Introduction
Данио (Danio rerio) является выдающимся лабораторным животным используется в растущем числе научных дисциплин, в том числе, но не ограничиваясь генетики развития, токсикологии, поведения, аквакультуры, регенеративной биологии и моделирования многих человеческих расстройств 1 - 5. Хотя вид сравнительно легко поддерживать в лаборатории, существует ряд проблем управления, связанных с их культурой 6. Наиболее известным из них является личиночной разведение, особенно когда рыба впервые начинают кормить после инфляции газ мочевого пузыря 7. В нормальных условиях, контролируемых, это событие происходит в развития ~ 5 дней после оплодотворения (DPF), с учетом следующих 3 - 5 дней роста является особенно критической 7. Центральный техническая трудность на этом этапе является адекватно отвечать питательные требования первого личинок кормления - элементы подачи должна быть соответствующего размера, Digesвержены, привлекательный, и доступны на почти постоянной основе, не создавая чрезмерного отходов в культивирования танков. Исторически это было достигнуто, как правило, путем предоставления многочисленных небольших количеств корма для рыбы в резервуарах, наряду с обычной водообмена 8,9. Хотя эти методы в какой-то степени успешными, они неэффективны, требуют высоких затрат труда, и вернуться только переменную и ограниченные темпы роста и выживания 10.
В природе, по-видимому данио личинки питаются обильными небольшой зоопланктона настоящее время в толще воды 11. По этой причине, larviculture протоколы, которые включают живые каналы, такие как Рагатесшт, коловраток и Artemia обычно наиболее эффективным 7. В 2010 году, лучшее и соавторы показали, что можно было выращивать личинок данио в статическом, солоноватой воды наряду с морских коловраток за первые 5 дней экзогенного питания 12. Этот подход, который использоватьES естественный высокая производительность коловраток культур, чтобы обеспечить достаточное, очень питательный добычу, не загрязняя воду, дает очень высокие темпы роста личинок и выживания с низкой трудоемкости 12,13. В последние годы все большее число лабораторий по всему миру приняли изменения этого протокола, и сейчас многие культивирования коловраток в непрерывном режиме, чтобы поддержать детские системы 14.
За последние несколько лет, как методы коловратки / данио поликультуры и производства коловратки были уточнены и улучшены, чтобы стать более стандартизированными и легко масштабируемым. Эта статья предусматривает шаг за шагом инструкции для 1) непрерывный и надежный производства коловраток и 2) создание коловратки / данио системы поликультуры используется для поддержки высоких темпов роста рыбы в течение первых 5 дней экзогенного питания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Коловратки Культура
- Основные компоненты системы культуры, используя сосуд 100 л культуры
- Соберите все компоненты, необходимые для установки коловраток культуры. Установка коловраток культура состоит из сосуда для культивирования (CV), чтобы расти коловраток; подобный сосуд для поддержания feedout коловраток (feedout культура сосудов, FCV); с круглым дном вылупления банку (поток водохранилище, FR) для хранения корма водоросли смеси (АСМ); подачи воздуха (АС) для аэрации резюме, FCV и FR; перистальтический насос с таймером замера (ФЭУ) для управления доставку корма водорослей в CV и FCV; и фильтр нить частиц (FPF), который сидит внутри CV.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полный список расходных материалов и компонентов обеспечивается в список материалов.
- Соберите все компоненты, необходимые для установки коловраток культуры. Установка коловраток культура состоит из сосуда для культивирования (CV), чтобы расти коловраток; подобный сосуд для поддержания feedout коловраток (feedout культура сосудов, FCV); с круглым дном вылупления банку (поток водохранилище, FR) для хранения корма водоросли смеси (АСМ); подачи воздуха (АС) для аэрации резюме, FCV и FR; перистальтический насос с таймером замера (ФЭУ) для управления доставку корма водорослей в CV и FCV; и фильтр нить частиц (FPF), который сидит внутри CV.
- Конфигурация
- Поднимите резюме и FCV на стенде или столе так, что культуры могут быть легко собраны с помощью дренажный штуцер в сборник продолжениеainer (Рисунок 1). Использование гибкий шланг подачи воздуха для подключения как к длине жесткой трубке в каждом культуральном сосуде. Убедитесь, что трубка достаточно долго, чтобы подавать воздух в нижней части CV или FCV.
