Introduction
その短いライフサイクル：ほぼ50年間、線虫線虫（Caenorhabditis elegans）が開発、神経生物学、進化、宿主-病原体相互作用などで重要な問題を研究するための強力なモデルとしての地位を確立して1開発の研究では、このモデルの強さはです3日;これらの動物は、遺伝的に改変することができる容易さ。ほとんどが子宮外で生きている動物とその開発における細胞の変位と形態の観察を可能にするその透明。線虫の発達段階は、成人期に続いて、胚形成および4幼虫期（L4へL1）を伴います。胚発生時には、表皮の形態形成は、細胞が、彼らは彼らの接合部を再編成し、それらの個々の形態だけでなく、機能性上皮内での相対的位置を変更する方法を、グループとして移動する方法上皮のより良い理解を可能にする能力についてかなりの注目を集めました。表皮の形態形成は4段階に分かれています。背側表皮細胞の再編成からなる背インターカレーションは、皮下組織と呼ばれます。このように、上皮細胞単層における胚を包む腹側正中線に向かって腹側皮下細胞の遊走になる腹側筐体;初期および後期の伸び虫様幼虫に豆の形胚を変換します。以下の形態形成、胚のハッチとL1幼虫は、その直接の環境で利用可能な細菌を使用して供給し始めます。
胚性の伸びは、したがって、胚発生の後期です。これは、その長手方向軸に沿って胚の伸長と横直径の減少から成ります。これは、皮下細胞の形状の劇的な変更を伴います。伸びが初期および後期段階に分割されています。体壁の筋肉がワットで1.75倍の段階で、収縮開始時に初期の段階ではコンマ段階で開始し、終了しますILD型（wt）胚-非伸長胚と比較して、長さの1.75倍である胚に対応します。その段階で生じる形態形成のプロセスは、主に胚2の前後軸に沿ってその伸びを駆動皮下細胞の先端極に位置するフィラメント状アクチン束（FBS）の収縮によって駆動されます。政府短期の収縮は3キナーゼLET-502 / ROCK、MRCK-1とPAK-1 5によるミオシン軽鎖のリン酸化による制御です。体壁の筋肉が機能するようになると契約を起動したときに、伸びの後期相は、開始されます。これは、背側と腹側の皮下細胞に体壁の筋肉からメカノシグナリングを含み、動物が3を孵化たときに終了します。
伸び欠陥は、一般的に胚のように死んで動物の割合（胚致死性; EMB）を特徴とし、L1幼虫（幼虫逮捕表現型として、その発症を阻止するもの、左心室a）および重量よりも大幅に短くなる。発育停止の段階の同定は、死んだ胚の顕微鏡観察を必要とし、幼虫3-6を逮捕しました 。
最近、このようないくつかのCdc42 / RacのレギュレータとエフェクターPIX-1などの遺伝子、及びPAK-1は、両方の初期および後期伸び3,7の間に形態形成のプロセスを制御することが示されました。また、最近、形態形成のプロセスは早期に伸び、3〜7の間の胚の前後軸に沿って異なることを示しました。これらの知見は、特に初期の伸びの間にそれらの前後軸に沿った胚の形態の特徴付けを可能にする初期または後期の伸長段階およびその他のメトリックをターゲットに新たな評価指標の開発の動機。
これらの新規な方法は、それらの幅ならびに開始時および初期の伸長の終了時に、胚の長さを測定することからなる、彼広告や尾。7 2つのプロトコルはまた、L1ステージ7で同期、新たに孵化した幼虫の長さを測定するために開発されました。
幼虫、成虫および培養培地中に存在する細菌を処理することによって溶解させながら、胚の卵殻は、アルカリ性の次亜塩素酸処理に対してそれらを保護します。この処理は、次に、よく供給成人8の大部分を含む非同期集団から胚を精製するために使用されます。食事制限は、新たに孵化した幼虫を同期させるために使用されます。これらの幼虫の長さを測定し、次いで伸長欠陥を検出するために使用されます。孵化幼虫は、非完全に伸長した胚は、給紙時に「通常の長さ」に回復することができますが、食品の非存在下での逮捕時に彼らの小型化を維持するため、この測定は、培養プレート上で逮捕幼虫の測定よりも好ましいです。
ここでは、ルの測定を可能にする詳細なプロトコルを提示しますタイムラプスDIC顕微鏡と画像解析（プロトコル1）を使用して、胚だけでなく、自分の頭と尾の幅を長くするngth。我々はまた、画像解析（プロトコル2）およびフローサイトメトリー（プロトコル3）を使用して同期幼虫の長さを測定するための詳細なプロトコルを提供します。
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Protocol
WTおよび変異動物における初期伸び欠陥の特徴付け
- ノマルスキーDIC顕微鏡用取付胚
- 以下の培養培地および材料を準備します。
- M9緩衝液は、12.8グラム/ LのNa 2 HPO 4•7H 2 O、滅菌蒸留水とオートクレーブ内の3グラム/ L KH 2 PO 4、5グラム/ LのNaCl、0.25グラム/ LのMgSO 4•7H 2 Oを溶解させます。
- NGMプレートは、3つのG / LのNaCl 16 G / L寒天、のddH 2 Oを2.5グラム/ Lのバクトペプトンを溶解します1mMのMgSO 4を、1ミリモルのCaCl 2、1mMのリン酸緩衝液および5μg/ mlのコレステロールをオートクレーブ加えます。 60ミリメートル皿あたりNGMの6ミリリットルを注ぎます。媒体は、室温で24時間、固化することができます。 E.の飽和文化の数滴を追加します。ルリアブロス（LB）中で増殖させた大腸菌 OP50細菌。細菌は48時間成長し、4℃でプレートを保存してみましょう。
- ワームのパイを生成するにはCK、短いパスツールピペットに0.01 "直径の白金線を取り付ける。ベンゼンバーナーでこの先端を加熱することにより、ガラスピペットの先端に白金線を固定します。シャベルのようなものを生成するために、ワイヤの先端を平らに。
