Introduction
For næsten 50 år har nematode Caenorhabditis elegans etableret sig som en stærk model til at studere vigtige spørgsmål i udvikling, neurobiologi, evolution, vært-patogen interaktioner, etc. 1 Styrken af denne model i studiet af udviklingen ligger i: sin korte levetid 3 dage; den lethed, hvormed disse dyr kan være genetisk ændret; gennemsigtighed, der muliggør observation af celle fordrivelse og morfologi i levende dyr og dets udvikling, der er for det meste ekstra-uterin. De udviklingsmæssige stadier af rundorm involverer embryogenese og fire larvestadier (L1 til L4), efterfulgt af voksenalderen. Under fosterudviklingen, epidermal morfogenese tiltrak stor opmærksomhed for sin evne til at muliggøre en bedre forståelse af, hvordan epitelial celler migrerer som en gruppe, hvordan de omlægge deres kryds og ændre deres individuelle morfologi samt deres relative positionering inden for en funktionel epitel.Epidermal morfogenese er opdelt i fire faser: dorsal intercalation består i reorganiseringen af dorsale epidermale celler, kaldet hypodermis; ventrale kabinet, som består i migration af ventrale hypodermal celler mod ventrale midterlinjen dermed omslutter embryo i en epitelcelle monolag; tidlig og sen forlængelse omdanne bønne-formede embryo i vermiform larver. Efter morfogenese, embryo luge og L1 larver begynde at fodre ved hjælp af tilgængelige bakterier i deres nærmiljø.
Embryonale forlængelse er derfor en sene fase af den embryoniske udvikling. Den består af en forlængelse af embryonet langs sin længdeakse og en reduktion af dens tværgående diameter. Dette indebærer en dramatisk ændring af formen af hypodermal celler. Forlængelse er opdelt i en tidlig og en sen fase. Den tidlige fase starter ved komma scenen og slutter, når krop-væg muskler begynder ordregivende på 1,75 gange etape i wild-type (wt) embryoner - svarende til embryoner, der er 1,75 gange i længden i forhold til ikke-aflange embryoner. Morfogene processer, der forekommer i denne fase er primært drevet af sammentrækning af filamentøse actin bundter (FBS) placeret ved den apikale pol af hypodermal celler, der driver deres forlængelse langs antero-posteriore akse af embryonet 2. Sammentrækning af FBs er kontrol phosphorylering af myosin-lette kæder af tre kinaser LET-502 / ROCK, MRCK-1 og PAK-1 5. Den sene fase af forlængelsen, starter, når krop-væg muskler bliver funktionelle og starte ordregivende. Det indebærer mechanotransduction signalering fra kroppen væg muskler til dorsale og ventrale hypodermal celler og slutter, når dyr klækkes 3.
Forlængelse defekter er generelt karakteriseret ved procentdelen af dyr, der dør som fostre (Embryonale dødelighed, Emb), og dem arrestere deres udvikling som L1 larver (Larve anholdelse fænotype; Lva) og være betydeligt kortere end vægt. Identifikation af den fase af udviklingsmæssige anholdelse kræver mikroskopisk observation af døde fostre og anholdt Larver 3-6.
Det blev for nylig vist, at adskillige gener, såsom Cdc42 / Rac regulator og effektor pix-1 og pak-1, kontrollere morfogene processer under både tidlig og sen forlængelse 3,7. Vi har også for nylig viste, at morfogene processer adskiller langs antero-posterior akse af embryonerne under tidlig forlængelse 3 7. Disse resultater motiveret udviklingen af nye målinger specifikt er rettet mod tidlige eller sene forlængelse stadier og andre målinger muliggør karakteriseringen af morfologi af embryoner langs deres antero-posterior akse under tidlig forlængelse.
Disse hidtil ukendte metoder består i måling af længden af embryoner ved begyndelsen og slutningen af tidlig forlængelse samt bredden af deres hanannoncer og haler. 7 To protokoller blev også udviklet til at måle længden af nyklækkede larver, synkroniseret på L1 fase 7.
De æggeskaller af embryonerne beskytte dem mod alkalisk hypochlorit behandling, mens larver, voksne og bakterier til stede i dyrkningsmedierne opløses ved behandlingen. Denne behandling anvendes derefter til at oprense embryoner fra en ikke-synkroniseret population indeholdende et flertal af velnærede voksne 8. Fødebegrænsning anvendes til at synkronisere nyklækkede larver. Måle længden af disse larver anvendes derefter til påvisning af brudforlængelse defekter. Denne måling er foretrukket i forbindelse med måling af anholdt larver på dyrkningsplader fordi larver, der klækkes fra ikke-fuldt aflange embryoner kan genvinde til "normal længde" når fodring, men vil fastholde deres reducerede størrelse, når anholdt i fravær af fødevarer.
Her præsenteres detaljerede protokoller muliggør målingen af length af forlængede embryoner samt bredden af deres hoved og hale ved hjælp af time-lapse DIC mikroskopi og billedanalyse (Protokol 1). Vi leverer også detaljerede protokoller til at måle længden af synkroniseret larver hjælp billedanalyse (protokol 2) og Flow-cytometri (protokol 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Karakterisering af Early Forlængelse Fejl i WT og Mutant Dyr
- Montering Embryoner til Normarski DIC Microscopy
- Forbered følgende dyrkningsmedier og materiale:
- M9 Buffer, opløses 12,8 g / l Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / l KH 2 PO 4, 5 g / l NaCl, 0,25 g / l MgSO4 • 7H 2 O i destilleret vand og autoklaver til sterilisering.
- NGM plader, opløses 3 g / l NaCl, 16 g / l agar, 2,5 g / l bactopepton i Hedeselskabet 2 O. Autoklaven, og der tilsættes 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 1 mM phosphatbuffer og 5 ug / ml cholesterol. Hæld 6 ml NGM pr 60 mm skåle. Lad mediet at størkne i 24 timer ved stuetemperatur. Tilføj et par dråber af en mættet kultur af E. coli OP50 bakterier dyrket i Luria-bouillon (LB). Lad bakterierne vokse i 48 timer og opbevares pladerne ved 4 ° C.
