Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) é um animal de laboratório pré-eminente utilizada em um número crescente de disciplinas científicas, incluindo, mas não limitado a genética do desenvolvimento, toxicologia, o comportamento, a aquicultura, biologia regenerativa, ea modelagem de muitas doenças humanas 1 - 5. Embora a espécie é relativamente fácil de manter em laboratório, há uma série de desafios de gestão associados à sua cultura 6. A mais proeminente delas é larvicultura, especialmente quando o peixe primeiro começa a alimentar a inflação subseqüente à bexiga de gás 7. Sob condições normais, controlados, este evento desenvolvimento ocorre na ~ 5 dias pós-fertilização (dpf), com os seguintes 3 - 5 dias de crescimento, sendo particularmente crítico 7. A dificuldade técnica central durante este estágio é atender adequadamente as exigências nutricionais do primeiro larvas alimentação - itens de alimentação deve ser de tamanho adequado, Digestible, atraente e disponível em uma base quase contínua, sem a criação de desperdício excessivo em tanques de cultivo. Historicamente, este foi alcançado normalmente através da apresentação de numerosas pequenas quantidades de alimentos para os peixes em tanques, junto com a rotina 8,9 troca de água. Enquanto estes métodos são, até certo grau de sucesso, eles não são eficazes, requerem entradas de trabalho elevadas, e retornar única variável e as taxas de crescimento limitadas e sobrevivência de 10.
Na natureza, larvas do peixe, presumivelmente, se alimentam de zooplâncton abundante pequeno presente na coluna de água 11. Por esta razão, os protocolos que incorporam larvicultura live feeds, tais como Paramecium, rotíferos e Artemia são tipicamente mais eficiente 7. Em 2010, Best e co-autores demonstraram que era possível crescer zebrafish larval em água salobra estática, juntamente com rotíferos de água salgada para os primeiros 5 dias de alimentação exógena 12. Esta abordagem, que aproveitares a alta produtividade natural de culturas de rotíferos para fornecer amplo, presa altamente nutritivos sem poluir a água, produz muito elevadas taxas de crescimento e sobrevivência das larvas com entrada de baixo de trabalho 12,13. Nos últimos anos, um número crescente de laboratórios em todo o mundo adotaram variações deste protocolo, e muitos estão agora a cultura de rotíferos de forma contínua para apoiar os sistemas de viveiro 14.
Ao longo dos últimos anos, os métodos para ambos rotifer / policultura peixe-zebra e produção de rotíferos foram aperfeiçoada e melhorada para se tornar mais padronizado e facilmente escalável. Este artigo fornece instruções passo-a-passo para 1) produção de rotíferos contínuo e robusto e 2) o estabelecimento do sistema / policultura peixe-zebra rotifer usado para apoiar o crescimento robusto de peixe para os primeiros 5 dias de alimentação exógena.
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Protocol
1. Rotifer Cultura
- Componentes básicos de um sistema de cultura utilizando um recipiente de 100 L Cultura
- Reúna todos os componentes para a instalação cultura de rotíferos. A configuração cultura rotíferos consiste de um recipiente de cultura (CV) para cultivar as rotíferos; um recipiente semelhante para manter rotíferos desabastecimento dos silos (vaso de cultura desabastecimento dos silos, FCV); um frasco de fundo redondo de incubação (alimentação Reservoir, FR) para o armazenamento da mistura de alimentação algas (AFM); um suprimento de ar (AS) para arejar o CV, FCV e FR; uma bomba peristáltica com um temporizador de medição (PMT) para controlar o fornecimento de alimentos para as algas para o CV e FCV; e um filtro de partículas fio (FPF) que fica dentro do CV.
NOTA: A lista completa de consumíveis e componentes é fornecida na Lista de Materiais.
- Reúna todos os componentes para a instalação cultura de rotíferos. A configuração cultura rotíferos consiste de um recipiente de cultura (CV) para cultivar as rotíferos; um recipiente semelhante para manter rotíferos desabastecimento dos silos (vaso de cultura desabastecimento dos silos, FCV); um frasco de fundo redondo de incubação (alimentação Reservoir, FR) para o armazenamento da mistura de alimentação algas (AFM); um suprimento de ar (AS) para arejar o CV, FCV e FR; uma bomba peristáltica com um temporizador de medição (PMT) para controlar o fornecimento de alimentos para as algas para o CV e FCV; e um filtro de partículas fio (FPF) que fica dentro do CV.