- 20℃でOP50と60ミリメートルNGMプレート上のワーム株を成長させます。
注：感熱アレルは最大25.5℃の非許容温度での動物の成長が必要な場合があります。プレートは、プロトコルを追求するために多くの若い大人とまだ食べ物をたくさん含まれている必要があります。 - マスキングテープ（ 図1A）の二つの層で覆われた2スペーサースライド間の顕微鏡スライドを配置します。
- 30秒の間にマイクロ波加熱を20 mlのM9緩衝液中でアガロース粉末0.6gを溶解することによりM9緩衝液中の3％アガロース溶液（重量/体積）を準備します。溶液を5分間冷却することができます。
注：アガロース溶液をマイクロ波中で溶融した後、数日間使用することができます。それまた週間分注し、4℃で保存することができます。 - 2スペーサのスライドの間に位置するスライドガラス上のホット、3％アガロース溶液の液滴を配置します。気泡を形成することは避けてください。
- 図1（b）に示すように急速に別のスライドでアガロースをカバーし、そっと押し下げます。トップスライドは、アガロースドロップを平らにし、マスキングテープの二つの層の厚さのパッドを生成します。
- アガロースは室温で少なくとも1分間、または胚がパッドに転送する準備が整うまで、固化することを可能にします。
- ワームのピックを使用して、M9バッファー400μLを含むマイクロ遠心チューブにNGMプレートから20〜30も供給される若年成人を転送します。
- ワームは、約5分間、重力によって沈降し、マイクロピペットを用いて上清を除去することを可能にします。このステップでは、線虫で拾う細菌の最大値を除去することを目的とします。
- 各チューブにM9緩衝液200μlを追加します。
- パスツールのピップを使用して、ETTEは、時計皿にチューブ（バッファおよび線虫）のコンテンツを転送します。
- （受精と外陰部の間に）半ば本体部で動物をカットするために、1つまたは2 25G 5/8 "針を使用してください。
注：メスの刃はまた、針（単数または複数）の代替として使用することができます。水泳線虫でこれを行うと、いくつかの練習が必要な場合があります。アイデアは、ハサミとして、または多数の針が使用されている方法によってはナイフのように針を使用することです。動物が切り開かれると、雌雄同体は、バッファに彼らの胚をリリース。 - 液体内の循環渦の生成を介して時計皿の中央に胚を集中します。
- マイクロピペットを用いて時計皿からM9の大部分を削除してください。胚でM9の約30μlのままにしておきます。
- パッドをオフにスライドさせ、アガロースパッド（ 図1B）を覆うスライドを削除します。
- 完全にカバースリップでそれをカバーできるようにするために、かみそりの刃でパッドを切断し（図1C）。
- パスツールピペットを用いて、アガロースのパッド上にすべての胚（ウォーム破片）を転送します。
- グループ200μlのマイクロピペットのために使用される先端部の先端に糊付けまつ毛を使用して、パッドの中央に胚。
- ゆっくりと気泡の形成を回避パッドの上にカバースリップを置き、それを封印。
注：いくつかのシーラーを使用することができます。我々は、（通常は水彩画の絵のためにガムをマスクとして使用される）の芸術と工芸品の店で見つかったガムを描く使用しています。それは親水性であり、適度に高速固化やワームのために毒性がないので、このガムが使用されます。スライドはまた、マニキュアやVALAP（ワセリン、ラノリンおよびパラフィンワックスで作られた混合物）で封止することができます。 - 約15分間の描画ガム乾燥を可能にします。
- 以下の培養培地および材料を準備します。
- 4次元ノマルスキーDIC顕微鏡を使用して初期の伸びを記録
注：このステップの目的は、後半の伸びの先頭にカンマからの早期の伸びを記録することです- 体壁筋肉が契約を開始した瞬間として定義されています。また、一度に複数の胚を記録することを目指しています。記録の8時間は、通常、非同期胚の群のための初期の伸びを記録するために必要とされます。- 顕微鏡のステージに搭載されたスライドを置きます。顕微鏡は、タイムラプス顕微鏡およびZ-スタックの世代（自動Z-プラットフォーム）を有効に10Xと60Xの目的だけでなく、DICレンズ、プリズム、カメラとキャプチャソフトウェアが装備されていることを確認してください。
注：温度が顕微鏡室で20〜23℃の間で一定であることを確認してください。加熱冷却室は、感熱性の変異体を使用する場合は特に、顕微鏡ステージ上で必要とされ得ます。 - 10×対物レンズを用いて事前に形態形成の段階で胚のグループを識別します。
- 検索が終了したら、10倍の対物レンズをオフにスライドし、スライド上の油浸のドロップを追加します。
- 60Xの対物レンズを使用して、上部及びEの底部を識別するセットアップにmbryos Zスタック撮像パラメータ。
注：胚の厚さよりも大きいZスタックを設定することを躊躇しないでください。 0.8μmのように、2つの隣接する平面間の距離を設定します。これは、35〜50 Z-計画に胚の全深さをカバーできるようになります。
注：顕微鏡は、自動化されたxyプラットフォームが含まれている場合は、パッドの異なる場所に位置して胚を同時に記録することができました。これを行うには、レコードのxyあなたは、実験の過程で分析したいパッド上の各位置の座標。記録パラメータを設定するときのxyを選択し、指示に従ってプロトコルの残りの部分に従っていることを確認してください。記録中の胚の薄いZ-切片は、必ずしもこのプロトコルで詳細な測定のために必要とされていません。最大解像度で重量および変異動物の胚発生を記録することが追加分析をサポートすることができる録音のライブラリを構築するためには良い方法です。 - セット8時間持続する2件の買収の間に2分間隔でタイムラプスアップ。