- For at generere ormen pick, montere en 0,01 "diameter platintråd på en kort Pasteur pipette. Fastgør platintråden til ekstremiteten af glaspipette ved opvarmning af denne ekstremitet med benzen brænder. Glat ende af tråden til at generere en slags skovl.
- Grow ormen pres på 60 mm NGM plader med OP50 ved 20 ° C.
BEMÆRK: varmefølsomt alleler kan kræve voksende dyrene på ikke-permissive temperaturer op til 25,5 ° C. Plader bør indeholde mange unge voksne og stadig masser af fødevarer for at forfølge de protokoller. - Placer et objektglas mellem to afstandselementer objektglas dækket af to lag afdækningstape (figur 1A).
- Der fremstilles en 3% agaroseopløsning (vægt / rumfang) i M9-puffer ved opløsning af 0,6 g agarose pulver i 20 ml M9-puffer ved opvarmning i mikrobølgeovn i 30 sek. Lad opløsningen køle af i 5 min.
BEMÆRK: agaroseopløsning kan anvendes i et par dage efter smeltning i en mikrobølgeovn. Detkan også alikvoteret og opbevaret ved 4 ° C i flere uger. - Placer en dråbe af varm 3% agarose løsning på objektglas placeret mellem de to afstandselementer-objektglas. Undgå dannelse af bobler.
- Hurtigt dække agarose med et andet dias, som vist i figur 1B, og tryk forsigtigt ned. Tværslæde vil flade agarose drop og generere en pude med tykkelsen af to lag af afdækningstape.
- Tillad agarose at størkne i mindst 1 minut ved stuetemperatur eller indtil embryonerne er klar til at blive overført til puden.
- Ved hjælp af en orm pick overfører 20 til 30 mætte unge voksne fra NGM-plade i en mikro-centrifuge rør indeholdende 400 pi M9 buffer.
- Tillad ormene at sedimentere ved hjælp af tyngdekraften i ca. 5 minutter og fjern supernatanten under anvendelse af en mikropipette. Dette trin har til formål at fjerne den maksimale af bakterier plukket med nematoderne.
- Tilsæt 200 pi M9 buffer til hvert rør.
- Ved hjælp af en Pasteur pipette, overføre indholdet af røret (puffer og nematoder) til et urglas.
- Brug en eller to 25G 5/8 "nåle til at skære dyrene midt på kroppen sektionen (mellem spermatheca og vulva).
BEMÆRK: En skalpel kan også anvendes som et alternativ til p (r). Gør dette på svømning nematoder og kan kræve lidt øvelse. Ideen er at bruge nåle som saks eller en kniv afhængig af hvor mange nåle anvendes. Når dyrene er skåret op, hermafroditter frigive deres embryoner i bufferen. - Koncentrer embryoer ved midten af urglasset gennem generering af en cirkulær hvirvelstrøm i væsken.
- Fjerne det meste af M9 fra urglasset anvendelse af en mikropipette. Efterlad ca. 30 pi M9 med embryonerne.
- Fjern slæden dækker agarose pude (figur 1B) ved at skubbe den væk fra puden.
- Skær puden med et barberblad for at være i stand til helt at dække den med et dækglas (Figur 1C).
- Ved hjælp af en Pasteur-pipette, overføre alle de embryoner (og orm snavs) på agarose pad.
- Gruppen embryonerne i centrum af puden under anvendelse af et øjenvipper limet ved enden af en spids anvendes til 200 pi mikropipetter.
- Placer langsomt et dækglas på puden undgå boble dannelse og forsegle den.
BEMÆRK: Flere sealere kan anvendes. Vi bruger tegning tyggegummi findes i kunst og håndværk butikker (normalt bruges som maskering tyggegummi til akvarel maleri). bruges Denne gummi, fordi det er hydrofilt og størkner rimeligt hurtigt og ikke er toksisk for orme. Slides kan også forsegles med neglelak eller VALAP (blanding lavet af vaseline, lanolin og Parafin voks). - Tillad tegningen tyggegummi tørre i ca. 15 min.
- Forbered følgende dyrkningsmedier og materiale:
- Optagelse Tidlig Forlængelse hjælp Fire-dimensional Normarski DIC Microscopy
BEMÆRK: Formålet med dette trin er at registrere tidlig forlængelse fra komma til begyndelsen af sene forlængelse- Defineret som det tidspunkt, hvor kroppen væg muskler begynder ordregivende. Vi sigter også mod at optage mere end ét embryon på det tidspunkt. Otte timers optagelse er normalt forpligtet til at registrere tidlig forlængelse for en gruppe af ikke-synkroniserede embryoner.- Placer monterede-slide på scenen af et mikroskop. Sørg for, at mikroskopet er udstyret med 10X og 60X mål samt DIC linser, prisme, kamera og capture software muliggør time-lapse mikroskopi og generering af Z-stakke (automatiseret Z-platform).
BEMÆRK: sikre, at temperaturen er konstant mellem 20 og 23 ° C i mikroskopi rum. En opvarmning-køling kammer kan være påkrævet på mikroskopet scenen, især når du bruger varmefølsom mutanter. - Identificer en gruppe af embryoner på pre-morfogenese faser ved hjælp af 10X-objektivet.
- Når placeret, glide af 10X objektiv og tilføje en dråbe immersionsolie på objektglasset.
- Brug af 60X objektiv, identificere toppen og bunden af embryos at opsætte Z-stack imaging parametre.
BEMÆRK: Tøv ikke med at indstille Z-stakken større end tykkelsen af embryonerne. Indstil afstanden mellem to tilstødende planer som 0,8 um. Dette vil gøre det muligt at dække den samlede dybde af embryonerne i 35 til 50 Z-planer.
BEMÆRK: Hvis mikroskop indeholder en automatiseret xy-platform, kunne embryoner placeret på forskellige steder af puden registreres samtidigt. For at gøre dette, optage xy koordinater af hvert sted på puden, du ønsker at analysere i løbet af forsøget. Sørg for at vælge den xy ved indstilling optagelsen parameter og følg resten af protokollen som angivet. Tynd Z-sektionering af embryoet under optagelse ikke nødvendigvis påkrævet for målingerne beskrevet i denne protokol. Optagelse fosterudviklingen af wt og mutant dyr med den maksimale opløsning er dog en god praksis for at opbygge et bibliotek af optagelser i stand til at støtte yderligere analyser. - Sætop time-lapse med 2 min intervaller mellem to opkøb varede 8 timer.