- Configuração
- Eleve o CV e FCV em um carrinho ou mesa para que as culturas podem ser facilmente colhida através de um dreno encaixe em um cont coleçãoainer (Figura 1). Utilize uma tubagem de alimentação de ar flexível para ligar o AS a um comprimento de tubagem rígida em cada recipiente de cultura. Certifique-se de que a tubagem é suficientemente longo para fornecer ar para a parte inferior do CV ou FCV.
- Usar uma linha de ar com pequena capacidade para ligar o AS a um comprimento de tubagem rígida que se estende para a parte inferior da FR que contém a AFM. Instale uma válvula em cada linha de ar para regular o fluxo de ar. Ligue o FR para o PMT com tubagem de alimentação, e rodar o tubo do PMT para um buraco perfurado no lado do CV / FCV, perto do topo. Figura 1.
- Comece
- Encher o vaso de cultura a 90% do volume disponível com água de osmose reversa (RO). Se RO não estiver disponível, usar, água limpa sem cloro municipal; No entanto, uma avaliação de risco a segurança biológica deve ser realizada para assegurar que não há organismos potencialmente patogénicos estão presentes na água da fonte. NOTA: Tal análise pode ser realizadapor qualquer laboratório de ensaio de água qualificado.
- Dosear a água vaso de cultura com sal aquário para chegar a uma salinidade de 15 g / L. Definir o fluxo de ar para dentro do recipiente de modo a que mantém uma "ferver", e, em seguida, adicionar lentamente a quantidade medida de sal para o recipiente de cultura até que esteja completamente dissolvido por o arejamento. Continue gaseificar a água for> 1 hora para garantir que ele está totalmente oxigenado.
- Faça a mistura de alimentação de algas. Para 3 L de limpo, sem cloro (0 ppm) de água doce adicione 100 g de NaHCO3 e 100 g de amoníaco neutralizador (hydroxymethylsulfonate de sódio). Este último reagente fornece o benefício adicional de neutralizar qualquer cloro residual da água da torneira ou água sanitária resíduos de desinfecção de equipamento de cultura. Ele é fundamental para garantir que estes compostos são totalmente dissolvido. Em seguida, adicionar 1 L de concentrado de algas (peso seco de biomassa ~ 15%). Adicione a mistura de alimentação para o FR e armazenar a 4 ° C.
- Adicionar uma cultura inicial de 5-10.000.000
- Ligue o PMT e começar a bombear a alimentação para o recipiente de algas de cultura de rotíferos. Usando o recurso de temporizador da PMT, definir a taxa de entrega de mistura de alimentação algas para que ~ 1,6 ml de mistura de alimentação algas é entregue por milhão de rotíferos na cultura, por dia. Distribuir as alimentações em pequenas porções, a intervalos regulares ao longo de um período de 24 horas; a mais frequente das mamadas, o melhor.
- Calibrar a taxa de entrega da bomba rodando manualmente na PMT por um determinado período (por exemplo, 1 min) e recolher as algas que ele bombeia durante este intervalo em um cilindro ou proveta graduada. Por exemplo, se as doses de CGP 5 ml de algas em 1 min, em seguida, a taxa de dose seria5 ml de algas / min.
- Calcula-se a taxa de alimentação diária requerida através da multiplicação do número de rotíferos presentes, em milhões, por 1,6 ml. Por exemplo, uma cultura de rotíferos com um tamanho da população de 100 milhões de rotíferos exigiria ~ 160 ml de ração por dia (100 x 1,6 mL).
- Defina a PMT para dosar a exigência alimentação diária total em intervalos regulares ao longo de um período de 24 horas. Por exemplo, a entrega de uma quantidade diária total de alimentação de 160 mL pode ser entregue em porções, uma vez a cada 3 horas ao longo de um período de 24 horas utilizando um conjunto PMT com uma taxa de bombagem de dosagem de 5 ml / min, durante 4 min, 8 vezes por dia (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 alimentações = 160 mL).