注：露光時間は、顕微鏡に設定する光強度に依存します。初期の伸びの間の細胞の動きが非常に遅いです。露光時間は約1秒あたりのフレームまたはそれ以下である可能性があります。胚は初期の形態形成の段階（背インターカレーション、腹側筐体）である場合は、初期の伸びが1時間以内に記録されます。光シャッターがそれぞれ取得まで閉鎖されていることを確認します。 - 買収を実行し、それを保存します。
- 顕微鏡のステージに搭載されたスライドを置きます。顕微鏡は、タイムラプス顕微鏡およびZ-スタックの世代（自動Z-プラットフォーム）を有効に10Xと60Xの目的だけでなく、DICレンズ、プリズム、カメラとキャプチャソフトウェアが装備されていることを確認してください。
- 画像解析を用いた初期の伸び欠陥の測定
- オープンフィジー-ImageJソフトウェア（ v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ）。
- メニューで設定/分析測定を選択し、境界を選択します。各胚について、 図2（a）に示すように 、胚の咽頭に集中するZ-スケールバーを調整します。これは、胚の中心に焦点を当てていることを確認します。 胚の長さを測定するために、初期の伸長の開始時に関心の胚を有するようにタイムスケールバーを調整する（コンマ段階; 図2A参照 ）。時間（「タイム開始」）を注意してください。
- セグメント化されたライン・ツールを選択します。胚（ 図2A）の正中線以下の尾の先端までの胚の口の先端からセグメント化されたラインを描きます。メニュータブ分析/測定を使用して、描かれた線（「長さ初め」）の長さを得ます。
- 初期の伸び（筋肉が契約を開始した瞬間）の終了時に、同じ胚のために、この測定を繰り返します。 （「タイム・エンド」）を、時間に注意し、胚（ 図2B）上に詳述したように（「長エンド」）の長さを測定します。
- 次のように、この段階で初期の伸びの持続時間（D）と長さの増加（L）を算出します。
D = "タイムエンド」 - 「タイム始まり」
＆＃160; L = "長エンド」 - 「長さ-始まり」 - ヘッド幅を測定するために、金利（1.2倍段階または早期延伸の終端）の段階で胚を持つようにタイムスケールバーを調整します。直線ツールを選択します。ヘッドの横方向（背腹軸）正中線を描画します。このセクションでは、胚（ 図2C）の最も厚い部分です。メニュー分析/測定を使用して、ヘッド幅に対応するラインの長さを得ます。
- （; 図2Cは、腸のバルブと尾の先端との間の中間線）とテール幅を得るためにそれを測定する同じ時点で、尾の横方向の正中線を描画することで、この手順を繰り返します。
注：異なる表現型間で同じ段階で胚を比較するには、この測定値を使用します。この測定の再現性を確保するために、簡単に一匹の動物から認識できる動物の尾の中線の周囲に位置する場所を見つけてくださいNotherの。 - テール幅比ヘッドを計算するために、テール幅によってヘッド幅を分割します。
画像解析を用いた後期伸び欠陥の2キャラクタリゼーション
- アルカリ性次亜塩素酸処理を用いて、L1幼虫の同期
- 多くの妊娠成人を含む非飢餓の60mmプレートから、M9緩衝液1mlをパスツールピペットを用いてプレートから線虫を洗浄することにより、マイクロ遠心チューブ内のすべての虫を集めます。
- 土砂線虫室温で3分間3500×gでウォームペレットを乱すことなくマイクロピペットを用いて上清を除去します。
- 各チューブ（0.4 M次亜塩素酸塩、0.5 MのNaOH）に次亜塩素酸溶液1mlを加え、3分間振とうします。
注：EMBRの大人と酸素の溶解を最適化するために、アルカリ性次亜塩素酸溶液は新たに調製されるべきであり、この溶液中の胚は穏やかに、しかし連続的に攪拌する必要がありますヨーヨー。 3分間の攪拌の後、ほとんどの大人は、溶液中に卵を解放する必要があります。 - 室温で3分間3500×gでスピンし、迅速ペレットを乱すことなくマイクロピペットを用いて上清を除去します。
- 3分間の3500×gで遠心分離したM9緩衝液1mlで4回洗浄します。
- 第四回洗浄した後、（卵は先端のプラスチックに固執するように）卵をピペッティングすることなく、M9バッファー700μlの上清および再懸濁卵を削除します。
- 3-mmのオービタルシェーカー上のテープチューブの適切な成長温度でインキュベーターに入れ、一晩600 rpmで振とうします。
- 同期幼虫の長さ測定
- 遠心分離機は、室温で3分間3500×gでのL1幼虫を逮捕し、上清を除去します。 M9緩衝液100μlに幼虫を再懸濁し、パスツールピペットを用いてアガロースパッドの上にそれらを転送する（アガロースパッドを準備する必要がありますdと1.1.8にセクション1.1.2で説明します）。パッドの上にカバースリップを置きます。
注：パッドが短い取得することを含む、この実験のためのガムで封止する必要はありません。 - 高解像度のカメラを使用する場合幼虫の長さを測定するために、10×対物レンズと位相差照明を使用します。数ミリ秒以内に画像をキャプチャし、その結果、幼虫（ 図2D）の鮮明な画像を得ることができるように光の強度を増加させます。
注：幼虫の水泳ゴミをアガロースパッドによって減少しているが、彼らはまだ動いています。そのため、高速記録が鮮明な画像を得ることが不可欠です。 - フィジー-のImageJを開き、ステップ1.3.1を繰り返します。幼虫の長さを測定するために、セグメント化されたライン・ツールを選択します。幼虫（ 図2D、右パネル）の正中線以下の尾の先端にヘッドアップの先端からセグメント化されたラインを描きます。