- Использование воздушной линии малой мощности для подключения как к длине жесткой трубке, который простирается до нижней части FR, содержащей AFM. Установите клапан в каждой воздушной линии для регулирования потока воздуха. Подключите FR на ФЭУ с доставкой корма трубки, и запустить трубопровод от ФЭУ в отверстие, просверленное в стороне CV / FCV, ближе к началу. Рисунок 1.
- Запускать
- Заполните культурального сосуда до 90% доступного объема с обратным осмосом воды (RO). Если РО не доступен, используйте чистую, дехлорированию муниципальной воды; Однако, оценка риска биологической защиты должны быть выполнены, чтобы гарантировать, что никакие потенциально патогенные организмы не присутствуют в исходной воде. ПРИМЕЧАНИЕ: Такой анализ может быть проведенлюбой квалифицированный тестирования воды лаборатории.
- Доза культурального сосуда воду с аквариума соли достичь соленость 15 г / л. Установите воздушный поток в емкость так, чтобы она поддерживает "кипения", а затем медленно добавляют измеренное количество соли в сосуде для культивирования, пока не растворится полностью аэрацией. Продолжить аэрации воды в течение> 1 часа, чтобы гарантировать, что он полностью кислородом.
- Сделайте смесь корма водоросли. К 3 л чистой, свежей дехлорированию (0 частей на миллион) воды добавить 100 г NaHCO 3 и 100 г аммиака (нейтрализатор hydroxymethylsulfonate натрия). Этот последний реагент обеспечивает дополнительное преимущество нейтрализации остаточного хлора из водопроводной воды или остатков отбеливающих веществ из дезинфекции питательной оборудования. Это имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы эти соединения полностью растворяют. Затем добавить 1 л концентрата водорослей (биомассы сухого веса ~ 15%). Добавить сырьевой смеси в FR и хранят при температуре 4 ° С.
- Добавить закваски 5 - 10 млн
- Включите PMT и начать прокачку канал водорослей в коловраток сосуда для культивирования. Использование функции таймера ФЭУ, установить скорость доставки подачи смеси водорослей, так что ~ 1,6 мл водорослей исходной смеси подается на миллион коловраток в культуре, за день. Распределите кормление небольшими порциями через равные промежутки времени в течение периода 24 ч; Чем чаще кормления, тем лучше.
- Калибровка скорости доставки насоса вручную поворотом на ФЭУ в течение установленного периода (например, 1 мин) и собирают водоросли, что насосы в течение этого интервала в мерный цилиндр или стакан. Например, если в дозах PMT 5 мл водорослей в 1 мин, затем дозы были бы5 мл водорослей / мин.
- Рассчитать необходимое ежедневное скорость подачи путем умножения количества коловраток, присутствующих в миллионах, в 1,6 мл. Например, коловратка культура с численности населения 100 млн коловратках потребует ~ 160 мл корма в сутки (100 х 1,6 мл).
- Установите PMT дозировать общую суточную потребность корма на регулярные промежутки времени в течение периода 24 ч. Например, доставка из ежедневного количества корма 160 мл может быть доставлено в порциями каждые 3 ч в течение 24 ч с использованием набора PMT со скоростью дозирующего насоса 5 мл / мин в течение 4 мин, 8 раз в день (5 мл / мин х 4 мин = 20 мл х 8 кормление = 160 мл).
- Разрешить культура расти, пока не генерирует необходимую населения, как правило, в течение 48 - 72 ч, до сбора урожая. В 24 ч после запуска, добавьте ваты фильтры частиц в сосуд для культивирования и начать нормальную обслуживания.
- Обслуживание
Примечание: Культура работает в непрерывном режиме и требует Routinе технического обслуживания, что в идеале должна быть выполнена в то же время каждый день, в следующей последовательности.- Заполните FCV до 90% доступного объема чистой, дехлорированная пресную воду, которым вводили 10 г / л аквариумной соли. Убедитесь, что вода хорошо перемешивается, и что все соли полного растворения. Установите поток воздуха в сосуд таким образом, что он поддерживает "кипеть" подвижного. Измерить соленость при помощи рефрактометра и гарантировать, что соленость 10 г / л. Это имеет решающее значение для достижения этой цели и не превышать его.
- Образец коловраток в резюме: Убедитесь, что культура является также смешанные, затем собрать 3 образца в 2 - 3 мл каждого помощью пипетки передачи или autopipettor, из разных частей культуры. Объедините эти образцы в трубке или флакон удобного размера (например, 10 мл).
- Передача 1 - 2 мл комбинированного образца на чашку Петри таким образом, чтобы его можно визуализировать при вскрытии микроскопом. Проверьте качество культуры (плавание поведение изколовратки, наличие отдельных яиц, загрязняя простейшие).
