה יכולה לייצר עודף יומי של עשרות מיליון rotifers מעבר למה שנדרש לצורך אפילו פעולת משתלה גדולה, בשל שינויים בפעילות ילדים. זה Feedout Cuכלי lture משמש להחזיק rotifers לחיסון יומי של polycultures, ויכול להיות מוזן rotifers נותר כתוסף תזונה באיכות גבוהה לשלבי נוער זחל ותחילת מאוחר יותר של דגים. המליחות המופחתת (10 גר '/ ל') בFCV גם-acclimates מראש rotifers לתנאים בטנקים פוליקולטורה, כך שהם שומרים על פעילות שחייה נמרצת כאשר הועברו.
חשוב לציין, שינויים אלה כדי להוביל פרוטוקול culturing rotifer לכוון שיפורים בגישת פוליקולטורה, במיוחד בכל קשור לתשומת עבודה. השיטה הקודמת שפורסמה על ידי הטוב ביותר ומחברים מעורבים חיסון לא רק ראשוני של rotifers ביום 5, אבל גם תוספות יומיות של rotifers עד שלב פוליקולטורה סטטי שהסתיים ביום 9 12. ממוצעת צפיפות rotifer בתקופה זו הגיעה לשיא של 333 rotifers / מיליליטר ביום של חיסון ובסופו מתחת ל -50 מיליליטר / rotifers בסיומו של שלב פוליקולטורה ביום 9 12. בניגוד, הפרוטוקול הנוכחי שומר על צפיפות גבוהה בהרבה לאורך כל דרך, בדרך כלל מתחיל ב ~ 665 מיליליטר / rotifers, וכלה ב~ 481 מיליליטר / rotifers ביום 9.
ישנם שני גורמים המאפשרים צפיפות rotifer הרבה יותר גבוהה אלה. 1) החוסן הכללי של תרבות rotifer משמשת לחיסון הוא הרבה יותר גדול. יתר על כן, הצעד המתוקן של ייחס פוליקולטורה עם כמויות שווים של אצות / rotifers ב 10 גר '/ מליחות L ו~ 0 g / מים דגי מליחות L, תוצאות במליחות ביניים של 5 גר' / ל 'שנשמר לאורך פוליקולטורה. החל בהיקף כולל גדול יותר של מים (1 ליטר) גם הוא תורם יותר לצמיחת rotifer והישרדות בטנקים פוליקולטורה. בשיטה שפורסמה בעבר, צפיפות rotifer ההתחלה נמוכה יותר בנפח קטן יותר חייבה תוספות יומיות של rotifers לחדש הפסדים על ידי התשה (ככל הנראה בשל איכות ירודה מים) וצריכה על ידי פיתוח זחלי דגים. התוצאות של התאמות אלה dramat הפרוטוקולically להפחית תשומות עבודה (האכלה אחת על פני 4 ימים לעומת 4 האכלות ב 4 ימים עם השיטה הקודמת). צמיחת הזחל וביצועי הישרדות על פני תקופת פוליקולטורה 5 ימים הראשונית דומה לזו שפורסמה בעבר 12.
הפרודוקטיביות של תרבויות rotifer מוגבלת בהכרח על ידי קלט ההזנה. צפיפות Rotifer של 2,000 - 3,000 מיליליטר / ניתן להשיג עם שיטות אלה פשוט על ידי הגדלת אספקת המזון. כאשר תשואת rotifer ליחידת ההזנה ידועה, שיעור הזנה יכול להיות מותאם כדי להתאים לצרכי ייצור rotifer המוקרנים. במהלך סופי השבוע והחגים, האכלה יכולה להיות מופחתת ויבולים הושמטו ליום או ימים מבלי לפגוע rotifers, למרות שהפוטנציאל היצרני שלהם יהיה הכי מוצלח עד ההאכלה היומית הרגילה ולקצור קורות חיים שיגרתי.
