Introduction
במשך כמעט 50 שנים elegans Caenorhabditis נמטודות ביססה את עצמה כמודל רב עוצמה כדי לחקור שאלות חשובות בפיתוח, נוירוביולוגיה, אבולוציה, אינטראקציות הפתוגן המארח, וכו '1 עוצמת המודל הזה בחקר התפתחות טמון: מחזור החיים הקצר שלה של 3 ימים; הקלות שבה החיות האלה ניתן לשנות גנטיות; השקיפות שלה המאפשר התצפית של עקירת תא ומורפולוגיה בחיות חיים והתפתחותה כי הוא בעיקר רחמית נוספת. שלבי ההתפתחות של נמטודות לערב עובר וארבעה שלבי זחל (L1 כדי L4), ואחריו לבגרות. במהלך התפתחות עוברית, morphogenesis אפידרמיס משך תשומת לב רבה ביכולתה לאפשר הבנה טובה יותר של איך אפיתל תאי נודדים כקבוצה, איך הוא מחדש צומת שלהם ולשנות המורפולוגיה האישית שלהם, כמו גם המיקום היחסי שלהם בתוך האפיתל פונקציונלי.morphogenesis עוריות מחולק לארבעה שלבים: עיבור הגבה מורכב בארגון מחדש של תאי אפידרמיס הגבה, המכונה hypodermis; מתחם גחון, מורכב נדידת תאי hypodermal גחון כלפי קו אמצע הגחון ובכך עוטף את העובר בתוך monolayer תא אפיתל; מוקדם התארכות מאוחר הפיכה העובר בצורת השעועית לתוך זחלים דמויים תולעת. בעקבות morphogenesis, צוהר עובר וזחלי L1 להתחיל להאכיל באמצעות חיידקים זמינים בסביבה המיידית שלהם.
ההתארכות עוברית היא אפוא שלב מאוחר של ההתפתחות העוברית. הוא מורכב ההארכה העובר לאורך ציריו אורך הפחתה של הקוטר הרוחבי שלה. זה כרוך שינוי דרמטי של צורת התאים hypodermal. ההתארכות מחולקת צעיר ושלב מאוחר. השלב מוקדם מתחיל בשלב פסיק ומסתיים כאשר השרירים-קיר הגוף מתחיל לחלות בשלב 1.75 של פי wהכשרת הישוב מסוג (WT) עוברים - המתאים עוברים כי הם 1.75 פי אורך לעומת עוברים שאינם מוארך. תהליכים המתרחשים morphogenic בשלב זה מונעים בעיקר על ידי התכווצות של חבילות אקטין פילמנטיות (FBS) ממוקם בקוטב הפסגה של תאי hypodermal שמניעים התארכות שלהם לאורך ציר אנטרו-האחורי של העובר 2. התכווצות של FBS היא שליטה על ידי זרחון של שרשרות אור שרירן ידי שלוש קינאזות LET-502 / ROCK, MRCK-1 ו- PAK-1 5. השלב המאוחר של ההתארכות, מתחיל כאשר שרירי גוף לקיר להיות פונקציונליים ולהתחיל קבלנות. היא כרוכה איתות mechanotransduction מהשרירים-קיר הגוף אל hypodermal הגב ועל הגחון תאים ומסתיימת כאשר חיות לבקוע 3.
פגמי התארכות מאופיינים לרוב אחוז בעלי החיים מתים כמו עוברי (הקטלני עוברי; Emb) ואלה התפתחותם מעצר כזחלי L1 (פנוטיפ מעצר זחל; Lvא) ולהיות קצרים משמעותי מאשר WT. זיהוי של השלב של מעצר התפתחותי דורש תצפית מיקרוסקופית של עוברים מתים ועוצר זחלי 3-6.