- 分析/測定メニューを使用して、長さを得ますマイクロメーターでの幼虫の長さに対応するに引かれた線。
- 遠心分離機は、室温で3分間3500×gでのL1幼虫を逮捕し、上清を除去します。 M9緩衝液100μlに幼虫を再懸濁し、パスツールピペットを用いてアガロースパッドの上にそれらを転送する（アガロースパッドを準備する必要がありますdと1.1.8にセクション1.1.2で説明します）。パッドの上にカバースリップを置きます。
フローサイトメトリーを使用した後期伸び欠陥の3キャラクタリゼーション
- 幼虫を同期
- よく供給された若年成人の100フルmmプレートからセクション2.1で説明したようにアルカリ性の次亜塩素酸処理を用いて胚を精製し、胚のハッチおよび20または25.5℃で24時間に16のためのM9緩衝液中のL1の停止は株に依存しましょう分析しました。
注：1株あたりも給電大人のひとつ完全版は、以下に記載の分析のために十分です。
- よく供給された若年成人の100フルmmプレートからセクション2.1で説明したようにアルカリ性の次亜塩素酸処理を用いて胚を精製し、胚のハッチおよび20または25.5℃で24時間に16のためのM9緩衝液中のL1の停止は株に依存しましょう分析しました。
- ワームソーターのキャリブレーション
注：ここで使用されるフローサイトメーターサイトメーター（以下ウォームソータという）大きな粒子の流れです。ワームソーターは、吸光検出器の前に配置されて670nmの赤色ダイオードレーザーを含みます。ワームソーターは、蛍光励起用マルチラインアルゴンレーザーが含まれています。のtandard機器三光電子増倍管（PMT）、スペクトルの緑色、黄色、及び赤色領域において蛍光発光を検出するために使用される蛍光検出器を有しています。ここで説明するプロトコルでは、TOFは、幼虫の大きさを測定するために使用され、赤のチャンネルはヨウ化プロピジウム（PI）で染色され死んだ虫を同定するために使用されます。 GP（汎用）高い蛍光コントロール粒子が機器を校正するために使用し、我々の実験における内部コントロールとして、緑、黄色と赤で高い蛍光を表示します。彼らは、緑のチャネルで検出され、高い発光を用いて分析し、試料中のオブジェクトのみとなり、その後、この特性に基づいて識別されます。
注：リビング動物は緑と赤のチャンネルにおける蛍光の不在にだけでなく、TOFに基づいて識別されます。幼虫の消化管からの自家蛍光発光は、L1段階で検出できません。- レーザーブロック、コンピュータ、コンプレッサーANに切り替えワームソーター機器をdは。機器の取扱説明書に示されているように開かれたワームソーターソフトウェアのSTARTボタンを押します。
- アルゴンレーザー制御ポップアップウィンドウを確認します。 RUNモードを選択して、レーザパワーは10±1ミリワットに達するように待ちます。レーザ制御ウィンドウで[完了]を選択します。
- シースと、それぞれ5.10±0.02および5.51±0.01への試料圧力を設定します。圧力は、少なくとも15分間平衡化し、圧力OKチェックボックスをクリックすることができます。
注：流量はシースとサンプル圧力に依存します。 - 試料カップと分析室との間の流路細管に存在するすべての気泡を排除することを確認します。これを行うには、ACQUIREをクリックし、（取得窓に見られるような）は、気泡が取得されなくなるまで静かに細管をフリック。
- 蛍光とTOF測定および検出のためのすべてのパラメータの設定次のように：
- TOF、内線、緑、黄色と赤のためのスケールを設定します表1に記載されているように256セットのゲイン。緑と黄色の700でPMTコントロールを設定し、赤のための900に。
注：2つの励起フィルターが（488 nmおよび514 nm）で入手可能であり、緑色蛍光タンパク質（GFP）または黄色蛍光タンパク質（YFP）又はマルチアルゴンレーザーをこれらの波長で励起された任意の蛍光色素のいずれかを励起するために使用することができます。適切なフィルタは、装置のフィルタチャンバ内に挿入する必要があります。私たちは、以下の実験のために488 nmのフィルターを使用していました。
- TOF、内線、緑、黄色と赤のためのスケールを設定します表1に記載されているように256セットのゲイン。緑と黄色の700でPMTコントロールを設定し、赤のための900に。
- ワームソーターを校正するには、ツールメニューの「実行制御粒子」を選択します。 （これらの粒子は、それらの機器を校正するためにフローサイトメトリーのメーカーから販売されて正確なサイズの蛍光粒子である）カップに1×GP（汎用）高い蛍光コントロール粒子の20ミリリットルを入れてください。
- シースとサンプルフローを開始しACQUIREボタンをクリックしてください。
注：21±6とACの制御粒度分布に関連した平均値を期待その平均値の周りの変動のoefficient（CV）≤11。 CVは> 11であり、平均はきれいボタンを数回クリックするか、流路をフリックすることによって細管をきれいにする> 27トライである場合。
- 動物TOFの取得
注：オブジェクトは、レーザ光源と吸光検出器との間に、フローセル内を通過するときに光が散乱します。それは、飛行物体（飛行時間、TOF）によって散乱される光のにかかる時間は、対象物の軸方向の長さを測定するために使用されます。オブジェクト（消滅、EXT）によりマスクされた光の広がりは、その不透明度/光学密度の尺度として使用されます。- 時計皿で同期野生型（wt）L1の10μLを置 き、解剖顕微鏡を使用して、デッド卵の割合を推定します。
注： 重量で高EMB（20％より高い）を表示同期L1は、さらなる分析のために使用すべきではありません。 - 転送が微量（AからL1を同期15ミリリットルコニカルチューブにL1を含むM9）のpproximately 700μlの。 10μg/ mlの（希釈の1mg / mlストック溶液から1/100）の最終濃度でヨウ化プロピジウム（PI）を加え、室温で30分間インキュベートします。