BEMÆRK: eksponeringstid afhænger lysintensiteten fastsat for mikroskopet. Cell bevægelse under tidlig forlængelse er meget langsom; eksponering-tiden kunne være ca. ét billede per sekund eller mindre. Hvis embryonerne er på tidlige morfogenese stadier (dorsale indlejringsforbindelser, ventral kabinet), ville tidlig forlængelse registreres inden for 1 time. Sørg lys lukkeren er lukket mellem hver erhvervelse. - Kør erhvervelse og gemme det.
- Placer monterede-slide på scenen af et mikroskop. Sørg for, at mikroskopet er udstyret med 10X og 60X mål samt DIC linser, prisme, kamera og capture software muliggør time-lapse mikroskopi og generering af Z-stakke (automatiseret Z-platform).
- Måling af tidlige Forlængelse Mangler hjælp billedanalyse
- Open Fiji-ImageJ software ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- I menuen Vælg Analyze / Set Målinger Vælg Perimeter. For hver embryo, justere Z-skala bar at fokusere på svælget af embryoet som vist i figur 2A. Dette vil sikre, at du fokuserer på midten af embryoet. For at måle længden af embryonet, justere tiden skala bar have embryo af interesse ved starten af den tidlige forlængelse (komma fase; figur 2A). Bemærk tiden ( "Time-begyndelsen").
- Vælg den segmenterede linie værktøjet. Tegn en segmenteret linie fra spidsen af munden af embryoet op til spidsen af halen efter midterlinjen af embryo (figur 2A). Brug af fanen menuen Analyser / Mål, få længden af den tegnede linie ( "længde begyndelsen").
- Gentag denne måling for den samme embryo i slutningen af tidlig forlængelse (øjeblik, hvor musklerne begynder ordregivende). Bemærk tiden ( "Time-end") og måle længden af embryo ( "længde-end") som beskrevet ovenfor (figur 2B).
- Beregn varigheden (D) af tidlig forlængelse og stigningen længde (L) i denne fase som følger:
D = "Time-end" - "Time-begyndelsen"
& #160; L = "Længde-end" - "Længde-begyndelsen" - For at måle hovedet bredde, justere tiden skala bar for at have et foster i den fase af interesse (1,2 gange stadie eller slutningen af tidlig forlængelse). Vælg den lineære værktøj. Tegn det tværgående (dorso-ventrale akse) midterlinjen af hovedet. Denne sektion er den tykkeste del af embryoet (figur 2C). Brug af menuen Analyser / Mål, få længden af linjen til hovedet bredde.
- Samtidig punkt, gentage dette trin ved at tegne den tværgående midterlinje af halen (Mid-line mellem den intestinale ventil og spidsen af halen, figur 2C) og måle det at opnå halen bredde.
BEMÆRK: Brug denne måling til at sammenligne embryoer på samme trin på tværs af forskellige fænotyper. For at sikre reproducerbarheden af denne måling, sørge for at finde et sted placeret omkring midterlinjen af halen af dyret, der let kan genkendes fra et dyr til etnother. - For at beregne hoved til hale breddeforhold, opdele hovedet bredde i halen bredde.
2. Karakterisering af Late Forlængelse Mangler Brug billedanalyse
- Synkronisering af L1 larver hjælp Alkaline Hypochlorit Behandling
- Fra en ikke-udsultet 60 mm plade indeholdende mange drægtige voksne, indsamle alle orme i en mikro-centrifugerør ved at vaske nematoder fra pladen med 1 ml M9-puffer under anvendelse af en Pasteur-pipette.
- Sediment nematoder ved 3.500 xg i 3 min ved stuetemperatur og fjern supernatanten under anvendelse af en mikropipette uden at forstyrre ormen pellet.
- Der tilsættes 1 ml hypochloritopløsning til hvert rør (0,4 M hypochlorit, 0,5 M NaOH) og rystes i 3 min.
BEMÆRK: bør være forberedt Alkalisk hypochloritopløsning frisk og embryoner i denne opløsning bør rystes forsigtigt, men løbende at optimere opløsningen af de voksne og iltning af brodeYOS. Efter 3 min agitation, bør de fleste voksne frigive deres æg i løsningen. - Spin ved 3.500 xg i 3 minutter ved stuetemperatur og hurtigt fjerne supernatanten under anvendelse af en mikropipette uden at forstyrre pelleten.
- Udvaskes fire gange med 1 ml M9-puffer efterfulgt af centrifugering ved 3.500 x g i 3 min.
- Efter den fjerde vask, Fjern supernatanten og resuspender æg i 700 ul M9 buffer uden pipettering op æggene (som æggene ville holde sig til plast af spidsen).
- Tape røret på en 3-mm orbitalryster anbragt i en inkubator ved en passende temperatur vækst og rystes ved 600 rpm natten over.
- Længde Måling af Synkroniseret Larver
- Centrifuger standset L1 larver ved 3.500 xg i 3 minutter ved stuetemperatur og fjern supernatanten. Resuspender larver i 100 pi M9 buffer og overføre dem til en agarose pad under anvendelse af en Pasteur-pipette (agarose pads bør forbereded som beskrevet i afsnit 1.1.2 til 1.1.8). Placer et dækglas på puden.
BEMÆRK: Puden er ikke nødvendigt at forsegles med gummi til dette eksperiment, der involverer korte erhvervelse. - Brug en 10X objektiv og fasekontrastbelysning at måle længden af larverne hvis der anvendes en høj opløsning kamera. Øge intensiteten af lyset for at kunne tage billeder i løbet af få millisekunder og dermed få et klart billede af larverne (figur 2D).
