כאן אנו מפרטים פרוטוקולים שתוכננו במיוחד לניטור פגמים מורפוגניים המתרחשים בשלבים מוקדמים ומאוחרים של התארכות עוברית של הנמטודה Caenorhabditis elegans. בסופו של דבר, פרוטוקולים אלה נועדו לזהות גנים המווסתים את השלבים הללו ולאפיין את הדרישות הדיפרנציאליות שלהם לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניתוח מסלולי האיתות השולטים בשינוי תהליכים מורפוגניים במהלך ההתפתחות העוברית דורש מדדים חזקים ורגישים. התארכות עוברית של הנמטודה Caenorhabditis elegans היא שלב התפתחותי מאוחר המורכב מהתארכות העובר לאורך ציר האורך שלו. שלב התפתחותי זה נשלט על ידי תקשורת בין-תאית בין תאים תת-עוריים לשרירי דופן הגוף הבסיסיים. מנגנוני איתות אלה שולטים במורפולוגיה של תאים תת-עוריים על ידי עיצוב מחדש של השלד הציטולוגי וצומת התא-תא. מדידת קטלניות עוברית ועצירת התפתחות בשלבי הזחל, כמו גם שינוי של שלד התא ומבני הידבקות תא-תא בתאי היפודרמיס ושריר הם פנוטיפים קלאסיים ששימשו במשך יותר מ-25 שנה לניתוח מסלולי איתות אלה. מחקרים אחרונים דרשו פיתוח מדדים חדשים המכוונים באופן ספציפי להתארכות מוקדמת או מאוחרת ואפיון פגמים מורפוגניים לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים המאפשרים מדידה מדויקת של אורך ורוחב העוברים המתארכים כמו גם אורך הזחלים המסונכרנים. שיטות אלו מהוות כלים שימושיים לזיהוי גנים השולטים בהתארכות, כדי להעריך אם גנים אלה שולטים הן בשלבים המוקדמים והן בשלבים המאוחרים של שלב זה ונדרשים באופן שווה לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר.
מבוא
במשך כמעט 50 שנים elegans Caenorhabditis נמטודות ביססה את עצמה כמודל רב עוצמה כדי לחקור שאלות חשובות בפיתוח, נוירוביולוגיה, אבולוציה, אינטראקציות הפתוגן המארח, וכו '1 עוצמת המודל הזה בחקר התפתחות טמון: מחזור החיים הקצר שלה של 3 ימים; הקלות שבה החיות האלה ניתן לשנות גנטיות; השקיפות שלה המאפשר התצפית של עקירת תא ומורפולוגיה בחיות חיים והתפתחותה כי הוא בעיקר רחמית נוספת. שלבי ההתפתחות של נמטודות לערב עובר וארבעה שלבי זחל (L1 כדי L4), ואחריו לבגרות. במהלך התפתחות עוברית, morphogenesis אפידרמיס משך תשומת לב רבה ביכולתה לאפשר הבנה טובה יותר של איך אפיתל תאי נודדים כקבוצה, איך הוא מחדש צומת שלהם ולשנות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אפיון של פגמי התארכות בתחילת בעלי חי WT ו Mutant
- עובר הרכבת Normarski דסק"ש מיקרוסקופית
- כן התקשורת וחומר התרבות הבאה:
- מאגר M9, לפזר 12.8 גר '/ ל Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 גר' / ל KH 2 PO 4, 5 גר '/ ל NaCl, 0.25 גר' / ל MgSO 4 • 7H 2 O במים מזוקקים....
- כן התקשורת וחומר התרבות הבאה:
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הראש, זנב והראש / יחס רוחב זנב הם מדדים חזקים.
הפרוטוקולים המתואר כאן שימשו בהצלחה כדי לאפיין את הפונקציה של הרגולטורים ומפעילים של.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר מדדי רומן לאפיין מוקדם שלבים מאוחר של התארכות עוברית.
בסעיף 1, השלב הקריטי הוא הימצאות אפשרית של חיידקים על כן השיגור. העוברים מוקפים הרמטית בין המשטח ואת coverslip במהלך רכישת תמונה. איטום המגלשה נדרש להימנע התייבשות של חיות במהלך הרכישה שנמשך יותר משעתיים. למיטב ידיעתנו, אף אחד האיטום לשמש לעלות רפידות agarose בין שקופיות coverslip הם אוויר-חדיר. כתוצאה מכך, כאשר כמות גדולה של חיידקים (או עוברי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה (NSERC) של קנדה וקרן קנדה לחדשנות. תודה לד"ר פול מיינס (אוניברסיטת קלגרי, קלגרי, קנדה) על הזן let-502 (sb118ts). חלק מהזנים סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של ה-NIH (P40 OD010440).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אגר | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (סידן כלוריד) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| כולסטרול | סיגמא-אולדריך | C8667 | |
| תמיסת ניקוי | יוניון ביומטריקה | 300-5072-000 | |
| כיסויי זכוכית | פישרברנד | 12-542B | |
| מגלשות זכוכית | פישרברנד | 12-552-3 | |
| חלקיקי בקרת פלואורסצנט גבוהים | איחוד ביומטריקה | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (אשלגן פוספט, דו-בסיסי) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (אשלגן פוספט, מונובסיסי) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO<תת>4 (מגנזיום גופרתי) | סיגמא-אולדריץ' | 230391 | |
| Na2HPO4 (נתרן פוספט, דו-בסיסי) | Bio Basic Inc. | ||
| NaCl (נתרן כלורי) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| מסטיק ציור Pebeo 45 מ"ל | pé bé o | PDG033000 | כל חנות אמנות/יצירה |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| איחוד חיץ נדן | ביומטריקה | 300-5070-100 | |
| COPAS | Biosort union Biometrica |
מקורות
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elong....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