注：デッド卵や幼虫は、PIを用いて染色し、赤のチャンネルを使用して高度に蛍光性のオブジェクトとして検出されます。 - 染色された集団を希釈するためにM9バッファーの10ミリリットルを追加します。希釈された集団の5ミリリットルを取り、M9の15ミリリットルを追加することによって、それらを4倍に希釈。サンプルカップにこの希釈液を置きます。
- 流量を取得し、観察クリックすることで、サンプルフローを実行します。
注：正確な測定を得るために、流量/秒を15〜25オブジェクトをとどまるべきです。 - 必要であれば、所望の流量に到達するために、カップの動物の量を調整します。
注：意志が圧力（シースおよびサンプル）に依存する流量3.2.3にし、幼虫iの濃度に示されるように一定でありますn個のカップ。流量は25オブジェクト/秒より高い場合カップにいくつかのバッファを追加します。それは15のオブジェクト/秒未満である場合にはカップに（ステップ3.3.3から）濃縮さL1を追加します。 - オブジェクトの適切な濃度に到達すると、カップでボリュームを評価し、高蛍光GPコントロール粒子4倍溶液中でこのボリュームの1/4 番目を追加します。
- ゲーティングおよびソートパラメータを調整します。これを行うには、メニューの「ゲーティング」をクリックして、「TOF対」を選択そして、「グリーン」。メニューの「並べ替え」をクリックし、「TOF対」と「赤」を選択します。 図3（a）に示すように、ゲーティングおよびグラフィックスを並べ替えは、次に表示されます。
注：これは（緑と赤の発光）制御粒子の可視化を可能にし、PIや気泡によって染色された動物の死骸（発光緑赤ではなく）と生きた動物（緑や赤でもないチャネルにおける無発光）（ 図3A ）。 - ACQをクリックして、実験を実行します。UIRE。
注：約1万のオブジェクトなので、約8000匹の動物を、幼虫の間の小さなサイズの違いを識別、分析します。実験を停止し、STOREをクリックすることで、.txt形式などのデータをエクスポートします。
- 時計皿で同期野生型（wt）L1の10μLを置 き、解剖顕微鏡を使用して、デッド卵の割合を推定します。
- シンクロナイズド集団で生きている動物の相対的な大きさの測定
- 大規模なデータ・テーブルを管理することができるソフトウェアを使用して.txtファイルを開きます。
- 分析対象から高い100任意単位（この値はセクション3.2.5で設定したパラメータに依存する）よりも緑チャンネルに放出によって特徴付けられる制御粒子に関連したTOF値を抽出します。新しい列を作成し、「コントロール粒子」と呼んでいます。 「サンプル」と呼ばれる制御粒子を除く他のすべてのオブジェクトを含む列を作成します。注：新規の粒子バッチの蛍光発光は、取得を開始する前に確認する必要があります。これは、の識別を可能にする蛍光しきい値を設定しますL1Sを制御粒子。
- 各分析株について流量（これは例えば、卵のプラグの存在に）変更された実験の部分を識別する。そうするために：
- 時間の係数（ 図3B）として、各サンプルのための「制御粒子」のTOFをプロットします。
- トレンドラインツールを使用して線形トレンドラインを描画し、チャート上の式を表示します。
注：コントロール粒子のTOFは、時間（水平線、 図3B）にわたって一定でなければなりません。データy =斧+ bの上に描かれた線形近似曲線の方程式を考えると、 ''値が低く、10 -4であることを確認してください。制御粒子の配向破裂を表示する時間区間内で行われたすべての測定は、分析から除外されるべきです。
- 10より低いと高TOF（死んだ胚および泡（赤で15より放射高い）だけでなく、小さな破片と大きな卵のプラグを取り外し「サンプル」の測定から、それぞれ70以上より）。
- 分析した各菌株のための「制御粒子の分布をプロットします。 図3Cに見られるように、これらの分布はほぼ完全にオーバーレイする必要があります。これは、異なる株について得られたTOF測定値を比較することができることを保証します。注：サンプル中の対照粒子の分布は、対照試料のそれとオーバーレイしない場合、制御粒子上のサンプル要素TOFの正規化を使用することができます。以下のように正規化されたTOFが計算されます。
- 重量は、対照サンプルである遺伝子型G =（G用のサンプルTOF）/（Gの平均'制御粒子」TOF）×（ 重量の平均'制御粒子」TOF）のためのTOFを正規化します。
- 動物重量我々の場合（ 図3D）に、対照試料を含む各菌株のための幼虫TOF分布をプロットします。 （各集団について平均および平均の標準誤差（SEM）を測定します
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Representative Results
頭部、Tail-およびヘッド/テール幅比は、堅牢なメトリックです。