BEMÆRK: Mens svømning trashes larver reduceres med agarose pad, er de stadig i bevægelse. Derfor, hurtig optagelse er afgørende for at få et klart billede. - Åbn Fiji-ImageJ og gentag trin 1.3.1. At måle længden af larver, vælge den segmenterede linie værktøjet. Tegn en segmenteret linie fra spidsen af hovedet op til spidsen af halen efter midterlinjen af larver (figur 2D, højre panel).
- Brug af menuen Analyser / Mål, få længden aftrukket linie svarende til længden af larverne i mikrometer.
- Centrifuger standset L1 larver ved 3.500 xg i 3 minutter ved stuetemperatur og fjern supernatanten. Resuspender larver i 100 pi M9 buffer og overføre dem til en agarose pad under anvendelse af en Pasteur-pipette (agarose pads bør forbereded som beskrevet i afsnit 1.1.2 til 1.1.8). Placer et dækglas på puden.
3. Karakterisering af Late Forlængelse Mangler anvendelse af flowcytometri
- Synkroniser Larver
- Rense fostre ved hjælp af den alkaliske hypochlorit behandling som beskrevet i afsnit 2.1 fra fuld 100 mm plader af velnærede unge voksne og lad embryo lugen og L1 anholdelse i M9 buffer for 16 til 24 timer ved 20 eller 25,5 ° C afhængigt af stammen analyseret.
BEMÆRK: En fuld plade af velnærede voksne pr stamme er tilstrækkelig for analysen er beskrevet nedenfor.
- Rense fostre ved hjælp af den alkaliske hypochlorit behandling som beskrevet i afsnit 2.1 fra fuld 100 mm plader af velnærede unge voksne og lad embryo lugen og L1 anholdelse i M9 buffer for 16 til 24 timer ved 20 eller 25,5 ° C afhængigt af stammen analyseret.
- Kalibrering af Worm Sorter
BEMÆRK: flowcytometer anvendt her er en stor partikel flowcytometer (herefter kaldet ormen sorteringsanlæg). Ormen sorteringsanlæg indbefatter et 670 nm rød diodelaser, som er beliggende foran en udslettelse detektor. Ormen sorteringsanlæg indeholder også en multi-line argon laser til fluorescerende excitation. standard instrumenter har tre fotomultiplikatorrør (PMT) fluorescensdetektorer anvendes til påvisning af fluorescens-emissioner i de grønne, gule og røde områder af spektret. I protokollen beskrevet her, vil TOF bruges til at måle størrelsen af larverne, vil den røde kanal anvendes til at identificere døde orme, der vil blive farvet med propidiumiodid (PI). GP (General Purpose) Høj Fluorescens Kontrol Partikler bruges til at kalibrere instrumentet og som en intern kontrol i vores eksperiment vise høj fluorescens i grøn, gul og rød. De vil være de eneste genstande i analyseret med høj emission påvist i den grønne kanal prøve og vil efterfølgende blive identificeret på grundlag af denne egenskab.
BEMÆRK: Living dyr identificeres baseret på fraværet af fluorescens i den grønne og røde kanal samt på TOF. Autofluorescerende emission fra tarmen af larverne ikke kan detekteres på L1 fase.- Tænd for laseren blokken, computeren kompressoren end ormen sorteringsanlæg instrument. Tryk på START-knappen på den åbnede ormen sorteringsanlæg software som angivet i brugsanvisningen af instrumentet.
- Overhold argon laser kontrol pop-up vindue. Vælg RUN-modus og vente, da laser beføjelser nå 10 ± 1 mW. Vælg Udført på laser kontrol vinduet.
- Sæt kappen og prøven presset til 5,10 ± 0,02 og 5,51 ± 0,01 hhv. Lad trykket til ligevægt i mindst 15 minutter, og klik PRESSURE OK afkrydsningsfelt.
BEMÆRK: Strømningshastigheden afhænger af hylsteret og prøve- tryk. - Sørg for at fjerne alle bobler til stede i de flow-kanal tubuli mellem prøvekoppen og analyserende kammer. For at gøre dette, skal du klikke på erhverve og knips forsigtigt på tubulus, indtil der ikke boble erhverves (som ses i vinduet erhvervelse).
- Opsætning af alle parametre for lysstofrør og TOF måling og detektion som følger:
- Indstil skalaer for TOF, Ext, grøn, gul og rød til256. Set gevinst, som beskrevet i tabel 1. Set PMT Kontrol ved 700 for Grøn og gul og til 900 for Red.
BEMÆRK: To excitationsfiltre er tilgængelige (488 nm og 514 nm) og kan anvendes til at excitere enten grønt fluorescerende protein (GFP) eller gult fluorescerende protein (YFP) eller eventuelle fluorochromer exciteret ved disse bølgelængder med flere linjer argon laser. Passende filtre skal indføres i filterkammeret af udstyret. Vi bruges 488 nm filter for følgende eksperiment.
- Indstil skalaer for TOF, Ext, grøn, gul og rød til256. Set gevinst, som beskrevet i tabel 1. Set PMT Kontrol ved 700 for Grøn og gul og til 900 for Red.
- For at kalibrere ormen sorteringsanlæg, vælg "Kør kontrol partikler" i værktøjet menuen. Sæt 20 ml 1x GP (General Purpose) Høj Fluorescens Kontrol Partikler i koppen (disse partikler er fluorescerende partikler af præcis størrelse, der sælges af cytometri producenten at kalibrere deres instrument).
- Klik på Acquire knappen for at starte kappe og prøve flow.
BEMÆRK: Forvent en gennemsnitlig relateret til kontrol partiklerne af 21 ± 6 og acoefficient variation omkring dette gennemsnitlige (CV) ≤11. Hvis CV er> 11 og gennemsnittet er> 27 forsøge at rense tubuli ved at klikke flere gange på det rene knap eller ved at stille flow-kanal.
- Erhvervelse af Animal TOF
BEMÆRK: Lys scatters når et objekt passerer i flowcellen mellem laserkilden og udslettelse detektor. Den tid det tager for lys bliver spredt af flyvende objekt (time of flight, TOF) anvendes til at måle den aksiale længde af objektet. Omfanget af lys maskeret af objektet (ekstinktion, EXT) anvendes som et mål for dets opacitet / optisk densitet.- Til 10 pi synkroniseret vildtype (wt) L1 i et urglas og estimere procentdelen af døde-æg ved hjælp et dissektionsmikroskop.