היא הוצגה לאחרונה כי מספר גנים, כגון רגולטור Cdc42 / Rac ו Pix-1 המפעיל ו פאק-1, לשלוט בתהליכי morphogenic במהלך שני מוקדמת ומאוחר התארכות 3,7. הראנו גם לאחרונה שתהליכים morphogenic שונים לאורך ציר אנטרו-האחורי של העוברים במהלך התארכות מוקדם 3 7. ממצאים אלה הניעו את הפיתוח של מדדי רומן מיקוד בשלבי התארכות מוקדם או מאוחר במיוחד ומדדים אחרים, המאפשרים אפיון של המורפולוגיה של עובר לאורך ציר אנטרו-האחורי שלהם במהלך ההתארכות מוקדם.
שיטות חדשניות אלה מורכבות במדידת האורך של עובר בתחילה ובסוף של התארכות מוקדם וכן את הרוחב שלהם הןמודעות וזנבות. 7 שני פרוטוקולים פותחו גם למדוד את אורך הזחלים שבקעו זה עתה, מסונכרן ב L1 בשלב 7.
קליפות הביצים של עובר להגן עליהם מפני טיפול תת-כלורי אלקליין בעוד זחלים, מבוגרים חיידקים נוכחיים בתקשורת התרבות, נמוגים ידי הטיפול. טיפול זה משמש אז כדי לטהר עובר מתוך אוכלוסייה הלא מסונכרן המכילה מרבית מבוגרים הניזונים גם 8. הגבלת מזון משמשת לסנכרן זחלים שבקעו זה עתה. מדידת אורך הזחלים אלה לאחר מכן נעשה שימוש כדי לזהות פגמי התארכות. מדידה זו עדיפה על פני מדידת זחלים נעצרו על צלחות התרבית כי זחלים בוקעים מן הלא-לגמרי עוברים מוארכים יכולים להתאושש כדי "אורך נורמלי" כאשר האכלה אך ישמרו בגודל המוקטן שלהם כאשר נעצרו בהיעדר מזון.
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים המאפשרים מדידה של length של מתארך עובר כמו גם את רוחב הראש שלהם וזנב באמצעות זמן לשגות דסק"ש מיקרוסקופיה וניתוח תמונה (פרוטוקול 1). כמו כן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי למדוד את אורך זחלים מסונכרנים באמצעות ניתוח תמונה (פרוטוקול 2) ושפל-Cytometry (פרוטוקול 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אפיון של פגמי התארכות בתחילת בעלי חי WT ו Mutant
- עובר הרכבת Normarski דסק"ש מיקרוסקופית
- כן התקשורת וחומר התרבות הבאה:
- מאגר M9, לפזר 12.8 גר '/ ל Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 גר' / ל KH 2 PO 4, 5 גר '/ ל NaCl, 0.25 גר' / ל MgSO 4 • 7H 2 O במים מזוקקים החיטוי לעקר.
- צלחות NGM, לפזר 3 גר '/ ל NaCl, 16 גרם אגר / L, 2.5 גר' / ל bactopeptone DDH 2 O. החיטוי ולהוסיף 1 מ"מ MgSO 4, 1 מ"מ CaCl 2, חיץ פוספט 1 מ"מ וכולסטרול 5 מיקרוגרם / מ"ל. יוצקים 6 מ"ל של NGM לכל 60 מ"מ צלחות. אפשר המדיום כדי לחזק במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. הוסף כמה טיפות של תרבות רוויה של E. OP50 חיידקים coli גדל במרק לוריא (LB). תנו חיידקים לגדול במשך 48 שעות ולאחסן צלחות ב 4 ° C..
- כדי להפיק את pi התולעתck, הר חוט פלטינה 0.01 "קוטר על פיפטה פסטר קצר. הדקו את חוט פלטינה על הגפיים של זכוכית pipet ידי חימום כשכלו כל הקיצין עם מבער בנזן. שטחו את הגפיים של חוט כדי ליצור מעין חפירה.
- לגדל את זן תולעת על 60 מ"מ צלחות NGM עם OP50 ב 20 ° C.
