Summary
Aquí presentamos una novela Ca 2+ -Imagenología enfoque utilizando un reportero bioluminiscente. Este método utiliza una construcción GFP-aequorina fundida que se une a Ca 2+ y emite luz, eliminando la necesidad de excitación luz. Significativamente este método permite la proyección de imagen continua de largo, el acceso a las estructuras cerebrales profundas y alta resolución temporal.
Abstract
Funcional de imágenes in vivo se ha convertido en un enfoque poderoso para estudiar la función y la fisiología de las células y estructuras de interés del cerebro. Recientemente, un nuevo método de Ca 2+ -Imagenología usando el reportero bioluminiscente GFP-aequorina (GA) se ha desarrollado. Esta nueva técnica se basa en la fusión de los genes GFP y aequorina, produciendo una molécula capaz de unirse calcio y - con la adición de su cofactor coelenterazina - emisor de luz brillante que se puede controlar a través de un colector de fotones. Las líneas transgénicas que llevan el gen GFP-aequorina se han generado para ambos ratones y Drosophila. En Drosophila, el gen GFP-aequorina se ha colocado bajo el control del sistema de expresión binario GAL4 / UAS permite la expresión específica y de formación de imágenes dentro del cerebro. Este método ha sido posteriormente demostrado ser capaz de detectar tanto hacia el interior Ca 2 + -transitorios y Ca 2+ -released de las tiendas interiores. Lo más importante es que permite una mayor duración en la grabación continua, de formación de imágenes a mayor profundidad dentro del cerebro, y la grabación en altas resoluciones temporales (hasta 8,3 mseg). Aquí presentamos el método básico para el uso de imágenes bioluminiscente para registrar y analizar Ca 2+ -Actividad dentro de los órganos de setas, una estructura central para el aprendizaje y la memoria en el cerebro de la mosca.
Introduction
El patrón y la función de la actividad dentro del cerebro y sus estructuras discretas fundamental han sido durante mucho tiempo un área de intenso estudio en el campo de la neurociencia. Tal vez algunos de los enfoques exitosos primeros utilizados para tratar este tema eran medición fisiológica directa del cambio en la actividad eléctrica - métodos embargo alternativos que permiten imágenes en vivo de los cambios en las concentraciones de tensión, de pH o calcio (como sustituto de la actividad) han traído capacidades adicionales a el estudio de la actividad neuronal 1. Las técnicas de imagen tienen una amplia gama de ventajas tales como la reducción de la invasividad y la capacidad de monitorear la actividad dentro de las estructuras cerebrales enteros. Además, en animales con genética tratables como la mosca de la fruta Drosophila, el desarrollo de indicadores de calcio codificados genéticamente, como cameleon, GCaMPs y otros 1 han permitido a los investigadores para supervisar las neuronas individuales, poblaciones neuronales y todo el cerebroestructuras. Mientras que los métodos más tradicionales fluorescentes Imagen de calcio utilizando GCaMPs (GFP fusionada a calmodulina) o FRET (PPC y YFP fusionado a calmodulina) han demostrado ser técnicas útiles que proporcionan una buena resolución espacial y temporal, el proceso subyacente de la excitación de luz genera algunas limitaciones en su experimental aplicaciones. Debido a la naturaleza de la excitación de luz, autofluorescencia, foto-blanqueo, y fototoxicidad se producen inevitablemente, que en consecuencia limita la profundidad de las estructuras que se pueden obtener imágenes, la duración de las grabaciones, así como la continuidad en tiempo real de grabación. En otras palabras, a menudo grabaciones deben realizarse intermitentemente para evitar estos efectos secundarios no deseados.
Debido a estos problemas, se han desarrollado métodos alternativos adicionales de imágenes de calcio. Uno de los métodos más prometedores es bioluminiscente de imágenes, que se basa en la luz producida a través de una reacción enzimática después de la unión de calcio. Bioluminescent de imagen no requiere de excitación de luz y por lo tanto no experimenta las mismas dificultades que imágenes de calcio convencional. El reportero Aequorina bioluminiscente - aislada de Aequorea victoria, el mismo medusas GFP a partir del cual también fue isolated- se une al calcio a través de sus tres estructuras de mano EF y sufre un cambio conformacional, que conduce a la oxidación de su cofactor coelenterazina y la liberación de la luz azul (λ = 469 nm) 2,3. Aequorina tiene una afinidad muy baja para el calcio (K d = 10 mM) que lo hace ideal para el seguimiento de los transitorios de calcio, ya que produce muy poco ruido de fondo y no interfiere con el sistema de tamponamiento de calcio intracelular 4. Aunque ecuorina se ha utilizado anteriormente para controlar el proceso de inducción neural en el huevo Xenopus 5 la luz producida es demasiado tenue para usar para formación de imágenes en tiempo real de la actividad neuronal. En un esfuerzo por abordar este desafío, Philippe Br y# 251; dejar y sus colegas del Instituto Pasteur creó una construcción genética fusión GFP y aequorina genes, imitando el estado nativo dentro de la medusa 4. Este producto gen de fusión se une al calcio nuevo a través de las tres estructuras de mano EF de aequorina, que sufre un cambio conformacional que conduce a la oxidación de la coelenterazina, que transfiere energía no radiativamente a la GFP. Esta transferencia de energía como resultado la liberación de la luz verde (λ = 509 nm) a partir de las buenas prácticas agrarias, en lugar de la luz azul de aequorina. La fusión de las buenas prácticas agrarias y aequorina también confiere una mayor estabilidad de la proteína ayuda a la proteína de fusión producen luz de 19 a 65 veces más brillante que aequorina solo 4. Utilizando un enfoque bioluminiscente en el cerebro se expande la aplicación experimental actual de imágenes de calcio tanto en términos de la duración de la grabación continua y el número de estructuras dentro del cerebro que se puede grabar. En términos generales, en el contexto del trabajo anterior significa que tanto global y una mayorvariedad de "actividad" regionalizado del cerebro puede ser monitorizado (a través del proxy de los transitorios de calcio). Más importante actividad se puede controlar por más tiempo, en un tiempo real y de forma continua, lo que se presta fácilmente a la búsqueda de una comprensión más completa de la función basal en el cerebro.