- Иммобилизации коловраток в оставшихся в сочетании образца добавлением 100 мкл 50% -ного раствора йода Lugols к образцу. В течение нескольких секунд после добавления Lugols соблюдать коловраток, чтобы остановить плавание. Теперь, легко подсчитать коловраток.
Примечание: этанол, разбавленный отбеливатель или уксус можно использовать вместо Lugols. Уксус (2 капли / 10 мл) имеет преимущества быть неопасные, не теряя силы в хранении как отбеливатель и йода решений может, и не делает договор коловратки, поэтому корона ресничек и "ноги" остаются продлен и животные выглядят более естественно. - Обеспечить, чтобы образец хорошо перемешивается (иммобилизованные коловратки будет быстро оседают), а затем быстро принимать мл подвыборку ~ 2 в пластмассовом пипетки и выдаваемых 1 мл в Седжвик-стропильных подсчета слайд (20 х 50 1 мм квадраты) (рис 2 ). Использование рассекает микроскоп или соединение, рассчитывать неповрежденные коловраток и тОБЩИЙ количество яиц, прикрепленных к этим коловраток (рисунок 2). Граф, как большая часть области, как слайд-стоит рассчитывать ~ 100 коловраток. Рассчитать количество коловраток в мл, и записать это в таблице или журнале.
- Урожай ~ 30% от объема коловраток в резюме: Удалить подачу воздуха и мулине фильтр, медленно откройте клапан в нижней части резюме и дайте воде стечь в планктона коллектора с сито 53 мкм. Сбор воды из нижней части коллектора после фильтрации в ведро или слив. Используйте нежный умеренной потока, чтобы избежать повреждения коловраток. Не позволяйте коловратки сушить на экране.
- По соображениям согласованности, целесообразно установить FCV со стандартным номером коловраток каждый день. Таким образом, на основе известной плотности CV коловратка и сбора объема, регулировать громкость общее FCV до получения однородной конечной плотности (например., 1500 коловратки / мл). Добавить заготовленную ротиFERS к FCV: Осторожно передачи коловраток с экрана сбора использования промывающего бутылку с чистой соленой водой (10 - 15 г / л). Обратить экран над FCV и мыть коловраток в FCV с нежным потоком соленой воды. Начните PMT доставить корм (~ 1,57 мл на миллион коловраток в день) в FCV.
- Скраб весь внутренность CV с чистой, мягкой нейлоновой щеткой или чистящей площадки.
- Создать новую смесь 15 г / л воды путем добавления соответствующего количества соли в отмеренное количество чистой воды обратного осмоса в 5 галлонов ведро, чтобы заменить объем воды теряется урожай. Добавьте соль к воде в ведре и перемешать энергично, пока она полностью не растворится, а затем добавить к CV.
- Использование спрей высокого давления в раковине, промыть фильтр мулине, пока он не свободен от мусора, а затем вернуть его в резюме.
- Регулировка скорости подачи водорослей подаваемого в CV, изменяя продолжительность каждой дозирующей случае, в соответствии с ежедневной подсчета коловраток / мл.С помощью расчетов, приведенные в шаге 1.3.8, выше, чтобы определить соответствующее количество корма будет доставлено.
- Примерно 24 часа спустя, повторить процесс. Сначала уборки коловраток оставшиеся в FCV (которые не были необходимы для предыдущий день) таким же образом, как описано выше (этапы 1.4.2 - 1.4.10). Концентрат их в 2 л свежей, чистой воды (дехлорированию 5 г / л соли). Они могут храниться при температуре 4 ° С в качестве резервного питания, или на корм поздние стадии рыбы, за то, что описано в данном протоколе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол позволяет до 2 - 3 дней сниженным содержанием культуры (с нормальной автоматической подачи), потому что коловратки в CV может терпеть бездействие урожаев без серьезных последствий.
2. поликультуры
- Настроить
- Сбор эмбрионов данио из события нереста путем заливки породил эмбрионов через ситечко, а затем аккуратно промывая стерильных мксч воды (или любой другой, не загрязненных источником соответствующим условного раствора; например, эмбрион среднего, Е3, и т.д.) из промывной бутылки в чашках Петри.
- Инкубируйте эмбрионов на 25 - 28 ° C в чашках Петри при плотности 40 - 50 эмбрионов на чашку в течение 5 дней.
- Начните фазу поликультура на 5-й день после оплодотворения, или когда больше, чем 90% вылупившихся личинок активно плавать в толще воды.