- Permitir que a cultura a crescer até que ele gera a população necessária, normalmente para 48-72 h, antes da colheita. Aos 24 h pós-arranque, adicione os filtros de partículas fio dental para o recipiente de cultura e começar a manutenção normal.
- Manutenção
NOTA: A cultura opera em uma base contínua e exige routinmanutenção e que, idealmente, deve ser realizada ao mesmo tempo em cada dia, na seguinte sequência.- Encha o FCV a 90% do volume disponível com limpo, sem cloro água doce, dosados com / L sais aquário de 10 g. Assegure-se que a água é bem misturado, e que todo o sal estar completamente dissolvido. Definir o fluxo de ar para dentro do recipiente de modo a que mantém uma "ferver". Meça a salinidade com um refratômetro e garantir que a salinidade é de 10 g / L. É fundamental para atingir este objectivo e não exceder esse valor.
- Experimente os rotíferos no CV: Certifique-se de que a cultura é bem misturado, em seguida, recolher amostras de 3 por 2 - 3 ml cada um usando uma pipeta de transferência ou autopipettor, a partir de diferentes partes da cultura. Ao combinar estas amostras em um tubo ou frasco de tamanho conveniente (por exemplo, 10 ml).
- Transferir 1 - 2 ml da amostra combinada para uma placa de Petri de modo que possa ser visualizada sob um microscópio de dissecação. Para verificar a qualidade da cultura (do comportamento de nataçãorotíferos, presença de ovos isoladas, contaminando protozoários).
- Imobilizar os rotíferos na amostra combinada restante através da adição de 100 ul de 50% de solução de iodo de Lugol a amostra. Em poucos segundos depois da adição dos Lugols, observar os rotíferos para parar de nadar. Agora, conte facilmente os rotíferos.
NOTA: O etanol, água sanitária diluída, ou o vinagre pode ser usado em lugar de Lugol. Vinagre (2 gotas / 10 ml) tem a vantagem de ser não perigosos, não perder resistência ao armazenamento em soluções de branqueamento e de iodo pode, e não fazendo com que o contrato de rotíferos, de modo que a coroa de cílios e o "pé" permanece estendido e o animais olhar mais natural. - Garantir que a amostra é bem misturado (rotíferos imobilizadas vai resolver rapidamente), em seguida, tomar rapidamente uma ml subamostra ~ 2 em uma pipeta de plástico e dispensam 1 ml em uma contagem de slides Sedgewick-Rafter (20 x 50 quadrados de 1 mm) (Figura 2 ). Usando um microscópio de dissecação ou composto, contar os rotíferos intactas e a total número de ovos associadas a estes rotíferos (Figura 2). Contagem tanto da área de slide como necessário contar ~ 100 rotíferos. Calcule o número de rotíferos por ml, e gravar isso em uma planilha ou um diário de bordo.
- Colheita ~ 30% do volume dos rotíferos na cv: Remover o fornecimento de ar e filtro de fio, abrir lentamente a válvula na parte inferior da CV e permitir que a água flua para dentro de um colector de plâncton com um crivo de malha 53 | im. Recolher a água que flui para fora do fundo do colector depois de filtrar dentro de um balde ou de drenagem. Use uma suave para o fluxo moderado para evitar danos aos rotíferos. Não permita que os rotíferos para secar na tela.
- Por razões de consistência, é conveniente estabelecer o FCV com um número padrão de rotíferos cada dia. Portanto, com base no volume CV densidade de rotíferos e colheita conhecido, ajustar o volume total de FCV para alcançar uma densidade final coerente (por exemplo., 1500 rotíferos / ml). Adicione o roti colhidaferências ao FCV: Gentilmente transferir os rotíferos a partir da tela da coleção utilizando um frasco de lavagem preenchido com água salgada limpo (10 - 15 g / L). Inverter a tela sobre o FCV e lavar os rotíferos no FCV com um fluxo suave de água salgada. Inicie a PMT para entregar alimentos para animais (~ 1,57 ml por milhão de rotíferos por dia) para o FCV.
- Esfregue todo o interior do CV com uma escova de nylon limpo e macio ou uma almofada matagal.
- Fazer uma nova mistura de 15 g / L de água, adicionando a quantidade apropriada de sal a uma quantidade medida de água RO limpos em um balde de 5 galões para substituir o volume de água perdida para a colheita. Adicionar o sal à água no balde e agita-se vigorosamente até que esteja completamente dissolvido, e em seguida, adicionar ao CV.