En los últimos años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado moscas transgénicas que expresan la GFP-aequorina bajo el control del sistema de expresión binario (GAL4 / UAS-GFP-aequorina) 5,6. Hemos utilizado la bioluminiscencia-GFP aequorina para registrar la actividad producida por estímulos naturales tales como aroma 7,8, así como los componentes celulares estudiadas modulan Ca 2+ -Actividad en los cuerpos de hongos siguientes estimulación del receptor de acetilcolina nicotínico mediante la aplicación directa 9. Además, también hemos utilizado GFP-aequorina hacer frente a una serie de preguntas experimentales que no han podido ser tratados previamente, como a largo plazoimágenes de los transitorios de calcio espontáneas y visualización de las estructuras cerebrales profundas 10. Más recientemente, se ha utilizado el sistema GAL4 / UAS para expresar el receptor de mamífero ATP P2X 2 11 un canal de cationes, en las neuronas de proyección (PN) y se utiliza el sistema LexA expresar GFP-aequorina en los órganos de setas (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (cortesía de B. Pfeiffer, Janelia Granja, EE.UU.). Esto nos ha permitido activar el PN por aplicación de la ATP, que a su vez activa los órganos de setas (una diana aguas abajo de la PN), imitando las condiciones más naturales, como la respuesta a un estímulo olor. En general esta técnica que combina P2X 2 y GFP-aequorina amplía las posibilidades de experimentación. En términos generales, ofrece la oportunidad de entender mejor los patrones de actividad en el cerebro, la iniciación de nuevos estudios sobre cómo los diferentes estímulos y las perturbaciones pueden alterar el patrón basal de actividad.
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Protocol
1. Preparación de las muestras
- Preparación de soluciones y configurar
- Mantenga todas las líneas de Drosophila melanogaster a 24 ° C en medio de la comida estándar. Posterior y mantenerlos a baja densidad en el vial para generar tamaño estándar y el peso de las moscas.
- Añadir 10 hembras vírgenes con 10 hombres en un frasco, dejar que ellos se aparean y transferirlos cada 2 días a un vial fresco. Luego de 10 días más tarde, cuando las moscas empiezan a eclose, cosechar las moscas todos los días. Mantenga un registro preciso de la edad de las moscas y mantenerlos en buenas condiciones.
- En el día 3, separar los machos de las hembras y tener las hembras 20 moscas por vial. Registre las moscas a los 4 o 5 días de edad.
- Preparar la solución de Ringer con las siguientes concentraciones: NaCl 130 mM, 5 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, CaCl 2 mM, HEPES 5 mM, 36 mM de sacarosa y 2 y ajustar el pH de la solución a 7,3 con precisión. Preparar soluciones de perfusión de 25 μ; M nicotina y KCl 100 mM en solución de Ringer.
- Preparar 1000 punta de la pipeta l: el uso de una punta de forma de la hoja de afeitar para una inclinación (aproximadamente 35 ° de final de la punta) y eliminar el exceso de base más allá de 1 ½ centímetros de punta.
- Caja de almacenamiento (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) de la muestra Preparar durante la incubación. Coloque dos esponjas (12 cm x 8 cm x 3 cm) saturado con agua en la parte inferior [para evitar la desecación de la muestra] por debajo de un aparato de bastidor pequeño para colocar las muestras en como se haya completado su preparación.
- Preparar muestras moscas de modo que contengan al menos 1 copia de la UAS-GFP-aequorina y una copia de una línea Gal4 para dirigir la expresión de GFP-aequorina. Línea OK107 Gal4 (una expresión de la línea de conducción principalmente en los órganos de setas) se cruza con UAS-GFP-aequorina en esta preparación.
NOTA: El interior de la caja debe ser resistente al agua y el exterior debe bloquear la luz del cuadro de entrar para evitar la degradación de coelenterazina durante la incubación.
- Mantenga todas las líneas de Drosophila melanogaster a 24 ° C en medio de la comida estándar. Posterior y mantenerlos a baja densidad en el vial para generar tamaño estándar y el peso de las moscas.
- Deberesparación de muestras
- Hielo anestesiar Drosophila transfiriéndolo a un vial de vidrio y mantener en hielo durante 2 min antes de ser trasladado al plato frío Petri para el posicionamiento de la punta de la pipeta. Preparar puntas de pipeta en papel de filtro ligeramente humedecido en 100 ml caja de Petri en el hielo bajo el microscopio de disección.
- Suavemente con unas pinzas lugar volar dentro de la punta de la pipeta.
- El uso de un cepillo de empuje suavemente y alinear mosca de tal manera que la cabeza está completamente más allá del borde de la punta y la región dorsal está parcialmente expuesta por la sección eliminado durante la conformación de la punta (Figura 2B).
- Combina un pequeño (aproximadamente 3-4 mu l) partes de los dos componentes del pegamento dental. Aplique el pegamento con cuidado alrededor de la parte delantera y trasera cabeza y el cuello hacia abajo y alrededor del borde punta de la pipeta - evitando la corona de la cabeza. Deje que el pegamento se seque durante 2 min.
- Punta Place pipeta con mosca pegada a través del agujero en la cámara de grabación (Figura 2D) y la generacióntly pulse para asegurar en su lugar.
- Combinar los dos componentes del pegamento de silicona (aproximadamente 3-4 l). Aplique el pegamento en la parte plana de la cámara a lo largo del borde donde la cámara y pipeta de punta se reúnen para evitar fugas de la solución de Ringer. Deje que el pegamento se seque durante 2 min.