- Прививка
- Добавить 500 мл коловратки культуры непосредственно из FCV до 3,5 л питомника бак; включение коловраток культуры воды обеспечивает подачу водорослей, который поддерживает содержание питательных из коловраток во поликультуры.
- Аккуратно влить личинок из одной чашки Петри в детском бака. Убедитесь, что нет личинки остаются в блюдо.
- Добавить 500 мл чистой, кондиционированной рыбы воды из системы рециркуляционного или специального источника воды в бак для достижения конечного объема 1 л и окончательное Salinity 5 г / л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот соленость важно, потому что данио выживание личинок будет негативному воздействию, если соленость> 7 г / л и выживания коловраток будет негативному воздействию, если соленость <2 г / л.
- Поликультуры фаза
ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза поликультура должен длиться до 4 дней после инокуляции (в общей сложности 5 дней, что соответствует 5-9 дней после оплодотворения).- Соблюдайте поликультура бак по крайней мере, один раз в день в течение этого периода для того, чтобы коловратки и рыбы присутствуют и растет. Убедитесь, что коловратки могут видеть по всей толще воды. Убедитесь, что в Fishs также видны в толще воды, плавая среди коловраток.
- Начните нормальный поток воды через бак. Поместите экран или перегородка над сливной порт для обеспечения личинок не вымываются из резервуара.
Примечание: В конце этого этапа, рыба будет достаточно большим, чтобы потреблять крупные предметы, такие как добычу Artemiaнауплии или обработанные предметы подача в диапазоне размеров от 75 - 125 мкм.
Примечание: динамика коловратка населения внутри представительного поликультуры бака были измерены путем отбора проб / подсчета коловраток из резервуара таким же образом, как описано в шагах 1.4.2 - 1.4.5. Это было сделано один раз в день с начала фазы поликультуры, пока она не была завершена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Система непрерывного коловраток культура описано здесь является динамичным, и это нормально для числа коловраток колебаться в небольшой степени в течение долгого времени, если есть изменения в повседневной ставки кормления и уборки. Население коловраток в одном из активных культур в объектах аквакультуры в больнице Бостона Детский, поддерживается в порядке, описанном выше, наблюдали в течение 30 дней (Рисунок 3). Плотность культуры среднее течение этого периода было 932 коловратки / мл, с максимумом 1330 коловратки / мл и не менее 510 коловратки / мл. Это представляет типичный производительность коловратки культуры обслуживания в соответствии с этим протоколом.
Динамика населения коловраток в поликультуры бак с данио показано на рисунке 4. 3,5 л аквариум вносили 500 мл коловратки культуры из FCV, 500 мл стерилизованной Fиш воды и 40 5-дневных дикого типа (штамм Тюбинген) личинки, чтобы продемонстрировать, как коловратки и данио выполнить в типичном поликультуры бака. Население коловраток в поликультуры бака достигла своего пика на второй день с плотностью 747 коловратки / мл (рисунок 4). Плотность коловраток в поликультуры бака снизился на 5 дней поликультуры к минимуму 481 коловратки / мл в день 5. Однако, средняя плотность коловраток в течение всего периода было 589,4 коловратки / мл, а минимальная стоимость 481 коловратки / мл ~ 10 раз, что плотность коловраток в конце поликультуры период в ранее опубликованной работе 12.
Данио рерио рост в течение пяти дней показано на рисунке 5. Рыба показали устойчивый рост каждый день, от среднего общей длиной 3.904 мм ± 0,063 SEM, когда они были добавлены к поликультуры бака к средней общей длины 5.423 ± 0,063 SEM нав последний день этапа поликультуры. Выживание было 95% (38/40).
Параметры качества воды были измерены в день в представительстве поликультуры бака, и приведены в таблице 1. Значения этих параметров аналогичны ранее опубликованной работе 12, и представляют собой условия, которые способствуют росту и выживанию обоих коловраток и рыбы во время 5-дневный период поликультуры.
| День | День | Соленость | TAN | NO 2 | НЕТ 3 | pH | Щелочность | Твердость | Температура |
| (Факт) | (после оплодотворения) | г / л | мг / л | мг / л | мг / л | мг / л (СаСО 3) | мг / л (СаСО 3) | ° по Цельсию </ TD> | |
| понедельник | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| вторник | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23.3 |
| Среда | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22.3 |
| Четверг | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22,8 |
| Пятница | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
Таблица 1. Параметры качества воды яна Представительство Данио рерио поликультуры Танк.