BEMÆRK: Synkroniseret L1 udviser høj Emb (højere end 20%) i vægt bør ikke anvendes til yderligere analyse. - Overførsel synkroniseret L1 fra mikrocentrifuge (approximately 700 pi M9 indeholdende L1) til et 15 ml konisk rør. Tilføj propidiumiodid (PI) i en endelig koncentration på 10 pg / ml (fortynding 1/100 th fra en 1 mg / ml stamopløsning) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Døde æg og larver vil farves ved hjælp PI og detekteret som yderst fluorescerende objekter ved hjælp af røde kanal. - Der tilsættes 10 ml M9 buffer at fortynde farvede befolkninger. Tag 5 ml af de fortyndede befolkninger og fortyndes dem fire gange ved at tilsætte 15 ml M9. Placer denne fortynding i prøvekop.
- Kør prøven flow ved at klikke erhverve og observere flowet.
BEMÆRK: For at have nøjagtig måling, bør strømningshastigheden bo mellem 15 og 25 genstande / sek. - Hvis det er nødvendigt, at justere mængden af dyr i koppen for at nå den ønskede flow.
BEMÆRK: Strømningshastigheden vil afhænger af trykkene (kappe og prøve), som er konstante som angivet i 3.2.3 og af koncentrationen af larver in koppen. Hvis flowet er højere end 25 genstande / sek tilføje nogle buffer i koppen. Hvis den er lavere end 15 objekter / sek tilføje koncentreret L1 (fra trin 3.3.3) i koppen. - Når den passende koncentration af objektet er nået, vurdere volumen i koppen og tilsæt 1/4 th af denne mængde i High Fluorescent GP Kontrol Partikler 4x løsning.
- Juster gating og sortering parameter. For at gøre dette, skal du klikke på 'gating' på menuen og vælg 'TOF vs.' og 'Grøn'. Klik på 'Sortering' på menuen og vælg 'TOF vs. "og" Red ". Gating og sortering grafik vises derefter som vist i figur 3A.
BEMÆRK: Dette vil tillade visualisering af kontrol partikler (emission i grøn og rød), døde dyr farvet af PI og bobler (emission i Red og ikke grøn) og levende dyr (ingen emission i hverken Grønne eller røde kanaler) (figur 3A ). - Kør eksperimentet ved at klikke ACQUire.
BEMÆRK: For at identificere små størrelse forskelle mellem larver, analysere omkring 10.000 genstande, så cirka 8.000 dyr. Stop eksperimentet og eksportere data som .txt-format ved at klikke på STORE.
- Til 10 pi synkroniseret vildtype (wt) L1 i et urglas og estimere procentdelen af døde-æg ved hjælp et dissektionsmikroskop.
- Måling af den relative størrelse af Leve- Dyr i Synchronized populationer
- Åbn .txt fil ved hjælp af en software i stand til at håndtere store datatabeller.
- Fra de analyserede objekter udtrække TOF værdier forbundet med kontrol-partikler, der er karakteriseret ved emission i den grønne kanal højere end 100 arbitrære enheder (denne værdi afhænger af de parametre, der er i afsnit 3.2.5). Opret en ny kolonne, og kalder det "kontrol partikler". Opret en kolonne, der indeholder alle de andre objekter undtagen kontrol partikler kaldet "prøve". BEMÆRK: fluorescens emission af nye partikel batch, skal bekræftes, før du starter opkøb. Dette vil sætte den fluorescerende tærskel grundlag for udvælgelsen afkontrol partikler end L1S.
- For hver analyseret stamme identificere den del af eksperimentet hvor strømningshastigheden er blevet ændret (på grund af tilstedeværelsen af en prop af æg for eksempel). For at gøre det:
- Plot TOF af 'kontrol partikler "for hver prøve som en faktor af tid (figur 3B).
- Tegn den lineære tendenslinje hjælp tendenslinjen værktøj og vise ligningen på kortet.
BEMÆRK: TOF af kontrol- partikler skal være konstant over tid (vandret linje, figur 3B). I betragtning af ligningen for den lineære tendenslinje trukket på data y = ax + b, sørge for, at "a" værdi er lavere, at 10 -4. Alle målinger foretaget inden tiden sektioner viser et brud i tilpasningen af kontrol partikel bør fjernes fra analysen.
- Fjern de døde fostre og bobler (emission højere end 15 i den røde) samt små vragrester og store æg stik (TOF lavere end 10 og højis end 70 henholdsvis) fra "prøve" måling.
- Plot kontrolsystemer partikler 'fordeling for hver stamme analyseret. Som det ses i figur 3C disse distributioner bør overlay næsten perfekt. Dette sikrer, at TOF målinger opnået for forskellige stammer kan sammenlignes. BEMÆRK: normalisering af prøven elementer TOF løbet kontrol partikler kan anvendes, hvis fordelingen af kontrol- partikler i en prøve ikke overlay med det af kontrolprøver. Normaliseret TOF beregnes som følger:
- Normalisér TOF for genotype G = (prøve TOF for G) / (gennemsnitlig 'kontrol partikel' TOF for G) x (gennemsnitlig 'kontrol partikel' TOF for wt) hvor wt er kontrolprøven.
- Plot Larver TOF fordeling for hver stamme, herunder kontrolprøve, i vores tilfælde vægt dyr (figur 3D). Mål middelværdien og standardfejlen af middelværdien (SEM) for hver population (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hoved-, bag- og hoved / Tail bredde Ratio er robuste Metrics.