- Disección
- Colocar la cinta a través del canal de perfusión, el borde corto y que se extiende a la parte posterior de la cámara.
- Coloque la cámara con la mosca en bloque de la disección bajo su vez microscopio en la lámpara fluorescente. Pipetear 1 ml de solución de Ringer en la cámara.
- Utilice bisturí fino para quitar la cutícula. Hacer incisiones paralelas de la parte posterior de la cabeza a la región de la antena. A continuación, corte a lo largo del borde de los ojos luego hacer una incisión perpendicular por encima de la antena que conecta las incisiones anteriores. Haga una incisión paralela final a que en la parte posterior de la cabeza. Utilice las pinzas cortantes finos para quitar la cutícula (Figura 2C).
- Utilice unas pinzas finas afilados para agarrar suavemente unad despejar expuesta tejido respiratorio hasta el cerebro y [fluorescente] cuerpo de setas está claramente visualizados.
- El uso de fórceps ultra fuerte para captar atención y pellizcar tejido neuroepitelial que cubre el cerebro para permitir la penetración del coelenterazina.
NOTA: Como alternativa papaína se puede utilizar para permeabilizar la neuroepithelia 9. - Usando una pipeta, lavar dos veces con solución de Ringer para eliminar los residuos de la disección y el lugar de la muestra en el cuadro oscuro.
- Pipetear 1 ml de solución de Ringer que contiene 5 mM bencil-coelenterazina en la cámara. Cierre la caja y permitir que la incubación con coelenterazina a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 hr.
2. Imaging
- Preparar
- Comience sistema de grabación: encienda el microscopio, computadora, cámara y el sistema de drenaje y sala de establecer controles ambientales de 25 ° C.
- Abrir Medición y programa Automation Explorer en el equipo. Haga clic en “ Devices and Interfaces ", a continuación, haga doble clic en" NI Motion Dispositivos "y haga clic finalmente a la derecha en" PCI-7334 "y seleccione" inicializar dispositivo ".
- Abra Fotón Imager. Crear nueva carpeta y el nombre del primer archivo de grabación. Cámara debe llegar a -80 ° C antes de sistema funcionará.
- Establecer un sistema de perfusión - añadir KCl, la nicotina y la solución de Ringer a embalses y ajustar lo que las descargas cada solución en 2 ml / min. Lavar con solución de Ringer antes de comenzar el experimento.
- Preparar la muestra
- Lugar de imágenes montaje plato bloque en el monte bajo microscopio con un aumento de 5X e insertar el tubo de perfusión en el canal a través de la punción.
- Establecer microscopio para el modo fluorescente continuación centro y traer órganos de setas (MB) en el foco. Ajuste a 20X y volver a central y el enfoque.
- Aparato de drenaje Posición sobre la piscina de drenaje, ajuste la altura de la derivación de drenaje para que la punta es sólo Above piscina, y ejecutar la solución de Ringer durante 30 segundos para asegurar un drenaje adecuado.
- Baje escudo para sellar el aparato de la luz. Utilizando el sistema automatizado de imágenes de fotones hacer ajustes precisos en el enfoque y tomar una imagen fluorescente de referencia de los MBs.
- Grabación
- Ajuste la velocidad del fotón a la velocidad de grabación deseada (de 50 ms hasta 1 seg o más). Seleccione el modo de fotones y el obturador abierto. Genotipo Record, el sexo, la edad y el número de muestras en las entradas del registro. Ajuste cajas posición de retorno de la inversión más de cáliz y cuerpos celulares (CCB) y lóbulos mediales haciendo clic en las casillas de ROI y arrastrando mientras mantiene el control.
- Record línea de base durante aproximadamente 5 a 10 min (según se desee).
- Aplicar nicotina durante 1 min. Nota iniciar / detener en el registro. Lavar con solución de Ringer para 5 min.
- Espere 5 minutos para la recuperación y preparar KCl entrada de registro y el temporizador.
- Aplicar KCl durante 1 min. Nota iniciar / detener en el registro. Lavar con solución de Ringer durante 1 min.
- Cambiaral modo fluorescente, tomar imagen fluorescente final, y apague la solución de Ringer.
- Pulse el botón "Stop". Cuadro de diálogo le preguntará para apagar el sistema. Seleccione "No" para continuar la grabación.
- Escudo abierto, sistema de drenaje movimiento, el objetivo de la lente cambie a 5X, retire el tubo de perfusión. Retire la muestra / plato de grabación desde el escenario, limpiar la lente 20X enjuagando y limpiar la lente dos veces con agua.
- Pulse el botón de reproducción en blanco en la parte superior de la ventana del programa para iniciar la siguiente grabación.
3. Análisis y Creación de Video
- Extrae los valores de fotones
- Abra el programa de análisis de fotones (por ejemplo, de Fotones Viewer) y abrir el archivo de hoja de cálculo primera muestra.
- Selecciona la pestaña de control de pantalla. Seleccione el ROI, haga clic en la región mientras mantiene el control. Ajustar el tamaño, la orientación y la forma de las regiones de interés para abarcar GFP CCB iluminada y lóbulos mediales.
- Añadir una adiciónAl retorno de la inversión haciendo clic en "Definir ROI" y haciendo clic y arrastrando en la pantalla para crear el nuevo ROI.
- Seleccione la pestaña "Película" para visualizar el video de fotones. Ajuste "width sec" y "pasos sec" si lo deseas. Reajuste la colocación ROI según sea necesario.
- Seleccionar capturas de pantalla representativas de la fluorescencia de GFP, la respuesta a la nicotina y la respuesta KCl. Imagen Goma imágenes de cosechas y en una presentación de diapositivas para su posterior análisis y comparación.
- Ajuste tanto el "ancho de seg" y "paso seg" a la velocidad de grabación en cuestión de segundos. Seleccione la longitud del análisis moviendo marcadores grises en el panel superior a la región de soporte antes de la iniciación de estímulo y justo después de finalizar la respuesta.