Рисунок 1. Коловратки Культура Настройка Легенда:. Культура судно (CV), Feedout Культура судно (FCV), воздуха (АС), Частичный фильтр зубочистки (FPF), водоросли кормовой смеси (АСМ), поток водохранилище (FR), программируемый замер Таймер (ФЭУ). Сплошные линии представляют доставку корма водоросли. Пунктирные линии представляют подачу воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Заполнение Седжвик-стропильных Счетной Slide. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотретькрупная версия этой фигуры.
. Рисунок 3. Динамика численности населения коловраток в культуре более 30-дневного периода Легенда: Количество подсчитанных коловраток (женщины + яйца) на мл на оси абсцисс. Количество дней в культуре на оси у. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Динамика населения коловраток в течение 5 дней поликультура Легенда:. Число подсчитанных коловраток (женщины + яйца) на мл на оси абсцисс. Количество дней в поликультуры находится на оси у. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы VIEW большую версию этой фигуры.
. Рисунок 5. данио роста в течение 5 дней поликультура Легенда: Значения среднее общая длина в мм; ошибка бары представляют стандартную ошибку среднего (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успешная реализация метода поликультуры коловраток для кормления личинок данио раннего требует эффективных протоколов для двух задач: установление и поддержание системы непрерывного коловраток культуры, чтобы накормить рыбу, и культивирование первой кормления личинок данио вместе с коловраток в одном танке.
Установка для непрерывного соленой коловратки производственной системы для лабораторий данио, впервые описанных Лоуренса и соавторов 14 была изменена и расширена в несколькими способами, чтобы сделать его более устойчивым и универсальным в и применения. Новый протокол включает улучшения и в оборудовании и методологии.
Система хранения для кормовой смеси водорослей в настоящее время работают вылупления банки, используемые в производственных системах сом 15. Хранение корма в этих круглым дном банки облегчает тщательное смешивание сырья водорослей, так что она не стратифицировать или комок и привести к засорениюGing линий доставки, проблема, которая часто страдает оригинальный протокол. Точно так же, использование / насос-дозатор все-в-один программируемый таймер сокращает общее число компонентов и упрощает отмеренного доставку кормов к коловраток. Это также позволяет дозировать корма на коловраток на почасовой основе в течение срока 24-часового, который предпочтительно меньшим числом более крупных кормлений, потому что корма усваивается более эффективно.
Способ подсчета коловраток, что позволяет тонкую настройку раздачи корма на коловраток культуры были включены в этот протокол. Кормление коловраток, основанные на точной оценке, реальный времени их численности обеспечивает устойчивую, производство на высоком уровне. Вторичный Feedout Культура судно также было добавлено к протоколу. Непрерывной системы культура может производить ежедневный избыток десятки миллионов коловратках сверх того, что необходимо для даже большой работы питомника, из-за изменений в питомнике активности. Это Feedout Culture судно используется для хранения коловраток для ежедневного прививки поликультур, а остальные коловратки могут подаваться как высокого качества пищевая добавка для поздних личиночных и ранних стадиях несовершеннолетних рыб. Снижение солености (10 г / л) в FCV также предварительно acclimates на коловраток в условиях в поликультура танков, так что они поддерживают активную деятельность плавание при передаче.
Важно отметить, что эти изменения в протокол культивирования коловраток свинца направить улучшений в подходе поликультуры, особенно в связи с трудоемкостью. Предыдущий метод опубликованные Бест и соавторов привлеченных не только первоначальный прививки коловраток в 5 день, но также ежедневные дополнения коловраток, пока статическая фаза поликультура не закончившихся 9 12 дня. Средний плотности коловраток в этот период достиг 333 коловраток / мл в день прививки и в конечном ниже 50 коловратки / мл при прекращении фазы поликультуры на 9-й день 12. В отличиеТок протокол поддерживает гораздо более высокие плотности по всему, как правило, начиная с ~ 665 мл / коловратки, и заканчивая с ~ 481 мл коловраток / 9 день.