ここで説明するプロトコルは成功し、RhoのGTPアーゼPIX-1のレギュレーターおよびエフェクターの機能を特徴づけるPAK-1とlet-502を早期に伸び7時にす るために使用されている。グアニン交換因子のそれぞれがpix-1とPAK-1コード（GEF）とのRac / Cdc42のGTPアーゼのための特異的なエフェクターとlet-502 RHO-1 7用エフェクターのためのコードを。本研究では、PIX-1、PAK-1は、初期の伸び7中の表皮形態形成を制御することが示されました。メトリックとして本研究で用いたヘッドとテール幅測定は、初めての前方EMBに位置している皮下細胞を実証しますryoが、その後部7に位置するものとは異なる形態形成プログラムに従ってください。再現性及びこれらの指標の堅牢性を確立するために、ヘッド幅が1.2倍の段階で12野生型（wt）胚に独立して5回測定しました。測定5つの異なるグループ間の差異は、その後、（F-テストのp値は0.5>; 図4A）の測定値の間で有意差を明らかにしていない（R統計パッケージを使用）ブラウン・フォーサイスのテストを用いて評価して比較したグループにその測定値を示唆しています胚の再現性があります。これらの測定値に関連付けられた再現性とバッチ効果の評価は、3つの異なる日（N = 12胚）で行わ4D-DICイメージングから1.2倍の段階で重量胚のヘッド幅を測定して行われました。これらの3つの測定グループ全体で、分散は有意差はなかったと有意なバッチの効果は、ヘッドワットに影響を与えることが見出されませんでしたIDTH測定結果（F検定p -値> 0.5; 図4B）。
同様の結果は、テール幅測定のために、早期の伸びの異なる段階で行う測定のために得られた（データは示さず）。これらのデータは、初期の伸び欠陥を特徴づけるための堅牢な評価指標として、ヘッド幅、テール幅とヘッド/テール幅比を設立しました。
ヘッドとテール幅だけでなく、胚の長さを測定することは、胚の前後軸に沿って早期伸びを制御する遺伝子の解析を可能にします。
胚の長さ、ならびにそれらの頭と尾の幅の測定は、運搬重量と変異胚で行われた初期の伸びを制御する遺伝子のための機能対立遺伝子喪失の強いnullまたは感熱：PIX-1（gk416を）。PAK-1（ok448）とlet-502（sb118ts）7。私たちは、ヘッド/テール（H / T）先頭の重量及び変異胚の幅の比（1.2倍段階）を測定し、非許容温度での初期の伸びの終わりに（ 図4Cは、左と右のパネルそれぞれ）。初期の伸びの初めに何change-はありませんでしたまたは減少し、H / T比は、PIX-1で観察された、PAK-1とlet-502変異体を重量動物（1.2倍段階、 図2C、左のパネルと比較した場合、一方で図4C;右パネル））、初期の伸びの終了時にす べての3つの変異体は、 重量の胚よりも有意に高いH / T比（T検定のp -値<0.006を示しました。これがpix-1、PAK-1とlet-502変異胚は、初期の伸びの終了時に異常前後の形態を示すことを実証しました。さらなる分析はbetweeヘッド幅とテール幅を比較しますnは1.2倍段階と早期延伸の終端、同じ測定パラメータを使用すると、ヘッド幅は、PIX-1で以下の減少であることを明らかにしたPAK-1とlet-502変異体をテール幅はLET-502変異体において有意に低い低減しつつ、 7のみ。 PIX-1とPAK-1制御形態形成のプロセスは、胚7の前部で主に発生している間これは、胚の前後軸に沿って同様にそのましょう-502コントロール形態形成過程を明らかにしました。初期の伸び（ 図4D）の先頭対終わりに胚の長さの差も測定しました。我々は、初期の伸びは著しく、PIX-1に減少したことがわかったPAK-1とlet-502変異体を単独でPIX-1で前方形態形成の変化を示唆している重量とPAK-1変異体と比較すると大幅にelongatioを減少させるのに十分です胚のn個。
プロトコル2および3は、WTおよび突然変異体バックグラウンドで逮捕幼虫の長さを評価しました。 （;未発表データプロトコル3）これらの幼虫の長さは、両方の画像解析（プロトコル2）7とフローサイトメトリーを用いて評価しました。堅牢で再現性の高い方法（ 図5A）にマイクロメートルで動物の長さの絶対的な測定値の画像解析結果を用いて、幼虫の長さの測定。この分析は、wt（ 図5A）と比較した場合、同期化変異体幼虫の表示が大幅に長さを減少させたことが明らかになった7。フローサイトメトリーベースのプロトコル（プロトコル3）を使用して、これらの幼虫の測定は、同等の結果（ 図5B）を得ました。しかし、後者のアプローチを使用して測定した幼虫の多くが大幅に遺伝子型の比較（Tの統計的ロバスト性を増加させることに留意すべきです-検定p -値<10 -24）。これらの知見に基づいて、フローサイトメトリーのアプローチは、非常に微妙な伸長欠陥を表示する変異動物を特徴づけるための画像解析上のより良い選択であり得ます。
アガロースパッドの調製図。マスキングテープの二つの層で覆われた2スペーサスライドとの間に配置され、顕微鏡スライド。B、アガロースパッドは二つのスペーサースライドによってサポート別のスライドで覆われている。Cで切断した後、アガロースパッドの最終的な形状と大きさカバースリップに合わせてかみそりの刃。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
g2.jpg "/>
。図2.初期および後期伸び欠陥の測定 A - B、コンマ段階（A）での胚の長さの早期伸び（B）の終了時に測定。胚を測定するために使用される赤い線は、ImageJの。C、ヘッドとテール幅のセグメント化されたラインツールを使用して描画された1.2倍の段階で胚で測定された（左）と初期の伸び率（右）の終わりにされています。矢印は、測定領域（Martinらから変更。、2014）の局在を表します。スケールバー：20μmのD、幼虫の長さが同期L1-幼虫のために測定されます。右側のパネルは、撮影した画像（左）の拡大図です。赤い線は、ImageJののセグメント化されたラインツールを使用して描画しました。幼虫の長さを測定するために使用されます。スケールバー：100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