- Seleccione "Suspender vistas mientras se reproduce" prensa "<< REW" y pulse "PLAY>". Seleccione la pestaña "Cuenta Tabla de Tarifas" y ajustar las unidades como desee y colores de línea para que coincida con el color ROI.
- Cuando se termina el análisis, Pulse "Exportar Count Data Rate". Seleccione capturas de pantalla de combinado grabaciones CCB y la región del lóbulo medial de interés por parte de cada lado. Imagen Goma imágenes de cosechas y en una diapositiva con imágenes de respuesta. Esta diapositiva se utilizará más adelante en el análisis final.
- Ejemplo Análisis: un método para el análisis de los datos extraídos de fotones detallados
- Abrir los archivos de hojas de cálculo en la carpeta "Cuenta Tarifa exportaciones".
- Vuelva a formatear las celdas de la primera columna etiquetada tiempo para mostrar la hora en horas y minutos.
- Hacer referencia a la diapositiva correspondiente para la muestra. Retire todos los valores excepto las columnas para el tiempo y los dos representante ROI.
- Determinar la nicotina estimulación hora de inicio - disponible en el archivo de entrada de registro en el principal carpeta- eliminar datos adicionales antes de comenzar o el valor más destacado.
- Encuentra más alto valor / pico para ambos CCB y el lóbulo medial y marca / culminante.
- Determinar inicio de respuesta y tiempo final para ambosCCB y el lóbulo medial mediante la creación de una estimación usando punto de tiempo de los correspondientes representan gráficamente la respuesta en la diapositiva y seleccione valor real por el cambio en los valores en la proximidad de estos puntos. Resalte la región entre estos puntos, tanto en el CCB y lóbulos mediales. También puede utilizar una macro 9.
- Combinar todas las muestras de un grupo experimental en una nueva hoja de cálculo.
- Alinear en el pico mediante la determinación del valor de la fila es para cada valor de pico CCB. Restar los valores más bajos desde el valor más alto de fila para determinar el valor de fila aproximada en que los datos de la muestra deben ser vueltos a copiar a. Verifique que todos los valores de pico están alineados.
- Copie la hoja dos veces y eliminar cualquiera de las columnas del lóbulo medial o las columnas CCB creación de páginas de sólo el CCB o valores del lóbulo medial.
- Eliminar datos después de las todas las respuestas CCB han terminado. Crear cuatro filas etiquetadas Total de fotones, Longitud Respuesta (duración), pico de amplitud y latencia de respuesta. Copia y pega este nuevo por debajo de los originales.
- Utilice la función SUMA para determinar fotones totales durante la respuesta. Utilice la función CONTAR para determinar la longitud de la respuesta. Copia y vincular más alto celda de valor para determinar el valor pico de amplitud. Utilice la función COUNT - seleccionar desde el comienzo de la perfusión de la nicotina para el inicio de la respuesta - para determinar la respuesta de latencia.
- Los valores de copia mediante el uso de la función de enlace y se multiplican (todos excepto amplitud máxima) mediante el registro de la velocidad en cuestión de segundos.
- Gráficos de barras / caja se pueden crear para los parámetros calculados tales como Total de fotones, pico de amplitud y la duración de respuesta, si así se desea (ej .: la figura 5B, C, D).
- En la columna después de la respuesta de fotones de datos en bruto, la media de los puntos de datos en bruto para cada punto de tiempo utilizando la función de la media. Si seguimiento deseado con una columna de determinar el error estándar de la media (SEM), para cada uno de los valores promediados de fotones en un punto de tiempo.
- Utilice la columna media para construir un profil medio de respuestae [Gráfico] para el grupo de muestra CCB. Para ello seleccionar la columna que especifica el tiempo como los valores del eje x y la columna de los valores medios de fotones como el eje y, y finalmente seleccionar la herramienta de creación gráfica de dispersión.
- Repita este procedimiento de análisis con los datos de los lóbulos medial.
- Creación de imágenes para el video
- Visor de fotones en Abrir.
- Seleccione la ficha de control de pantalla. Haga clic en el ROI mientras mantiene el control para seleccionar, eliminar y / o minimizarlo.
- Modificar "anchura sec" (tiempo de acumulación) como se desee para determinar el contenido de cada trama.
- Modificar "paso sec" para definir el solapamiento de cada trama.
- Seleccione "vistas a la exportación durante la reproducción" de prensa "<< REW" y luego "PLAY>". Las imágenes para el video se exportarán a la carpeta "vista exportaciones" como una serie de archivos .png.
- Usando Virtual Dub para hacer video: un método para vídeo creación detallada
- Crear una nueva carpeta llamada "resultats" en la carpeta de vista exportaciones que contiene las imágenes.
- Traiga script (renommer.VBS) en la carpeta de imágenes.
- Doble click en renommer.VBS se ejecute.
- Imágenes automáticamente se cambia el nombre numéricamente y se copian en la carpeta "resultats".
- Abrir VirtualDub.exe.
- Seleccionar archivo de vídeo abierto - seleccionar primero la imagen (imágenes siguientes se cargarán automáticamente).
- Seleccionar vídeo - seleccionar la velocidad de fotogramas ajustar si lo deseas.
- Seleccionar vídeo - seleccionar compresión seleccionar Cinepak Codec por radio.
- En el archivo, seleccione Guardar como AVI el video se creará automáticamente.