- Usando um spray de alta pressão em uma pia, lavar o filtro fio até que ele esteja livre de detritos, e, em seguida, devolvê-lo ao CV.
- Ajustar as taxas de alimentação de algas entregue ao CV, alterando a duração de cada evento de dosagem, de acordo com a contagem diária de rotíferos / ml.Use os cálculos apresentados no passo 1.3.8, acima, para determinar a quantidade adequada de alimentação para ser entregue.
- Aproximadamente 24 horas mais tarde, repita o processo. Comece a colheita das rotíferos restantes no FCV (que não eram necessários para o dia anterior) da mesma maneira como descrito acima (etapas 1.4.2 - 1.4.10). Concentrá-las em 2 L de água fresca e limpa sem cloro (5 g / l de sal). Estes podem ser armazenados a 4 ° C, como uma fonte de apoio, ou usado para alimentar fases posteriores de peixe, para além do que é descrito neste protocolo.
NOTA: Este protocolo permite até 2 - 3 dias de manutenção de cultura reduzida (com alimentação automática normal), porque os rotíferos no CV pode tolerar a omissão de colheitas sem consequências graves.
2. A policultura
- Configuração
- Coletar embriões de peixe-zebra de um evento de desova por vazamento embriões gerados através de um coador de chá e, em seguida, enxaguar cuidadosamente com fis estéreish de água (ou qualquer outra fonte de não-contaminada da solução apropriadamente condicionado, por exemplo, meio de embrião, E3, etc.) a partir de um frasco de lavagem em placas de Petri.
- Incubar os embriões a 25 - 28 ° C em placas de Petri a uma densidade de 40 - 50 embriões por placa durante 5 dias.
- Começar a fase de policultura no dia 5 pós-fertilização, ou quando maior do que 90% das larvas eclodidas natação são activamente-se na coluna de água.
- Inoculação
- Adicionar 500 ml de cultura de rotíferos directamente a partir do FCV a um tanque de viveiro 3,5 L; inclusão de água cultura de rotíferos fornece alimentação de algas que mantém o conteúdo nutricional dos rotíferos durante policultura.
- Delicadamente despeje a larvas de uma placa de Petri para o tanque viveiro. Assegure-se que nenhuma larva permanecem no prato.
- Adicionar 500 ml de água limpa e peixes condicionado a partir de um sistema de recirculação de água ou fonte dedicada ao tanque para atingir um volume final de 1 L e um s definitivaalinity de 5 g / L.
NOTA: Este salinidade é fundamental, porque a sobrevivência larvas do peixe será negativamente impactada se a salinidade é> 7 g / L e sobrevivência rotifer será negativamente impactada se a salinidade <2 g / L.
- Fase policultura
NOTA: A fase policultura deve durar até 4 dias após a inoculação (de um total de 5 dias, correspondendo a 5-9 dias pós-fertilização).- Observe a policultura tanque pelo menos uma vez por dia durante este período para garantir que os rotíferos e peixes estão presentes e em crescimento. Certifique-se de que os rotíferos são visíveis em toda a coluna de água. Certifique-se de que os os fishs também são visíveis na coluna de água, nadando entre os rotíferos.
- Iniciar o fluxo normal de água através do tanque. Coloque uma tela ou defletor sobre o porto de drenagem para garantir que as larvas não são lavadas para fora do tanque.
NOTA: No final desta fase, o peixe vai ser grande o suficiente para consumir itens maiores presas, como Artemiaitens de alimentação náuplios ou processados na faixa de tamanho de 75-125 mm.
NOTA: As dinâmica das populações de rotíferos dentro de um tanque de policultura representante foram medidos por amostragem / rotíferos contando a partir do tanque da mesma maneira como descrito nos passos 1.4.2 - 1.4.5. Isto foi realizado uma vez por dia desde o início da fase de policultura até que foi completada.