De her beskrevne protokoller med succes er blevet anvendt til at karakterisere funktionen af regulatorer og effektorer i Rho GTPaser pix-1, pak-1 og lad-502 under tidlig forlængelse 7. Pix-1 og pak-1 kode for henholdsvis en guanin-exchange faktor (GEF) og en effektor specifik for Rac / cdc42 GTPaser og lad-502 koder til en effektor for RHO-1 7. I denne undersøgelse blev PIX-1 og pak-1 vist at styre epidermal morfogenese under tidlig forlængelse 7. Denne undersøgelse anvendte hoved og hale bredde måling som metrics demonstrerer for første gang, at hypodermal celler placeret i den forreste embryo følge forskellige morfogene programmer end dem, der findes i dens bageste 7. At etablere reproducerbarhed og robusthed af disse målinger, blev hoved bredde målt uafhængigt fem gange på 12 vildtype (wt) embryoner på 1,2 gange fase. Afvigelser blandt de fem forskellige grupper af målingen blev sammenlignet derefter vurderet ved hjælp af Brown-Forsythe test (ved hjælp af R statistisk pakke) afslører ingen signifikante forskelle mellem målinger (F- test p-værdi> 0,5; figur 4A) tyder på, at målinger for en gruppe af embryoner er reproducerbare. Vurdering af reproducerbarhed og batch virkninger forbundet med disse målinger blev gjort gennem måling af hovedet bredde wt embryoer på 1,2 gange etape fra 4D-DIC billeddannelse udført på tre forskellige dage (n = 12 embryoner). På tværs af disse tre målinger på grupper, variansen var ikke signifikant forskellig, og ingen signifikante batch blev ikke fundet påvirke hovedet-width måleresultater (F-test p-værdi> 0,5, figur 4b).
Lignende resultater blev opnået for hale breddemålinger og for målinger foretaget på forskellige stadier af tidlig forlængelse (data ikke vist). Disse data etablerede head-bredde, hale-bredde og hoved / hale breddeforhold som robuste målinger til at karakterisere tidlige brudforlængelse defekter.
Måling hoved og hale Bredde samt længde af embryonerne Giver til karakterisering af gener, der kontrollerer Tidlig Forlængelse langs Antero-posterior akse af embryo.
Måling af længden af embryonerne, såvel som bredden af hovedet og halen blev udført på wt og muterede embryoner med null eller varmefølsomt stærk tab af funktion alleler for gener, der kontrollerer tidlig forlængelse: PIX-1 (gk416);pak-1 (ok448) og lad-502 (sb118ts) 7. Vi målte hoved / hale (H / T) breddeforhold på wt og muterede embryoner i begyndelsen (1,2 gange etape) og i slutningen af den tidlige forlængelse ved ikke-permissive temperaturer (figur 4C venstre og henholdsvis højre panel). Mens i begyndelsen af tidlig forlængelse var der ingen ændring-eller en reduceret H / T-forholdet blev observeret i billed 1, pak-1 og lad-502 mutanter i sammenligning med wt-dyr (1,2 gange stadium, figur 2C, venstre panel ), ved slutningen af tidlig forlængelse alle tre mutanter viste en signifikant højere H / T-forhold end wt embryoner (t-test p -værdier <0,006, figur 4C; højre panel). Dette viste, at pix-1, pak-1 og lad-502 mutant embryoner vise unormal antero-posterior morfologi i slutningen af tidlig forlængelse. Yderligere analyse sammenligner hoved bredde og hale bredde between 1,2 gange fase og enden af tidlig forlængelse, ved anvendelse af de samme parametre måling afslørede, at hovedet bredden ikke reduceres i billed 1, pak-1 og lad-502 mutanter mens halen bredde reducerer betydeligt mindre i Let-502 mutanter kun syv. Dette viste, at lade-502 styrer morfogene processer på samme måde langs antero-posterior akse af embryonet, mens pix-1 og pak-1 kontrol morfogene processer især begrænset til den forreste del af embryo 7. Forskel Længden mellem embryoner i slutningen versus begyndelsen af tidlig forlængelse (figur 4D) blev også målt. Vi fandt, at tidlig forlængelse blev reduceret betydeligt i billed 1, pak-1 og lad-502 mutanter i sammenligning med wt antyder, at ændring af den forreste morfogenese i pix-1 og pak-1 mutanter alene er tilstrækkeligt til væsentligt at reducere den elongation af embryo.
Protokol 2 og 3 blev anvendt til at vurdere længden af standset larver i wt og muterede baggrunde. Længden af disse larver blev vurderet ved anvendelse både billedanalyse (protokol 2) 7 og flow-cytometri (protokol 3; upublicerede data). Målinger af larver længde ved hjælp af billedfiler analyseresultater i absolutte målinger af længden dyrenes i mikrometer i en robust og særdeles reproducerbar måde (figur 5A). Denne analyse viste, at synkroniseret mutant larver display signifikant reduceret længde i forhold til vægt (figur 5A) 7. Målingen af disse larver hjælp af flow-cytometri baseret protokol (protokol 3) gav sammenlignelige resultater (figur 5B). Imidlertid bør det bemærkes, at det store antal larver målt ved anvendelse af sidstnævnte fremgangsmåde signifikant øget den statistiske robusthed genotype sammenligning (t - test p -værdier <10 -24). Baseret på disse resultater, kan flowet-cytometri tilgang være et bedre valg over billedanalyse for at karakterisere mutant dyr med meget subtile forlængelse defekter.
Figur 1. Fremstilling af en agarose Pad. A, Mikroskop dias placeret mellem to spacer-slides dækket af to lag afdækningstape. B, er det agarose pad dækket med et andet dias understøttes af de to afstandsstykker-dias. C, Den endelige form og størrelse af agarose pad efter skæring med et barberblad, så det passer dækglasset. klik her for at se en større version af dette tal.