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Representative Results
La fusión de la GFP a aequorina nos permite visualizar nuestra región de interés antes de la imagen bioluminiscente través de la excitación de GFP en el modo en el microscopio fluorescente (Figura 3A, 4A, 6A, 6E). Una de las formas más sencillas para estimular los órganos de setas es a través de la activación de los receptores nicotínicos de la acetilcolina ionotrópicos. Aunque la acetilcolina es el ligando endógeno de este receptor se ha encontrado que la nicotina produce respuestas más reproducibles en los órganos de setas. Esto es en parte debido a que expresan específicamente los receptores nicotínicos de la acetilcolina, y por lo tanto mediante el uso de nicotina que pueden evitar la activación de los receptores muscarínicos de acetilcolina expresados en otras partes del cerebro. Además, la nicotina es más estable que la acetilcolina, y por lo tanto permite una mejor y más fiable control de estímulos. Una respuesta típica comienza con la activación rápida tanto de los cáliz, celular-cuerpos (CCB) y lóbulos mediales (ML) (véase la Figura 4Una de imagen etiquetada). Generalmente la respuesta CCB dura más tiempo y exhibe una mayor respuesta bioluminiscente que los lóbulos como se muestra en los paneles secuenciales de la respuesta (Figura 3C-H). La figura 4B muestra una acumulación de 10 seg de fotones registrados a una resolución temporal de 100 mseg (10 Hz) durante el pico de una respuesta a un 1 min de perfusión de 25 M de nicotina. Tras un periodo de lavado y recuperación de 10 min se inicia una segunda estimulación de un 1 min de perfusión de 100 mM KCl (Figuras 4C, E), que nos permite confirmar la viabilidad de nuestra muestra. Las respuestas cuantitativas pueden ser analizados mediante la selección de ROI durante el análisis en el visor de fotón. Ejecución del análisis en el visor de fotones produce dos gráficos que muestran el número de fotones emitidos en ROI seleccionada con el tiempo (Figura 4D y E), así como las hojas de cálculo exportables de esos valores. Figura 4D es una example de los gráficos producidos por el espectador fotón trazar los fotones emitidos en el retorno de la inversión 2 [verde] (derecha CCB) y el ROI 4 [azul] (lóbulos medial derecha). Datos similares para la respuesta KCl representado en la figura 4E. Los datos exportados se pueden utilizar para reconstruir la curva de la respuesta (Figura 5A), así como para extraer los datos adicional acerca de diversos parámetros tales como la duración, amplitud de pico, y respuesta total (Figura 5B-D). Recientemente el uso de los sistemas de Gal4-UAS y LexA hemos ideado un método para provocar una respuesta más natural. Brevemente, el P2X 2 canal catiónico gated-ATP se expresa en las neuronas de proyección (PN) y GFP-aequorina (GA) se expresa en los órganos de setas - un objetivo de las PN; esto nos permite excitar selectivamente la PN, aunque la aplicación de la ATP, que puede a su vez, produce la respuesta de los organismos de hongos (Figura 6).
Figura 1. Características de bioluminiscentes Reporteros (GFP-aequorina). (A) Esquema de las buenas prácticas agrarias y gen de fusión aequorina con secuencia de activación aguas arriba. (B) Modelo de emisión de luz azul por aequorina en respuesta a los altos niveles de Ca 2+. (C) Modelo de la emisión de luz verde de GFP-aequorina en respuesta a los altos niveles de Ca 2+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Experimental creó. (A) Fly posicionado en punta de la pipeta. (B) Una ilustración de técnica de pegado adecuada estabilización de la cabeza y el sellado de la región entre el cuerpo de mosca y punta de la pipeta. (C) Esquema de la disección para abrir la cápsula cefálica. (D) 1 ml de cámara en la celebración de bloque con tubo de perfusión insertado. Total de dimensiones de la cámara: longitud: 7,4 cm, ancho: 2,7 cm, altura: 0,55 cm. Dimensiones de la cámara interiores: longitud: 1,7 cm, ancho: 1,4 cm, altura: 0,35 cm, y el radio del agujero de la cámara: 0,1 cm. (E) Vista de la cabeza de la mosca que muestra la señal de GFP-positivas en los MBs: poca luz tenue con fluorescencia derivada de OK107 impulsado por las buenas prácticas agrarias-aequorina después de la eliminación de la cutícula. (F) Microscopio con cámara de fotones y el sistema de perfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Respuesta Representante a 25 M de nicotina en los órganos de setas. (A) Imagen fluorescente dela expresión de GFP-aequorina en los cuerpos de la seta en GA2 / +; OK107 / + (barra de escala = 50 micras) cerebro de la mosca de control. (B) Respuesta bioluminiscente Peak, en los órganos de setas. (C) Antes de la estimulación. (D) de inicio de la respuesta. (E) Respuesta de pico. (F) Continúa respuesta CCB. (G) La caída respuesta CCB. (H) Fin de la respuesta (BH: barra de escala = 33 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Análisis de Representante de la grabación de la muestra (A) Imagen fluorescente del cuerpo de hongo de la GA2 / +;. OK107 / + control de la mosca con cuatro seleccionados en los lóbulos CCB y medial (BA escala de ROIr = 50 micras). (B) la acumulación de 10 seg de la respuesta bioluminiscente a 25 mM de nicotina - respuesta de fotones registrado a 100 mseg. (C) la acumulación de 10 seg de la respuesta bioluminiscente para mM KCl 100 registrado a 100 mseg. (D) Gráfico del número registrado de fotones emitidos durante la respuesta a la nicotina en el ROI de 2 y 4 que cubren el CCB derecho y lóbulos mediales respectivamente. (E) Gráfico del número registrado de fotones emitidos durante la respuesta KCl dentro de 2 ROI y 4 que cubre los CCB y medial lóbulos derecho, respectivamente. En dye, el eje Y la izquierda corresponde al número total de fotones dentro de todo el campo de visión, mientras que el eje Y derecho corresponde a los fotones en el retorno de la inversión. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Parámetros representativos análisis de la grabación muestra el análisis Representante excel de la respuesta a la activación bioluminiscente nicotínico del cuerpo de setas en el GA2 / +;. OK107 / + mosca control. Respuesta (A) de fotones a través del tiempo en el CCB y lóbulos mediales. (B) Duración de las respuestas en el CCB y lóbulos mediales. (C) Valor de fotones más alta (máxima amplitud) durante la respuesta dentro de la CCB y lóbulos mediales. (D) Total de fotones dentro CCB y lóbulos mediales de respuesta completa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Dos respuesta diferente en los organismos de hongos después de la estimulación de PN through ATP y P2X 2. Muestra 1 mosca expresar P2X 2 en PN y GFP-aequorina en los órganos de setas (GH146 / +; P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (ad) (A) Imagen fluorescente de los cuerpos de la seta con la de retorno de la inversión (escala. bar = 50 micras). (B) Imagen bioluminiscente de la respuesta de pico en los cuerpos de hongos después de la activación de las PN por P2X 2 estimuladas con 500 ATP m, observados principalmente en los lóbulos medial. (C) Imagen bioluminiscente de la respuesta pico de KCl. (D ) Evolución temporal de emisión de fotones dentro de las regiones de ROI, a lo largo de la respuesta de la muestra 2 mosca expresar P2X 2 en PN y GFP-aequorina en los órganos de setas (GH146 / +;. P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (eh ). (E) Imagen fluorescente con (barra de escala de ROI = 50 micras). (F) Imagen bioluminiscente de la respuesta inducida en los cuerpos de hongos después de unactivation de los PN por P2X 2 estimulado con 1 mM de ATP, en ambos lóbulos y CCB. (G) Imagen bioluminiscente de respuesta máxima KCl. (H) Evolución temporal de emisión de fotones dentro de las regiones de ROI, en toda la respuesta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El enfoque-GFP-aequorina bioluminiscente basado recientemente desarrollado que aquí se presenta permite la grabación funcional in vivo de Ca 2+ -Actividad en diferentes neuronas en, así como si se desea, en otro tipo de células, tales como células estrelladas del riñón como se informa en Cabrero et al. , 2013 5.
Modificaciones, solución de problemas, componentes adicionales y pasos críticos
Drosophila Ganadería
-GFP aequorina transgén (pG5A) 4 se insertó en el vector pUAST para crear tres líneas transformantes independientes 6. Todas las líneas se probaron para su bioluminiscencia, y todos fueron capaces de responder a la in vivo Ca 2+ -Actividad 6. Sin embargo los experimentos más recientes han señalado que la línea GA2 insertada en el tercer cromosoma genera la señal más robusta que la líne GA1 insertadan el segundo cromosoma. Aquí, los resultados representativos se obtuvieron mediante el uso de UAS-GA2 cruzado con el OK107 línea MB-específica. Por otra parte, recientemente B. Pfeiffer ha generado una construcción de GFP-aequorina colocado bajo el control de 20XUAS elemento regulador (20X-G5A-2) y este constructo ha sido validado en nuestro laboratorio. En pocas palabras, da una señal muy fuerte, más fuerte que nuestra GA2 estándar, que por lo tanto debe ser más eficiente y útil para controlar aún más el Ca 2+ -Actividad en las estructuras profundas del cerebro, como el cuerpo elipsoide. Además, también puede ser útil para obtener imágenes de pequeñas cantidades de neuronas o en terminales de los axones (contactos sinápticos).
Preparativos para Imaging
Aunque la mosca debe ser anestesiado hielo durante el posicionamiento y encolado, es importante para minimizar el tiempo en hielo. Las moscas deben ser transferidos a un vial de vidrio y se mantuvieron en hielo durante 2 min antes de ser trasladado al plato Petri enfriadapara colocar en la punta de la pipeta. Hemos notado que período de tiempo prolongado de la anestesia reduce la viabilidad de la muestra y puede atenuar la respuesta. De manera óptima, mantenemos el momento de la anestesia de hielo por debajo de 5.10 min.
Taping y encolado son pasos críticos. Es crucial para asegurar la cabeza de la mosca en el lugar para la disección y la formación de imágenes, así como para evitar fugas de la solución de Ringer en la punta de la pipeta y / o fuera de la cámara de grabación. Pegamento dental (y en menor medida en el pegamento de silicio) se convertirá pegajosa y, posteriormente, empezar a secarse tan pronto como se combinan los dos componentes. Por lo tanto, es fundamental para aplicar el pegamento con prontitud para evitar la unión débil y la formación de grumos de la cola. En algunos casos hemos notado que las variedades alternativas de cinta y pegamento, al entrar en contacto con la solución de Ringer, puede liberar contaminantes en la solución de Ringer, que pueden afectar a la marcha y su respuesta, sobre todo por lo que para los experimentos dedicados a tél estudio del sistema olfativo, el uso de diferentes olores. En consecuencia, tenga cuidado aquí si los materiales sustituyendo (ver materiales para variedades específicas que utilizamos).
Varias formas diferentes de coelenterazina se han desarrollado con el fin de optimizar su actividad tales como la velocidad de emisión de luz, Ca 2+ -affinity (sensibilidad), o la intensidad de emisión de luz 12. Por ejemplo, el coelenterazina nativa es más estable, por lo tanto más adecuada de la imagen a largo plazo como varias horas, mientras que el bencil-coelenterazina (también nombrado h-coelenterazina) da lugar a una mayor emisión de luz más rápido y con vida media más corta. Para obtener información adicional acerca de las diferentes formas de coelenterazina, consulte la dirección web en la Lista de materiales.
Imaging
Señales de bioluminiscencia pueden ser monitoreados con una cámara CCD multiplicador de electrones (EM-CCD, se enfrió a -80 ºC) montado sobre un microscopio. Esta configuración debe bcorreo alojado en el interior de una caja oscura apretada para evitar cualquier indeseado (ambiente) contaminación lumínica. La configuración descrita en este manuscrito utiliza una lente de inmersión 20X-objetivo que permite un campo de visión de 400 x 400 micras (512 x 512 píxeles). Para mejorar la relación señal a ruido, los datos fueron adquiridos con un tiempo de integración 0,100 seg (10 Hz), y se utilizó 2 x 2 binning (1 pixel = 1,2 x 1,2 m). X Para adquirir y almacenar datos, se asigna cada fotón detectado, coordenadas y un punto de tiempo. Entre 500 y 600 nm de longitud de onda, la cámara EM-CCD (véase la descripción precisa en la Lista de Materiales) tiene una eficiencia cuántica del 96%.