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Representative Results
O sistema de cultura de rotíferos contínuo descrito aqui é dinâmica, e é normal que os números de rotíferos a flutuar numa pequena extensão ao longo do tempo se há variações nas taxas de alimentação e de colheita diárias. A população das rotíferos em uma das culturas activas nas instalações de aquacultura do Hospital de Crianças de Boston, mantida na forma descrita acima, foi monitorizado durante 30 dias (Figura 3). A densidade da cultura médio durante este período foi de 932 ml / rotíferos, com um máximo de 1.330 ml / rotíferos e um mínimo de 510 rotíferos / ml. Isto representa o desempenho típico de uma cultura de rotíferos mantidos de acordo com este protocolo.
A dinâmica da população de rotíferos em um tanque com a policultura de peixe-zebra é mostrado na Figura 4. Um tanque de peixes 3,5 L foi inoculado com 500 ml de cultura de rotíferos a FCV, 500 mL de F esterilizadoágua ish, e 40 dias de idade 5 de tipo selvagem (estirpe Tubingen) larvas, para demonstrar como rotíferos e peixe-zebra executar em um tanque de policultura típico. A população de rotíferos no tanque de policultura pico no segundo dia com uma densidade de 747 / ml rotíferos (Figura 4). A densidade dos rotíferos no tanque de policultura diminuiu durante o período de 5 dias de policultura a um mínimo de 481 rotíferos / ml no dia 5. No entanto, a densidade de rotíferos significativo ao longo de todo o período foi de 589,4 rotíferos / ml, e o valor mínimo de 481 rotíferos / mL é de aproximadamente 10 vezes maior do que a densidade de rotíferos, no final do período de policultura em trabalho previamente publicado 12.
Crescimento Zebrafish durante o período de cinco dias é mostrado na Figura 5. O peixe apresentou um crescimento estável cada dia, a partir de um comprimento total médio de 3.904 mm ± 0,063 SEM quando eles foram adicionados ao tanque de policultura para um comprimento total médio de 5,423 ± 0,063 SEM ligaro último dia da fase de policultura. A sobrevida foi de 95% (38/40).
Parâmetros de qualidade da água foram medidas diariamente no tanque de policultura representativa, e estão apresentados na Tabela 1. Os valores destes parâmetros são semelhantes aos trabalhos previamente publicados 12, e são condições que são favoráveis para o crescimento e sobrevivência de ambos os rotíferos e o peixe durante o período de 5 dias da policultura.
| Dia | Dia | Salinidade | TAN | NO2 | NO3 | pH | Alcalinidade | Dureza | Temperatura |
| (Real) | (pós-fertilização) | g / L | mg / L | mg / L | mg / L | mg / L (CaCO 3) | mg / L (CaCO 3) | ° Celsius </ td> | |
| Segunda-feira | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23,2 |
| Terça-feira | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23,3 |
| Quarta-feira | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22,3 |
| Quinta-feira | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22,8 |
| Sexta-feira | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22,2 |
Tabela 1. Parâmetros de Qualidade da Água iRepresentante na Zebrafish policultura Tank.
Figura 1. Configuração Rotifer Cultura Legenda:. Cultura Veículo (CV), desabastecimento dos silos Cultura Vessel (FCV), Air Supply (AS), Floss Filtro de Partículas (FPF), Alga de alimentação Mistura (AFM), de alimentação do reservatório (FR), Metering Programável Timer (PMT). As linhas sólidas representam a entrega de alimentação algas. As linhas tracejadas representam a entrega de ar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Enchimento de um Sedgewick-Rafter Contando Slide. Por favor clique aqui para ver umaversão maior desta figura.
. Figura 3. Rotifer dinâmica populacional em cultura ao longo de um período de 30 dias Legenda: O número de rotíferos contados (fêmeas) + ovos por ml é no eixo dos x. O número de dias em cultura está no eixo-y. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Rotifer Population Dynamics durante um dia policultura 5 Legenda:. O número de rotíferos contados (fêmeas) + ovos por ml é no eixo dos x. O número de dias em policultura é no eixo dos y. Por favor clique aqui para view uma versão maior desta figura.
. Figura 5. Crescimento Zebrafish durante uma policultura cinco dias Legenda: Os valores são comprimento total médio em milímetros; barras de erro representam o erro padrão da média (EPM). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A implementação bem sucedida do método policultura rotifer para a alimentação de peixes-zebra larval precoce exige protocolos eficazes para duas tarefas: o estabelecimento e manutenção de um sistema de cultura de rotíferos contínua para alimentar os peixes, e cultura de primeira alimentação larvas do peixe junto com rotíferos no mesmo tanque.