g2.jpg "/>
. Figur 2. Måling af tidlig og sen deformationskriterier Fejl A - B, måling af længden af et embryo på komma trin (A) og ved slutningen af tidlig forlængelse (B). Den røde linje, anvendes til at måle embryonerne blev tegnet under anvendelse af segmenterede linie værktøj af ImageJ. C, hoved og hale bredde måles i embryoner ved 1,2-fold trin (til venstre) og i slutningen af tidlig forlængelse (højre). Pile repræsenterer lokaliseringen af målte områder (modificeret fra Martin et al., 2014). Målestok:. 20 pm D, længde Larverne målt for synkroniseret L1-larver. Højre felt er et forstørret billede af det optagne billede (til venstre). Den røde linje blev trukket ved hjælp af den segmenterede linje værktøj ImageJ. Det bruges til at måle længden af larve. Målestok:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Måling af længde Synkroniseret Larver Brug Flow-cytometri. A, gating og sortering vindue af Copas Biosort viser grøn og rød udledning af kontrol partikler, bobler, døde og levende dyr med hensyn til deres Time-Of-Flight (TOF ). B, TOF af kontrol- partikler på forskellige tidspunkter for en repræsentativt eksperiment. Hældningen af den lineære funktion af TOF versus tid er omkring 10 -5, hvilket indikerer, at TOF kontrol- partikler er konstant over tid under hele forsøget. C, Fordeling af kontrol partikel Tofferne udtrykt som en procentdel af maksimal værdi af distributioner. Ikke-normaliserede og normaliserede kontrol partikel distributioner er repræsenteret for pak-1 (ok448). Andre distributioner er ikke normaliseret. D, distribution af Tofferne til at levedyr udtrykt som en procentdel af den maksimale værdi af fordelingerne. Tofferne er ikke normaliseret på kontrol partikler bortset pak-1 (ok448) som angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Pix-1, Pak-1 og lad-502 Mutants Present Early Forlængelse Mangler. A - B, reproducerbarhed og robusthed vurdering af hoved bredde målinger A, fem uafhængige målinger af hovedet bredde for wt embryoner på 1,2 gange fase (n = 12 embryoner).. Midler og standardafvigelser (fejl barer) er angivet. Ikke signifikante (NS) forskelle mellem målinger blev beregnet ved hjælp af Brown-Forsythe test (osING R statistisk pakke) (F-test p-værdi> 0,5). B, chef bredde måling for wt embryoner på tre forskellige dage (n = 12 embryoner). Midler og standardafvigelser er angivet samt; der var ingen signifikant forskel i varians på tværs af målinger (ns; Brown-Forsythe F-test p-værdi> 0,5) C, Fordelingerne af hoved / hale breddeforhold på 1,2 gange fase (venstre panel), ved slutningen af tidligt. forlængelse (højre panel) i vægt, PIX-1 (gk416), pak-1 (ok448) og lad-502 (sb118ts) mutanter ved 23 - 24 ° C. Bemærk, at mødre til lad-502ts embryoner, som anvendes til denne undersøgelse blev dyrket ved 25,5 ° C. D, Fordeling af forlængelse i vægt, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) og lad-502 (sb118ts) mutanter mellem komma etape og starten af sene forlængelse. Box-plots repræsenterer min, max, 25 th, 50 th (median) og 75percentil af befolkningerne. * T-test p-værdi <0,05, ** t-test p-værdi <0,006 (modificeret fra Martin et al., 2014). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) og L et-502 (sb118ts) larver Present Længde Fejl. En, Længde af larver målt i vægt, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) og lad-502 (sb118ts) dyr målt ved hjælp af billedanalyse (protokol 2). B, Relativ larver længden målt ved hjælp af flow-cytometer ( protokol 3). Tal i parentes svarer til antallet af dyr, der anvendes til the målinger. Midler til længder og standardfejl på middelværdien (SEM; fejlsøjler) er repræsenteret. Students t-test p- værdier er angivet (p). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver nye målinger til at karakterisere tidligt og sene faser af embryonale forlængelse.
I afsnit 1, det kritiske skridt er den potentielle tilstedeværelse af bakterier på puden. Embryonerne hermetisk indesluttet mellem puden og dækglasset under billedoptagelse. Tætning slæden er nødvendig for at undgå udtørring af dyrene under erhvervelse, der varer mere end to timer. Så vidt vi ved, ingen af de sæljægerne bruges til montering af agarose puder mellem objektglas og dækglas er luftgennemtrængeligt. Derfor når en stor mængde af bakterier (eller embryoner) er til stede på puden, kan de blive berøvet oxygen efter et par timer fører til deres tidlig død. Have tre-fold embryoner - svarende til embryoner, der er 3 gange i længden i forhold til ikke-aflange embryoner - indspillet sammen med embryoner af interesse vil være en god indikator for potentielle hypoxiske betingelser, da disse embryoner vil standse i their æggeskaller i fravær af ilt. Ingen morfologiske målinger bør ske på hypoxiske eller om døde fostre.
En anden afgørende skridt, når du bruger time-lapse imaging er temperatur, hvor udviklingen af embryo opstår. Varmefølsom mutanter anvendes for tiden i C. elegans. Den biologiske effekt af temperaturskift kan være umiddelbare eller forsinkede afhængigt af halveringstiden af proteinet og arten af mutationen dens bærer. Derfor bør den temperatur, hvor embryoet udsættes være konstant over tid og bør kontrolleres af passende ventilation af mikroskopi rum eller en opvarmning-kølekammer på objektbordet.
Afsnit 2 er afhængig af larver synkronisering anvendelse af alkalisk hypochlorit behandling. Under visse omstændigheder kan denne behandling føre til embryonale dødelighed (Emb). Emb over 20% i vægt population antyder en forhøjet toksicitet under hypochlorit treatling, der kan have negativ indflydelse morfogenese. Synkroniseret L1 viser høj Emb i wt baggrund bør ikke anvendes til yderligere analyse. Denne begrænsning gælder også for protokol 3.
Vi anbefaler ikke brug af anæstetika til at immobilisere larver. Levamisol navnlig immobiliserer nematoden gennem induktion af muskeltetani der har tendens til at krympe larverne indføre eksperimentelle bias. Hvis eksponeringstiden er ikke hurtig nok som følge af begrænsningerne i mikroskopet, anbefaler vi at reducere motilitet af larver ved at forøge koncentrationen af agarosen i puden og reducere mængden af væske mellem puden og dækglasset. Der bør udvises forsigtighed dog ikke at tørre ud larverne, da udtørring vil reducere deres størrelse.