Uno de los parámetros más importantes para la imagen cerebral funcional in vivo es la resolución temporal. Hasta ahora, la mayoría de la técnica basada en fluorescencia Ca 2+ -Imagenología tales como GCaMP y cameleon proporciona una resolución temporal de alrededor de 4 Hz (250 mseg / marco). Recientemente, con sede en bioluminiscencia GFP-aequorina hemos sido capaces de raise el tiempo de adquisición de hasta 100 mseg / marco con la cámara EMCCD e incluso hasta 120 cuadros / seg (8,3 mseg / marco) con la cámara ICDD multiplicador de electrones 10. En este resolución temporal se aproxima al de las técnicas electrofisiológicas (en el intervalo de aproximadamente 1 ms). Mientras alta resolución temporal es a la vez informativo y crucial para los estudios dedicados a la transmisión sináptica y la actividad inducida por estímulos, se extendió más lento pero esencial Ca 2+ -kinetics también ocurre dentro de las neuronas, por ejemplo, la liberación de Ca2 + de las intracelulares de Ca 2 + -tiendas (para una revisión: Berridge et al, 2003 13.). Para este último tipo, una resolución temporal más lenta es todavía aceptable, mientras que inversamente, generalmente requieren una mejor Ca 2+ -affinity del sensor a ser detectado. Este requisito se ha logrado con las buenas prácticas agrarias-Aequorina para detectar la liberación de los Ca2 + intracelular -tiendas en la terminal del axón del recept olfativaors neuronas 7,8. Alternativamente, dependiendo de las condiciones experimentales deseadas, se podría utilizar más lento tiempo de adquisición. Por ejemplo, en tiempo O / N grabaciones, hemos utilizado un tiempo de integración de 2 segundos debido al gran número de puntos de datos recogidos (Minocci et al., 2013). En resumen, una característica práctica con la bioluminiscencia es que la resolución temporal se puede ajustar fácilmente de acuerdo con las condiciones experimentales deseados.
Cámaras alternativos (configuración de mosca) se han desarrollado para facilitar los objetivos del experimento. Por ejemplo, para los estudios basados en estímulo olor natural, la antena debe mantenerse libre, por lo tanto, un enfoque como el desarrollado por A. Fiala 14 es el más adecuado (se utilizó un enfoque similar para Murmu et al. 2010). Brevemente, en este enfoque, la mosca es tethered (pegado) en un perno minutien en el cuello, que se pega a una hoja de la cubierta de plástico que contiene un pequeño agujero. Se crea un selloalrededor de la parte superior de la cabeza de la mosca. A partir de entonces, una gota de timbre se deposita en la cabeza, y la cápsula de la cabeza es disecado. De tal manera, las antenas se mantiene libre y están disponibles para detectar olores. Del mismo modo, para la grabación de largo plazo, como O / N o incluso par de días 10 necesita la marcha para ser lo más libre de restricciones como sea posible, y en algunos casos alimentados (por ejemplo: con un papel capilar empapado en una de glucosa al 5% solución). En estas circunstancias, el enfoque de Fiala también es más adecuado que el enfoque de la punta de la pipeta azul (método de snorkel).
Todas las solicitudes de medicamentos pueden ser controlados externamente usando un multi-válvulas sistema de perfusión por gravedad 6 vías. El flujo puede ser controlado utilizando reguladores de perfusión volumétricas calibrados antes de cada sesión de grabación para un caudal de 2 ml / min. Aparato de drenaje extractos líquidos a una velocidad de 2 ml / min desde la cámara de grabación mediante la bomba peristáltica que permite un flujo continuo.
Enalgunas condiciones, debido al alto costo de la droga y / o la cantidad de fármaco a utilizar, uno desearía aplicar sólo pequeñas cantidades de compuestos. Por lo tanto, es necesario aplicar directamente en el baño en lugar de a través del sistema de perfusión. En este caso el obturador debe estar cerrada durante este proceso para evitar la contaminación de luz.
Métodos de análisis
Conteos por segundo o recuentos por segundo por cada coordenada ambos han sido utilizados por nuestro grupo para el análisis. Cuentas por segundo es quizás los más adecuados para las respuestas brillantes en estructuras enteras, mientras que las cuentas por segundo y por coordenadas (lo que representa una normalización de las respuestas al tamaño de la ROI) es el más adecuado y preciso para pequeñas poblaciones de células. Ambos de ellos se puede seleccionar fácilmente en el software de análisis.
Una de las principales ventajas de utilizar el enfoque bioluminiscencia es la forma en que se adquieren y almacenan los datos (x, y, t parámetros decada fotones emitidos). De hecho, mientras que las otras técnicas de imagen utilizadas modo estándar como una completa imagen adquirida (generalmente en formato tiff), con este sistema, se adquiere sólo la señal relevante y significativo almacenando sólo las coordenadas de píxeles que han sido activados por la luz durante una duración pre-determinado de tiempo (que corresponde al tiempo de adquisición o resolución temporal). En consecuencia, el almacenamiento de los datos es muy "light" en comparación con el almacenamiento de una imagen completa, y por lo tanto, hace que sea más fácil de analizar los datos. Para el análisis de datos, utilizamos un software relacionado (visor de fotones), que permite ajustar el tiempo de acumulación si lo deseas. A continuación, la visualización de una imagen de las señales se puede ajustar como se desee en una meta para presentar los datos de forma convincente. Paralelamente los resultados se cuantifican al mismo tiempo de resolución que su tiempo de adquisición.