A configuração para um sistema de produção de água salgada rotifer contínua para os laboratórios de peixe-zebra primeiro descritos por Lawrence e co-autores 14 foi alterado e completado em uma série de maneiras para torná-lo tanto mais robusta e universal na sua aplicação. O novo protocolo incorpora melhorias tanto no equipamento e metodologia.
O sistema de armazenamento para a mistura de alimentação algas agora emprega frascos utilizados em sistemas de produção de catfish 15 eclosão. Armazenamento do alimento para animais nestes frascos de fundo redondo facilita a mistura completa do alimento para animais de algas, de modo que não se aglutinam ou estratificar e levar a entupirging de linhas de distribuição, um problema que freqüentemente assolado o protocolo original. Da mesma forma, a utilização de uma bomba / medição de tudo-em-um temporizador programável reduz o número total de componentes, e simplifica o fornecimento doseado de alimentação para os rotíferos. Além disso, permite a dosagem de ração para as rotíferos numa base horária ao longo do período de 24 horas, o que é preferível, menos alimentações maiores porque a alimentação é assimilada de forma mais eficiente.
Um método para a contagem de rotíferos que permite o ajuste fino da entrega de alimentação para a cultura de rotíferos foi incluído neste protocolo. Alimentando os rotíferos com base numa avaliação tempo exato, real de seu tamanho populacional garante, a produção de alto nível constante. Um secundário Veículo desabastecimento dos silos Cultura também foi adicionada ao protocolo. Um sistema de cultura contínua pode produzir um excesso diário de dezenas de milhões de rotíferos além do que é necessário para o mesmo uma grande operação de berçário, devido a variações na atividade berçário. Este desabastecimento dos silos CuLTURE navio é usado para manter os rotíferos para inoculação diária de policulturas, e os rotíferos restantes podem ser alimentados como um suplemento nutricional de alta qualidade para estágios juvenis larvais precoces e mais tarde de peixes. A salinidade reduziu (10 g / L) no FCV também pré-acclimates os rotíferos às condições nos tanques de policultivo, de modo que eles mantêm atividade de natação vigorosa quando transferidos.
É importante ressaltar que essas alterações para o protocolo de rotíferos cultura resultem em melhorias na abordagem policultura dirigir, especialmente no que diz respeito ao volume de trabalho. O método anterior publicada por Best e co-autores envolvidos não só a inoculação inicial de rotíferos no dia 5, mas também adições diárias de rotíferos até a fase de policultura estática terminou no dia 9 12. A média de densidade de rotíferos durante este período atingiu um pico de 333 rotíferos / ml no dia da inoculação e terminou abaixo de 50 rotíferos / ml no término da fase de policultura no dia 9 12. Em contraste, O protocolo actual mantém densidades muito mais elevadas durante todo, tipicamente a partir de ~ 665 / ml rotíferos, e terminando com ~ 481 rotíferos / ml no dia 9.
Há dois fatores que permitem estas densidades de rotíferos muito mais elevados. 1) A robustez global da cultura de rotíferos utilizado para inoculação é muito maior. Além disso, a etapa de inoculação da revista policultura com volumes iguais de algas / rotíferos a 10 g / l de salinidade e ~ 0 g / l de salinidade peixes de água, resulta em um intermediário salinidade de 5 g / L que é mantida ao longo de policultura. Começando com um maior volume total de água (1 L) também é mais favorável ao crescimento e sobrevivência de rotíferos nos tanques de policultivo. No método previamente publicado, mais baixas densidades de rotíferos partida em um volume menor exigiu adições diárias de rotíferos para repor as perdas por atrito (presumivelmente devido à má qualidade da água) e do consumo através do desenvolvimento de larvas de peixes. Os resultados destes ajustamentos do protocolo Dramatically reduzir entradas de trabalho (uma alimentação durante 4 dias em comparação com 4 refeições em 4 dias com o método anterior). Crescimento larval e desempenho sobrevivência ao longo do período inicial de cinco dias policultura é comparável à que anteriormente publicado 12.