הערה: אללים Thermosensitive עשויים לדרוש גדל החיות בטמפרטורות אוֹסְרָנִי במהירות של עד 25.5 מעלות צלזיוס. צלחות צריכות להכיל צעירים רבים ועדיין שפע של מזון על מנת להמשיך את הפרוטוקולים. - מקום שקופית מיקרוסקופ בין שתי שקופיות spacer מכוסות על ידי שתי שכבות של סרט מיסוך (איור 1 א).
- הכן פתרון agarose 3% (משקל / נפח) במאגר M9 ידי המסת 0.6 גרם של אבקת agarose במאגר 20 מ"ל M9 ידי חימום במיקרוגל במשך 30 שניות. אפשר הפתרון להתקרר במשך 5 דקות.
הערה: פתרון agarose יכול לשמש במשך כמה ימים לאחר נמס במיקרוגל. זהגם יכול להיות aliquoted ומאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבועות. - מניחים ירידה של פתרון agarose חם 3% בשקופית זכוכית הממוקם בין שתי שקופיות spacer. הימנע ויוצרים בועות.
- במהירות לכסות את agarose עם שקופיות אחר כפי שמוצג באיור 1 ב ומהדקים בעדינות. השקופית העליונה תהיה לרדד את ירידת agarose וליצור כרית עם העובי של שתי שכבות של נייר דבק.
- אפשר agarose כדי לחזק לפחות 1 דקות בטמפרטורת החדר או עד העוברים מוכנים יועברו כרית.
- באמצעות איסוף תולעת, להעביר 20 עד 30 צעירים ניזונים היטב מן צלחת NGM לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות המכיל 400 μl של חיץ M9.
- אפשר תולעים משקעים על ידי כוח הכבידה עבור כ 5 דקות ולהסיר את supernatant באמצעות micropipette. צעד זה נועד להסיר את המקסימום של חיידקים הרים עם נמטודות.
- הוסף 200 μl של חיץ M9 על צינור אחד.
- באמצעות פיפס פסטרette, להעביר את התוכן של הצינור (חיץ נמטודות) על זכוכית שעון.
- השתמש באחת או שתיים 25G 5/8 "מחטים לחתוך את החיות בסעיף אמצע הגוף (בין spermatheca ואת הפות).
הערה: להב סכין מנתחים יכול לשמש גם כתחליף מחט (ים). האם זה על נמטודות שחייה עלול לדרוש קצת אימון. הרעיון הוא להשתמש במחטים כמו מספריים או סכין בהתאם כמה מחטים משמשים. לאחר החיות נחתכות פתוחות, הרמפרודיטים לשחרר העוברים שלהם לתוך המאגר. - תתרכז עובר במרכז של הזכוכית השעון דרך דור של מערבולת מעגלית בתוך הנוזל.
- הסר ביותר של M9 מן הזכוכית השעון באמצעות micropipette. השאירו כ 30 μl של M9 עם העוברים.
- להסיר את השקופית כיסוי כרית agarose (איור 1B) על ידי החלקתו ויפן.
- חותך את הכרית עם סכין גילוח כדי להיות מסוגל לכסות אותה לחלוטין עם coverslip (תרשים 1C).
- בעזרת פיפטה פסטר, להעביר את כל העוברים (ופסולת תולעת) על כרית agarose.
- קבוצה העוברים במרכז כרית באמצעות עפעף מודבק בקצה המרוחק של טיפ משמש 200 micropipettes μl.
- לאט במקום coverslip על כרית הימנעות היווצרות בועה ולאטום אותו.
הערה: חומרי איטום ניתן להשתמש במספר. אנו משתמשים ציור מסטיק למצוא בחנויות אמנות ואומנות (בדרך כלל משמש מסווה מסטיק לציור אקוורל). מסטיק זה משמש כי זה הידרופילי מבצר סביר מהיר אינו רעיל עבור התולעים. שקופיות יכולות להיות אטומות גם עם לק או VALAP (תערובת עשויה וזלין, לנולין ושעוות parafin). - אפשר יבש מסטיק הציור למשך כ 15 דקות.