Importancia y aplicaciones biológicas de bioluminiscente de imágenes
Como se mencionó anteriormente imágenes de calcio bioluminiscente ofrece tres ventajas principales a las técnicas de imagen de calcio fluorescente: (1) a las regiones más profundas del cerebro pueden obtenerse imágenes, (2) de imágenes se puede producir de forma continua durante más tiempo como varias horas como O / N e incluso en algunos casos hasta dos días, y (3), más recientemente, con una resolución temporal más alta, de hasta 120 cuadros / seg (8,3 ms). La principal limitación del enfoque bioluminiscente es debido a su incompatibilidad con la iluminación confocal, que por lo tanto no nos permiten determinar la profundidad exacta (z-plan) de las estructuras activadas o neuronas.
La primera ventaja de bioluminiscente de imágenes, las imágenes de las regiones profundas del cerebro, se demostró anteriormente en 2007 por la imagen de una respuesta de calcio inducida por niveles altos de potasio en el cuerpo elipsoide (eb), una estructura profunda situada en el centro del cerebro, sin previa electrofisiológicos o funcionales informes 6 2+ -Actividad en el eb tras la aplicación de picrotoxina (un bloqueador de los receptores GABA A) lo que demuestra que los GABAérgicas de anillo neuronas del eb son neuronas inhibitorias de hecho (que se describe en :. pañal y otros, el artículo presentado).
El segundo beneficio, más largo y la grabación continua en el tiempo, se ha explotado en varios estudios de nuestro laboratorio. Estimulación Olor se ha utilizado para examinar la actividad de las neuronas cerebrales en estudios previos 11,15,16. Utilizando imágenes de más largo plazo, sin embargo, nuestro laboratorio ha sido capaz de mostrar los cambios previamente no declaradas en la cinética dentro de las neuronas olfativas del receptor a los olores. El primer estudio por Murmu et al. (2010) mostró que mientras que los estímulos de olor corto (1-3 segundos) mostraron una cinética similar y una diferencia moderada en amplitud, un estímulo de olor más largo (5 seg) causó una amplitud mucho mayor, así como una cambiar en la cinética / structure de la respuesta que se atribuyó a las reservas de calcio intracelular. Un estudio posterior demostró que mientras que 5 aplicaciones sucesivas de pulsos de olor 1 seg a intervalos de 5 min no cambian su respuesta de calcio, el aumento de la longitud del estímulo a 5 seg llevado a la atenuación progresiva de la respuesta, lo que sugiere un proceso de adaptación. Además, este fenómeno de adaptación parece ser iniciado por la regulación de GABAérgica previamente identificados reservas de calcio 8. Es importante destacar que estos datos también demuestra que, en esta condición experimental, Ca 2+ -Sensor del GFP-aequorina puede detectar y seguir el calcio liberado de los intracelulares de Ca 2 + -tiendas. Un estudio único adicional de nuestro laboratorio utiliza bioluminiscente de imágenes O / N para registrar la actividad basal (espontánea) en el conjunto de las poblaciones neuronales y gliales en el cerebro, así como la actividad de los órganos de setas 10. Estas grabaciones revelaron actividad espontánea sorprendente en hormigaEnnal centro mecanosensorial y el motor (AMMC) y el lóbulo antenal. Además, la actividad autónoma celular inesperado en la glia que ocurre durante toda la noche. Dentro del cuerpo de setas el estudio identificó tanto la actividad punteada y dos picos distintivos, uno corto y uno largo cuya incidencia cambiado con 10 años de edad.
En el estudio más reciente en nuestro laboratorio, utilizamos imágenes bioluminiscente para examinar los efectos de la manipulación de moléculas de señalización secundarias implicadas en la memoria, y cómo afectan a la respuesta de calcio dentro de los órganos de setas 9. De hecho, a pesar de burro y rutabaga fueron identificados hace más de 30 años y son conocidos para regular el nivel de cAMP, sus efectos in vivo sobre los mecanismos celulares y fisiológicos y en particular en el Ca 2+ -response siguen siendo en gran parte desconocido. Con el enfoque de las buenas prácticas agrarias aequorina, hemos sido capaces de grabar simultáneamente tanto el cáliz (la structur dendríticasES) y el-cuerpos celulares, así como las proyecciones axonales en el nivel de los lóbulos, y por lo tanto lo que nos permite correlacionar el nivel y la cinética de la respuesta en los diferentes compartimentos de esta estructura altamente compleja.
La aplicación más reciente estamos desarrollando imita una respuesta natural a través de la activación artificialmente poblaciones neuronales presinápticos a la estructura de interés. Para ello expresamos el receptor P2X 2, un canal de cationes por ligando que es sensible a ATP, en la neurona presináptica y expresamos GFP-aequorina en la población neuronal post-sináptica. La segregación de estos dos elementos en diferentes poblaciones neuronales requiere dos sistemas de expresión separados. Con este fin un LexA construcción que contiene GFP-aequorina ha sido creada. En nuestros experimentos preliminares con este sistema hemos expresado P2X 2 en un subconjunto de las PN utilizando el Gal4-GH146 con UAS-P2X 2 y GFP-aequorina en el cuerpo de hongoutilizando la línea LexA MB247 combinado con LexA-13X-GFP-aequorina. Hemos registrado con éxito respuestas de calcio en el cuerpo de hongos con estimulaciones de ATP 1 mM al receptor P2X 2 en el PN (Figura 6).
En conclusión, el enfoque-GFP aequorina bioluminiscencia ha demostrado ser útil en la grabación del estímulo inducida por Ca 2+ -Actividad, análoga a otras Ca 2+ -Indicadores. Pero lo más importante, sino que también permite la detección de Ca 2+ -Actividad espontánea dentro del cerebro. Este enfoque abre las posibilidades futuras de experimentos a largo plazo y de imágenes de todo el cerebro que pueden aumentar la profundidad de nuestra comprensión de los fenómenos fisiológicos y patrones de actividad en el cerebro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
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