フローサイトメトリー。A、ゲーティングと緑と対照粒子の赤色発光を示すCOPAS Biosortのソートウィンドウを使用して同期幼虫の長さの図3.測定は 、（死者とその飛行時間型に関して生きている動物、TOFバブル）。B、代表的実験のために、異なる時点で制御粒子TOF。対時間TOFの線形関数の傾きは、対照粒子のTOF実験を通じて経時的に一定であることを示し、約10 -5である。C、制御粒子TOFSの分布は、分布の最大値のパーセンテージとして表しました。非正規化し、正規化制御粒子分布は、PAK-1（ok448）のために表されています。他のディストリビューションは、正規化されていない。D、生活のためTOFSの分布動物は分布の最大値のパーセンテージとして表しました。 TOFSが示されているようにPAK-1（ok448）を除く制御粒子上に正規化されていない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. PIX-1、PAK-1 と しましょう-502 変異体を現在の初期の伸び欠陥。 - B、再現性及びヘッド幅測定のロバスト性評価A、1.2倍段（N = 12胚）で重量の胚のためのヘッド幅の5つの独立した測定値。平均と標準偏差（エラーバー）が示されています。測定値の間に有意でない（ナノ秒）の違いは、ブラウン・フォーサイステスト（私たちを使用して計算しました。ING R統計パッケージ）（F検定p値 > 0.5）。B、三つの異なる日（N = 12胚での重量の胚のためのヘッド幅測定）。平均と標準偏差も同様に示されています。測定全体の分散に有意差はなかった（nsのは、ブラウン・フォーサイスF検定のp値 > 0.5）C、ヘッド/テール幅比の分布早期の終了時に1.2倍の段階（左パネル）、で。 重量での伸び率（右パネル）、PIX-1（gk416）、PAK-1（ok448）とlet-502（sb118ts）変異体23で- 24°C。間のこの研究のために使用させて-502ts胚の母親は25.5°C。D、 重量で伸び、PIX-1（gk416）、PAK-1（ok448）の分布で増殖させたことに注意してくださいとlet-502（sb118ts）変異体コンマステージと後期の伸びの開始。ボックスプロットは最小値、最大値、25 番目 、50 番目 （中央値）と75を表します集団の番目のパーセンタイル。 * トン検定のp -値<0.05、** トン検定のp -値<0.006（Martinらから変更。、2014）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5. PIX-1（gk416）、朴-1（ok448） とL ら-502（sb118ts） 幼虫現在の長さの欠陥。 重量で測定された幼虫の、長さ、PIX-1（gk416）、PAK-1（ok448）とlet-502（sb118ts）動物は、画像解析（プロトコル2）。B、フローサイトメーターを用いて測定した相対的な幼虫の長さを（使用して測定しますプロトコール3）。括弧内の数字は目のために使用される動物の数に対応します電子計測。長さと平均の標準誤差の手段（SEM;エラーバー）が表されています。 p値検定スチューデントのtは 。（p）が示され、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、胚性の伸びの初期および後期段階を特徴づけるために新たなメトリックを説明しました。
セクション1では、重要なステップは、パッド上の細菌の潜在的な存在です。胚は気密パッドと画像取得時のカバーガラスの間に封入されています。スライドを密閉する2時間以上持続取得中に動物の乾燥を避けるために必要とされます。我々の知る限りでは、スライドとカバーガラスの間にアガロースパッドを取り付けるために使用されるシーラーのいずれも通気性はありません。細菌（または胚）大量のパッド上に存在する場合その結果、それらは、それらの早期の死をもたらす、数時間後に酸素を奪われてもよいです。非伸長胚に比べて長さが3倍である胚に対応 - - 3倍の胚有するもの胚はtheiに移動を停止しますので、興味のある胚と一緒に記録することは、潜在的な低酸素状態の良い指標になります酸素の非存在下で卵殻をrは。形態学的測定は、低酸素状態にか死ん胚で行われるべきではありません。
タイムラプスイメージングを使用する別の重要なステップは、胚の発達が生じる温度です。感熱性の変異体は、現在、Cで使用されていますエレガンス 。温度変化の生物学的効果は、即時であるか、またはタンパク質の半減期とは、搬送突然変異の性質に応じて遅延してもよいです。したがって、胚が曝露される温度は、経時的に一定であるべきであり、顕微鏡ステージ上の顕微鏡検査室または加熱冷却室の適切な換気によって制御されるべきです。
第2節では、アルカリ性の次亜塩素酸処理を使用して、幼虫の同期に依存しています。特定の状況下では、この治療法は、胚性致死（EMB）につながる可能性があります。 重量人口の20％以上のEMBは、次亜塩素酸治療中に上昇した毒性を示唆していますマイナスの形態形成に影響を与える可能性がありメント。 重量背景に高いEMBを表示シンクロナイズドL1は、さらなる分析のために使用すべきではありません。この制限は、プロトコル3に適用されます。
私たちは、幼虫を固定化するために麻酔薬の使用をお勧めしません。特にレバミゾールは、実験的なバイアスを導入幼虫を縮小する傾向にある筋肉のテタニーの誘導を介して線虫を固定します。露光時間は、顕微鏡の制限の結果として、十分に迅速でない場合、我々は、パッド中のアガロース濃度を増加させ、パッドとカバーガラスとの間の液体の量を減少させることによって幼虫の運動性を減少させることをお勧めします。ケアは、乾燥が自分のサイズを小さくするので、幼虫を乾燥するためにはない、しかし、注意しなければなりません。