כאשר יש צורך בלתי צפוי ליותר rotifers מהרגיל, חלק גדול יותר של האוכלוסייה ניתן לקצור בלי לפגוע ברחוב ללאture, אבל תלוי בגודל של קציר התרבות עשויה לדרוש ביום או יותר להתאושש הצפיפות הרגילה שלו. אם ביקוש rotifer יופחת במשך יותר מיום או ימים, ייצור מופחת הטוב ביותר על ידי צמצום אספקת המזון, ולא להקטין את היבול. שיעור קציר של לפחות 25% / יום שומר על פרופיל גיל rotifer צעיר, כך שrotifers יותר נמרץ ופורים, שיפור הביצועים שלהם בטנקים פוליקולטורה.
פרוטוקול זה מותאם בקלות לקני מידה קטנה יותר למתקני דג הזברה קטנים יותר. לדוגמא, תרבות 15 L, שניתן להגדיר בנוחות בדלי 5 ליטר בארה"ב (20 ליטר) סטנדרטי עם יד האכלת פעמיים ביום, יכולה בקלות להגיע לצפיפות של 1,000 מיליליטר / rotifers. שימוש במשאבת הזנה מאפשרת צפיפויות של 2,000-3,000 מיליליטר /. דלי יחיד שנקטפו על 30% / יום ולכן יכול לספק 5-15 מיליון rotifers / יום, מספיק כדי להתחיל 10-30 polycultures. שני דליים ניתן להשתמש באותו פרוטוקול קורות חיים + FCV כמתוארבוב. הזנה מראש תערובת חיץ אצות + בקר אמוניה + pH היא זמינה (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) כי הוא נוח ליישומים בקנה מידה קטנה. יש לו צמיגות די בכך שתאי האצות לא להסתפק במהירות וכך היא אינה דורשת ערבוב רציף במאגר ההזנה.
אם ירידות הפרודוקטיביות תרבות rotifer, או הצטברות חריגה של rotifers המת נמצאת בתרבות, כל הפרמטרים של איכות מים (טמפרטורה, מליחות, pH, NH 3 ריכוז) צריכים להיבדק. Plicatilis Brachionus בדרך כלל נושאת את ביציה עד שהם בוקעים, ו נוכחותם של רבים ביצים פנויות (אשר בדרך כלל לא לבקוע) בתרבות היא סימן ללחץ, לרוב בשל אמוניה שנצברה.
אם המים תרבות rotifer הוא ירוקים עז יותר מהרגיל, ולאחר מכן גם את שיעור העדכון הוא גבוה מדי או rotifers לא לצרוך מזון בשיעור הרגיל שלהם. בדרך כלל זה הוא CAבשימוש על ידי שני גורמי לחץ, או התרבות כבר overharvested ללא התאמת שיעור הזנה בהתאם לאוכלוסייה המופחתת. בתרבויות צפופות זה נורמלי לצבע חום להצטבר במים כפיגמנטים אצות עוברים מטבוליזם על ידי rotifers.
השימוש במים המלוח rotifers בשלב ההאכלה הראשון כבר אומץ באופן נרחב ברחבי קהילת מחקר דג הזברה מאז השיטה פורסמה לראשונה בשנת 2010 12. השינויים שבוצעו בשיטת גידול פוליקולטורה המפורטים בפרוטוקול זה יאפשר מספר גדול עוד יותר של מעבדות לאמץ גישה זו, ללא קשר לגודל. התקדמות אלה בזמן; התפתחויות בטכנולוגית נוקאאוט הגן (למשל., CRISPR, TALENs, וכו ') לדג זברה תדרוש פרוטוקולי גידול יעילים ויעילים לגדול אלפי זנים חדשים של דגים מהונדסים גנטית לשימוש בתחומים שונים של מדע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
EC הנרי מועסק על ידי ריד חקלאות ימית, Inc, חברה המספקת rotifers, תרכיזי אצות, ומצרכים אחרים לשווקי תחביבים החקלאות הימית ודגים.
Acknowledgments
הטיפול והשימוש בדגים שנוצרו לתוצאות נציג המתוארות בפרוטוקול זה נערך בהתאם מלא להנחיות שנקבעו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית החולים לילדים בבוסטון, # פרוטוקול 14-05-2673R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
- Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , CRC Press. (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
- Biology and Culture of Channel Catfish. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. 34, 634-657 (2004).
