Résolution Quantification haut de Crystalline Cellulose Accumulation dans<em> Arabidopsis</em> Roots pour surveiller cellulaire spécifique d'un tissu mural Modifications
Summary
Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.
Abstract
Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.
Introduction
La paroi de la cellule végétale est une structure dynamique. les cellules en croissance sont entourées d'une paroi cellulaire primaire, dont l'organisation permet aux cellules de se développer. Les cellules qui cessent de croître dépôt d'une paroi secondaire plus rigide qui améliore le support mécanique de la plante. Les deux parois cellulaires sont composées de microfibrilles de cellulose noyées dans une matrice de polysaccharides de structures différentes (par exemple, l' hémicellulose et la pectine) qui varient selon les différents stades de développement et des tissus 1,2. La cellulose est synthétisée sous la forme de chaînes (1,4) -β-D-glucane qui sont étroitement alignées pour former la microfibrilles d'une structure cristalline. cellulose Amorphous fait référence aux régions où les chaînes glucane sont moins ordonnés. Le rapport entre les domaines cristallins et amorphes , est un paramètre pensé à affecter les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire, en offrant une résistance mécanique et les caractéristiques viscoélastiques, respectivement 3. Plusieurs méthodes ont étédéveloppé pour détecter et quantifier les deux formes d'arrangement de cellulose, dont la diffraction des rayons X et de polarisation croisée / l' angle magique RMN du solide 4. Diffraction des rayons X peut être utilisée pour déterminer la proportion des domaines cristallins par rapport à la cellulose amorphe dans l'échantillon 5. Une méthode alternative utilise le fractionnement du contenu de la paroi cellulaire en matière insoluble en milieu acide et soluble dans l'acide, de faire la distinction entre le cristallin et la cellulose amorphe ou d'autres polymères, respectivement. Dans cette approche, l' incorporation de glucose marqué ([14 C] glucose) est utilisé pour quantifier le 6,7 de cellulose. Ces procédés nécessitent de grandes quantités de matériel végétal pour l'analyse d'organes entiers, au mieux, et, par conséquent, ne sont pas suffisamment sensibles à une variation spécifique au tissu dans la structure de la paroi cellulaire. Visualisation des microfibrilles de cellulose à une résolution cellulaire peut être obtenue dans les études d'imagerie en temps réel associées à des colorants fluorescents 8,9, qui peuvent identifier les changements dansl'orientation des microfibrilles de cellulose. Cependant, ces colorants ne sont pas utilisés pour la quantification, ils ne sont pas spécifiques à la cellulose cristalline et peuvent interférer avec la structure normale de la paroi cellulaire 8. Polscope est une technique d'imagerie qui repose sur la capacité de cellulose cristalline pour diviser les faisceaux lumineux et à retarder une partie de la lumière 10. un retard de lumière est la plus forte pour les microfibrilles qui se situent perpendiculairement à la direction de propagation de la lumière. Pour microfibrilles avec une orientation similaire, plus le degré de cristallinité, plus la lumière retardance 11. Par conséquent, polscope est utilisé pour étudier à la fois les niveaux et l'orientation des microfibrilles de cellulose relative.
Roots présentent une croissance linéaire, au cours de laquelle les cellules provenant à la niche de cellules souches, à la pointe de la racine, subir une série de divisions cellulaires, avant de se développer rapidement 12. Les cellules comprenant la racine se développer dans un unidirectionnel (anisotrope)Ainsi, comme dicté par les petites molécules de signalisation des hormones qui ont une incidence sur les propriétés de la paroi de la cellule 13. Réponses différentielles aux hormones, dans le temps et l' espace, constituent un moyen d'assurer une croissance équilibrée de l' organe 14. Par conséquent, l'analyse à haute résolution de la structure de la paroi cellulaire peut fournir des informations importantes nécessaires pour mieux comprendre le lien entre les réponses spécifiques de type cellulaire à la croissance organe entier. Nous rapportons ici la mise en œuvre de polscope pour étudier l' accumulation spécifique de tissu de cellulose cristalline dans les racines d' Arabidopsis, comme observé dans les sections anatomiques de haute qualité. Cette méthode a récemment découvert la cellule accumulation de cellulose cristalline spécifique de type en réponse à une perturbation spatiale de l' activité hormonale 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons une méthode de détermination de l'accumulation de cellulose cristalline dans les différents tissus composant les racines d' Arabidopsis, tout en conservant les informations anatomiques. En tant que tel, il fournit une étape supplémentaire vers la compréhension des processus de croissance des plantes à une résolution cellulaire. Cette méthode peut également être appliquée pour l'étude des espèces et des organes végétaux supplémentaires.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).
Materials
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).
- Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. Growth control and cell wall signaling in plants. Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).
- Mazeau, K., Heux, L. Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose. J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).
- Zhao, H., et al. Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis. Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).
- Fujita, M., et al. Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis. Plant J. 66, 915-928 (2011).
- Peng, F., et al. Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves. Bioresources. 7, (2012).
- Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots. Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).
- Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).
- Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie. J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).
- Abraham, Y., Elbaum, R. Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy. New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).
- Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. Control of Arabidopsis root development. Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).
- Vanstraelen, M., Benkova, E. Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development. Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).
- Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. Growth control: brassinosteroid activity gets context. J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).
- Fridman, Y., et al. Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells. Genes Dev. 28, 912-920 (2014).
- Vragovic, K., et al. Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).
- Hacham, Y., et al. Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size. Development. 138, 839-848 (2011).
- Gu, Y., et al. Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).
- Fendrych, M., et al. Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis. Curr Biol. 24, 931-940 (2014).