Есть два фактора, позволяющие эти гораздо более высокую плотность коловраток. 1) общей надежности культуры коловратки, используемой для инокуляции намного больше. Кроме того, пересмотренный шаг инокуляции поликультура с равными объемами водорослей / коловраток в 10 г / л минерализации и ~ 0 г / л засоление воды рыбы, приводит к промежуточной солености 5 г / л, что поддерживается на протяжении поликультуры. Начиная с большей общего объема воды (1 л) и в большей степени способствует росту коловратки и выживание в поликультура танков. В ранее опубликованной метода, низкая плотность отправной коловраток в меньшем объеме необходимость ежедневных дополнений коловраток для пополнения потерь от истощения (предположительно из-за плохого качества воды) и потребления путем разработки рыбы личинки. Результаты этих корректировок к протоколу dramatчески снизить трудозатраты (один питание в течение 4 дней по сравнению с 4 кормлений в 4 дня с предыдущим методом). Роста личинок и производительность выживаемости по сравнению с первоначальной 5-дневного периода поликультуры сравнима с ранее опубликованные 12.
Производительность коловраток культур неизбежно ограничивается вход подачи. Коловратка плотности 2,000 - 3,000 / мл может быть достигнуто с помощью этих методов простым увеличением доставку подачи. Когда коловраток выход на единицу корма известно, скорость подачи можно регулировать, чтобы соответствовать коловраток продукцию в прогнозируемых потребностей. Во время выходных и праздничных дней, кормление может быть снижена и урожаи опущенные в течение дня или двух без ущерба коловраток, хотя их производственный потенциал будет неоптимальным до нормального ежедневного кормления и урожай рутинных резюме.
Когда есть потребность в непредвиденных более коловраток, чем обычно, большая часть населения может быть собран без вреда кульры, но в зависимости от размера урожая культуры может потребовать день или больше, чтобы восстановить свою обычную плотность. Если спрос коловраток будет снижена более чем на день или два, производство лучше уменьшен путем уменьшения подачи доставку, а не уменьшения урожай. Скорость урожай по меньшей мере 25% / день поддерживает молодое профиль коловраток возраста, так что коловратки являются более энергичным и плодовиты, повышения эффективности их работы в поликультура танков.
Этот протокол легко адаптируется к более мелких масштабах для небольших объектов данио. Например, 15 л культуры, которые могут быть легко созданы в стандартном 5 галлон США (20 л) ведра с ручной подачи два раза в день, может быть легко достичь плотностью 1000 коловратки / мл. Использование питательного насоса позволяет плотности 2000-3000 / мл. Один ведро собирают на 30% / день, следовательно, может обеспечить 5-15 млн коловраток / день, достаточно, чтобы начать 10 - 30 поликультур. Два ведра могут быть использованы в том же CV + FCV протокола, описалБове. Водорослей + контроллер + аммиака рН буфера корма премикс доступен (см таблицу специфических реагентов / Оборудование), что удобно для небольших приложений. Он имеет достаточную вязкость, что клетки водоросли не оседают быстро и поэтому не требует постоянного перемешивания в резервуаре подачи.
Если снижение производительности коловраток культура, или необычный накопление мертвых коловраток находится в культуре, все параметры качества воды (температура, соленость, рН, NH 3 концентрация) должны быть проверены. Brachionus plicatilis обычно несет свои яйца, пока они люк, и Наличие многих одиноких яиц (которые, как правило, не люк) в культуре является признаком стресса, чаще из-за накопившейся аммиака.
Если коловраток культура вода является более интенсивным, чем обычно зеленый, то либо скорость подачи является слишком высокой или коловратки не потребляют пищу в их обычном размере. Обычно это CAиспользован любой фактор стресса, или культуры была overharvested без регулировки скорости подачи в соответствии с уменьшением населения. В плотных культурах это нормально для коричневое окрашивание накапливаться в воде, как водорослевые пигменты метаболизируется коловраток.
Использование морских коловраток в ходе первого этапа кормления был широко принят по данио научно-исследовательского сообщества, так как этот метод был впервые опубликован в 2010 году 12. Изменения, внесенные в метод поликультура выращивания, которые изложены в этом протоколе позволит еще большее количество лаборатории принять этот подход, независимо от масштаба. Эти достижения являются своевременными; события в ген-офф технологии (например,., CRISPR, Таленс, и т.д.) для рыбок данио потребует рациональной и эффективной протоколы выращивания расти тысячи новых штаммов генетически модифицированных рыб для использования в различных областях науки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ЕС Генри используется Рид марикультуры, Inc., компания, которая предоставляет коловраток, концентраты водоросли, и другие материалы для аквакультуры и рыбных любительскими рынках.
Acknowledgments
Уход и использование рыбы создается для представительных результатов, описанных в данном протоколе была выполнена в полном соответствии с руководящими принципами, изложенными Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная в больнице Бостона Детский протокол # 14-05-2673R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
- Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , CRC Press. (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
- Biology and Culture of Channel Catfish. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. 34, 634-657 (2004).