I afsnit 3, måling af længden af larver brugte sammenligning af strømningshastigheder mellem analyserede prøver. For at gøre dette, fordelingen af kontrol partikler skal være virksomrød. Hvis fordelingerne fuldt overlay kan TOF (time-of-flight) opnået for tilsvarende prøver sammenlignes, hvis ikke, skal normaliseres disse værdier. Normalisering af prøve-TOF forhold til kontrol partikler-TOF (som beskrevet i 3.4.5.1) er blevet anvendt med succes som vist for pak-1 (ok448) (figur 3C og figur 5B). Relative længde af pak-1 (ok448) vs wt fandtes at være ens i mindst 3 uafhængige forsøg med eller uden normalisering (data ikke vist). Men vi anbefaler, hvilket bekræfter de resultater, der er opnået med normalisering med dem, der opnås uden det, især når man sammenligner larver med lille størrelse forskelle. Det skal bemærkes, at måling af larverne længde under anvendelse af flow-cytometri tilvejebringer en længde i forhold til en kontrolprøve, i dette tilfælde, wt larver stedet for en absolut længde i mikrometer som for billedanalyse. Dette indebærer, at målinger fra uafhængige forsøg ikke kankombineres medmindre computing størrelse forhold over wt.
Den bruges til fortynding i prøven cup bufferen vil have en indvirkning på strømningshastigheden. Vi observerede, at hylsteret puffer anbefalet af producenten indeholder detergent, der øger mængden af bobler frembragt under erhvervelse. Brug af M9 buffer, som ikke indeholder detergent, væsentligt reduceret dannelsen af bobler, men var mindre effektiv i at undgå tilstopning af æg i tubuli af sorteringsenheden, som påvirker strømningshastigheden af prøver. Æg tilstopning er let afsløres under erhvervelse af en markant nedgang i den observerbare TOF af kontrol- partikler i et par sekunder efterfulgt af en forhøjet TOF- også i et par sekunder. Egg plukker kan også føre til obstruktion af kanalen og den fuldstændige anholdelse af partiklen flow (mindre end 5 genstande per sekund). Hvis dette skulle ske, skal du klikke på CLEAN-knappen, indtil strømningshastigheden er genoprettet. Eventuelle målinger, der opstår under disse begivenheds bør udelukkes fra dataanalyse. Kappe buffer kan anbefales til forsøg med stammer karakteriseret ved høje døde æg.
Prøven og kappe tryk (indstillet på trin 3.2.3), kan ændres (lidt) over tid og bør justeres manuelt under hele forsøget for at sikre en meget konstant strømningshastighed. Reduktion eller forøgelse af den lave sats vil kunne observeres, når man analyserer resultaterne plotte Tofferne af kontrol partikler over tid (figur 3C). Reduktion af strømningshastigheden vil resultere i en forøgelse af den gennemsnitlige Tofferne af partikler over tid, mens en forøgelse af strømningshastigheden vil resultere i den modsatte. Ændring af strømningshastigheden vil have negativ indflydelse på følsomheden af fremgangsmåden detektere små størrelsesforskelle mellem populationer af larver.
Metoder, der sigter på at identificere gener, der kontrollerer forlængelse og kræver tid-lapse mikroskopi optagelse er generelt højely tidskrævende og trættende når fænotypning flere genotyper. Strømmen-cytometer tilgang, og den kræver udstyr ikke er tilgængelige for alle laboratorier, er mindre tidskrævende og derfor mere effektiv, når flere stammer skal karakteriseres. Denne metode er også mere statistisk robust i forhold til målinger ved hjælp af billedanalyse (vurderet af den studerendes t test sammenligner mutant og vægt TOF distributioner, 5A og B). Denne metode kan så være meget velegnet til stammer, der udtrykker forlængelse fejl med lav ekspressivitet / penetrans.
Flere metoder bruger flow-cytometri er udviklet i fortiden for at måle egnethed nematoder 9-12. Disse fremgangsmåder anvender dyr udleveret i en 96-brønds plader og Reflex modulet af ormen sorteringsanlæg '. Reflex modul muliggør direkte analyse af nematode population dispenseres inden plader med 96 brønde. Derfor er disse metoder er i stand til at characteRize hundredvis af betingelserne om dagen og udgør en robust måde, hvorpå at måle egnethed af et ikke-synkroniseret population. De er imidlertid ikke velegnede til at identificere små størrelsesforskelle mellem synkroniseret L1. Måling af små forskelle mellem L1 larver kræver måling på et stort antal dyr, der er inkompatible med anvendelsen af plader med 96 brønde og Reflex modul, der kan effektivt karakterisere 100 objekter på det mest per brønd. Den her beskrevne metode er designet til dette formål på bekostning af gennemløb, hvilket er væsentligt reduceret. Det muliggør karakteriseringen af 3 til 4 betingelser i timen, når instrumentet er kalibreret, hvilket er en markant forbedring i forhold til anvendelse af billedanalyse i protokol 2.
Måling af hoved og hale bredde forholdet er den første metode, som blev udviklet til at karakterisere morfogene processer, der forekommer ujævnt langs antero-posteriore akse af embryonet 7. Hvornårpåføres gener vist at styre tidlig forlængelse, vil disse metoder præcisere den geografiske fordeling af signalveje, der kontrollerer morfogenese på dette stadium. Måling af længden af standset larver anvendelse af enten billedanalyse eller flowcytometri i kombination med måling af længden af embryonerne i slutningen af tidlig forlængelse vil muliggøre identifikation af gener, der kontrollerer enten tidlig eller sen forlængelse eller begge med høj følsomhed og præcision. Disse procedurer kan så bidrage væsentligt til den fremtidige forståelse af den rumlige og tidsmæssige regulering af signalveje, der kontrollerer embryonale forlængelse i C. elegans. Desuden disse tilgange kan også tilpasses, for at studere signalveje, der kontrollerer kroppens længde, såsom insulin og TGF-beta veje 13, 14 og kronisk eksponering for miljøforureninger 15, 16. Disse målinger kan udføres på forskellige larvestadier eller hos voksne using mindre ændringer af protokol 2 og 3. Måle størrelse forskelle i L1 er mere udfordrende med ormen sorteringsanlæg end større genstande som L3, L4 larver eller voksne. Protokol 3 kan så let tilpasses til at gøre disse målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