セクション3では、幼虫の長さの測定は、分析試料間の流量の比較を使用します。そうするために、制御粒子の分布は、コンパする必要があります赤。完全にオーバーレイ分布は、対応するサンプルに対して得られたTOF（飛行時間）の値を比較することができる場合ではない場合、これらの値を正規化する必要があります。 PAK-1（ok448）（ 図3C及び図5B）のために示すように、制御粒子-TOF（3.4.5.1に詳述されるように）オーバーサンプル-TOFの正規化が成功裡に使用されてきました。 重量対PAK-1（ok448）の相対的な長さを有するか、正規化せずに、少なくとも3つの独立した実験において同様であることが見出された（データは示さず）。しかし、私たちは、小さなサイズの違いで幼虫を比較する場合は特に、それなしで得られたものと正規化を用いて得られた結果を確認し、お勧めします。なお、この場合には、画像解析用として幼虫はなく、マイクロメートルでの絶対的な長さをWT、フローサイトメトリーを用いて、幼虫の長さの測定は、対照試料と長さを相対的に提供することに留意すべきです。これは、独立した実験からの測定ができないことを意味します重量の上にサイズ比を計算しない限り組み合わせること。
サンプルカップに希釈するために使用される緩衝液は、流速に影響を与えます。我々は、製造業者が推奨するシースバッファーが取得時に発生する泡の量を増大させる界面活性剤を含有することを観察しました。界面活性剤を含まない、M9緩衝液を使用して、有意に気泡の形成を減少させたが、試料の流速に影響するソーターの細管に卵の詰まりを回避するにはあまり効率的でした。卵詰まりを簡単に数秒間も上昇TOF-続いて、数秒のための制御粒子の観察可能なTOFの著しい減少により取得中に検出されます。卵の目詰まりは、チャネルの閉塞および粒子の流れ（毎秒未満、5オブジェクト）の完全な逮捕につながる可能性があります。これが発生した場合、流量が回復するまで、CLEANボタンをクリックします。これらのイベント中に発生した任意の測定sがデータ分析から除外されるべきです。シースバッファが死んだ卵率の高さによって特徴づけられる株を含む実験のために推奨されることがあります。
（ステップ3.2.3に設定）試料とシース圧力は、経時的に（わずかに）変わることがあり、非常に一定の流量を確保するために、実験を通して手動で調整されるべきです。結果を分析し、（ 図3C）は、時間の経過制御粒子のTOFSをプロットすると、低速度の低下または上昇が観察可能になります。流量の増加が逆になりながら、流量の減少は、経時的な粒子の平均TOFSの増加をもたらします。流量の変化は、負の幼虫の集団間の小さいサイズの違いを検出する方法の感度に影響を与えます。
伸びを制御する遺伝子を同定することを目的とタイムラプス顕微鏡記録を必要とする方法が一般的に高いですいくつかの遺伝子型を表現型検査時LY時間がかかり、面倒。フローサイトメーターベースのアプローチ、すべての研究室が利用できない機器を必要としながら、いくつかの株を特徴付けする必要が少ない時間がかかり、結果的に、より効率的です。 （変異体および重量 TOF分布を比較する学生のt検定によって評価; 図5AおよびB）。この方法は、画像解析を用いた測定に比べても、より統計学的に堅牢です。この方法は、次に低い表現性/浸透度で伸長欠陥を発現する株のために非常に適切であり得ます。
フローサイトメトリーを使用していくつかの方法は、線虫9-12の適合性を測定するために過去に開発されてきました。これらの方法は、96ウェルプレートに分注し動物やワームソーター」のリフレックスモジュールを使用しています。リフレックスモジュールは、96ウェルプレート内に分配線虫の人口の直接分析を可能にします。したがって、これらの方法は、characteすることができ一日あたりの条件の何百ものリゼと非同期人口の適応度を測定するで堅牢な方法を構成しています。それらは、しかしながら、よく同期さL1との間の小さいサイズの違いを識別するために適していません。 L1幼虫の間のわずかな差の測定は、96ウェルプレートのかつ効率的にウェルあたり最大で100個のオブジェクトを特徴付けることができる反射モジュールの使用と互換性がない多数の動物、全体の測定が必要です。ここに記載される方法が大幅に低減されたスループットを犠牲にして、この目的のために設計されています。これは、プロトコル2の画像解析を用いにわたって著しく改善され、機器が校正され、1時間に1回3〜4の条件の特徴付けを可能にします。
ヘッドとテール幅比の測定は、胚7の前後軸に沿って不均一に発生する形態形成のプロセスを特徴付けるために開発された最初の方法です。いつ初期の伸びを制御することが示された遺伝子に適用し、これらの方法は、その段階で形態形成を制御するシグナル伝達経路の空間的分布を明らかにする。画像解析または初期伸長の終了時に、胚の長さの測定値と組み合わせて、フローサイトメトリーのいずれかを使用して逮捕幼虫の長さの測定は、高い感度と精度の初期または後期伸長または両方を制御する遺伝子の同定を可能にします。これらの手順は、次にCで胚伸びを制御するシグナル伝達経路の空間的および時間的規制の将来の理解に大きく寄与することができますエレガンス 。さらに、これらのアプローチはまた、インスリンおよびTGF-βのような身体の長さを制御するシグナル伝達経路を研究するために適合させることができ、環境汚染物質15、13〜16、14および慢性暴露の経路。これらの測定は、異なる幼虫段階でまたはusin成人で行うことができL1におけるプロトコル2,3測定サイズの違いのグラム軽微な変更は、L3、L4幼虫や成虫などのより大きな物体よりもワームソーターと、より挑戦的です。プロトコル3は簡単にこれらの測定を行うように構成することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
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