A produtividade de culturas de rotíferos é necessariamente limitada pela entrada de alimentação. Rotíferos densidades de 2,000 - 3,000 / ml pode ser conseguido com estes métodos simplesmente através do aumento da distribuição da ração. Quando rotíferos rendimento por unidade de alimentação é conhecida, a taxa de alimentação pode ser ajustada para corresponder às necessidades de produção de rotíferos projectadas. Durante fins de semana e feriados, a alimentação pode ser reduzida e colheitas omitidos por um dia ou dois sem prejudicar os rotíferos, embora o seu potencial produtivo será abaixo do ideal até que a alimentação diária normal e colher currículos de rotina.
Quando há uma necessidade imprevista para mais rotíferos do que o habitual, uma parcela maior da população pode ser colhida sem prejudicar o cultura, mas dependendo do volume da colheita da cultura pode necessitar de uma ou mais dias para recuperar a sua densidade normal. Se a procura de rotíferos será reduzido para mais do que um ou dois dias, a produção é mais reduzida através da redução da distribuição da ração, em vez de diminuir a colheita. A taxa de colheita de pelo menos 25% / dia mantém um perfil de idade mais jovem rotíferos de modo que os rotíferos são mais vigorosa e fecundo, melhorando o seu desempenho nos tanques de policultura.
Este protocolo pode ser facilmente adaptado para escalas menores para as instalações mais pequenas de peixe-zebra. Por exemplo, uma cultura de 15 L, que pode ser convenientemente configurado em um balde de 5 galões dos EUA padrão (20 L) com a mão-de alimentação duas vezes por dia, pode facilmente alcançar uma densidade de 1.000 / ml rotíferos. A utilização de uma bomba de alimentação permite densidades de 2.000-3.000 / ml. Um único balde colhidas em 30% / dia, portanto, pode fornecer 5-15 milhões de rotíferos / dia, o suficiente para iniciar a 10 - 30 policulturas. Dois baldes podem ser utilizados da mesma CV + FCV protocolo como descrito umbove. Um buffer algas + controlador + amônia pH alimentação pré-mistura está disponível (ver quadro específico de reagentes / Equipamentos), que é conveniente para aplicações em pequena escala. Ele tem uma viscosidade suficiente para que as células de algas não se contentar-se rapidamente e por isso não requer mistura contínua no reservatório de alimentação.
Se uma queda da produtividade da cultura de rotíferos, ou um acúmulo incomum de rotíferos mortos é encontrado na cultura, todos os parâmetros de qualidade da água (temperatura, salinidade, pH, NH3 concentração) devem ser verificados. Plicatilis Brachionus normalmente carrega seus ovos até que choquem, ea presença de muitos ovos não acopladas (que normalmente não Hatch) na cultura é um sinal de stress, mais frequentemente devido a amônia acumulada.
Se a água cultura de rotíferos é um verde mais intenso do que o habitual, em seguida, a taxa de alimentação é demasiado elevado ou os rotíferos não estão consumindo alimentos em sua taxa de costume. Normalmente, isso é causado por qualquer um fator de estresse, ou a cultura tem sido colheita excessiva, sem ajustar taxa de alimentação de acordo com a população reduzida. Em culturas densas é normal para uma coloração marrom a acumular na água como pigmentos de algas são metabolizados pelos rotíferos.
O uso de rotíferos água salgada durante a primeira fase de alimentação tem sido amplamente adotada por toda a comunidade de pesquisa zebrafish desde que o método foi publicado pela primeira vez em 2010 12. As modificações feitas no método policultura criação que são descritas neste protocolo vai permitir que um número ainda maior de laboratórios para adotar essa abordagem, independentemente da escala. Esses avanços são oportunas; desenvolvimentos em tecnologia knockout gene (ex., CRISPR, TALENS, etc.) para peixe-zebra vai exigir protocolos de criação racionais e eficientes para crescer milhares de novas estirpes de peixes geneticamente modificados para utilização em vários campos da ciência.
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Disclosures
Henry CE é empregado por Reed Maricultura, Inc., uma empresa que fornece rotíferos, concentrados de algas, e outros suprimentos para os mercados amadores da aquicultura e da pesca.
Acknowledgments
O cuidado e uso de peixes gerado por resultados representativos descritos neste protocolo foi realizado em plena conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal Institucional do Hospital Infantil de Boston, protocolo nº 14-05-2673R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
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