- כן התקשורת וחומר התרבות הבאה:
- הקלטת התארכות מוקדם באמצעות מיקרוסקופי Normarski דסק"ש ארבעה-ממדית
הערה: המטרה של שלב זה היא להקליט התארכות מוקדם מן הפסיק לתחילת התארכות מאוחר- מוגדר רגע שבו קבלנות להפעיל את השרירים-קיר גוף. כמו כן, אנו שואפים להקליט יותר מ עוברים אחד בזמנו. שמונה שעות של הקלטה בדרך כלל נדרשים לרשום התארכות מוקדם עבור קבוצה של עוברים שאינם מסונכרנים.- מניחים את השקף רכוב על הבמה של מיקרוסקופ. ודא כי המיקרוסקופ מצויד מטרות 10X ו 60X וכן עדשות דסק"ש, פריזמה, מצלמת תוכנה ללכידה המאפשרות מיקרוסקופיה זמן לשגות ויצירת הערימות-Z (פלטפורמה-Z אוטומטי).
הערה: ודא שהטמפרטורה היא קבועה בין 20 ל 23 מעלות צלזיוס בחדר מיקרוסקופ. תא קירור-חימום עשוי להידרש על הבמה מיקרוסקופ, במיוחד כאשר באמצעות מוטציות thermosensitive. - לזהות קבוצה של עוברים בשלבים טרום morphogenesis באמצעות המטרה 10X.
- לאחר ממוקם, להחליק את מטרת 10X ולהוסיף טיפה של טבילת שמן בשקופית.
- שימוש מטרת 60x, לזהות את החלק העליון לחלק התחתון של דוארmbryos להגדיר את הפרמטרים הדמיה מחסנית Z.
הערה: אל תהסס לקבוע את מחסנית Z הגדולה מעובי של העוברים. קבע את המרחק בין שני מטוסים סמוכים כמו 0.8 מיקרומטר. זה יאפשר לכסות את העומק הכולל של העוברים ב -35 עד 50 תוכניות Z.
הערה: אם המיקרוסקופ מכיל פלטפורמת XY אוטומטית, עובר הממוקמים במיקומים שונים של הכרית יכולה להיות מוקלט בו זמנית. לשם כך, שיא קואורדינטות XY של כל מיקום על הכרית ברצונך לנתח במהלך הניסוי. הקפד לבחור את xy כאשר הגדרת פרמטר ההקלטה ובצע את שאר הפרוטוקול כמצוין. חתך-Z הדק של העובר במהלך ההקלטה אינו נדרש בהכרח את המידות מפורטות בפרוטוקול זה. הקלטת התפתחות עוברית של חיות WT ו מוטנטים עם הרזולוציה המקסימלית היא זאת תרגול טוב כדי לבנות ספרייה של הקלטות מסוגלות לתמוך ניתוחים נוספים. - מַעֲרֶכֶתאת זמן לשגות עם 2 מרווחי דקות בין שתי רכישות שנמשך 8 שעות.
הערה: זמן החשיפה יהיה תלוי בעוצמת האור להגדיר עבור מיקרוסקופ. תנועת התא במהלך התארכות מוקדם מאוד איטי; חשיפה בזמן יכול להיות כ מסגרת אחת לשנייה או פחות. אם הם עובר בשלבי morphogenesis מוקדם (עיבור הגבה, מארז גחון), התארכות מוקדם תירשם בתוך השעה 1. הפוך תריס אור בטוח סגור בין כל רכישה. - הפעל את הרכישה ולשמור אותו.
- מניחים את השקף רכוב על הבמה של מיקרוסקופ. ודא כי המיקרוסקופ מצויד מטרות 10X ו 60X וכן עדשות דסק"ש, פריזמה, מצלמת תוכנה ללכידה המאפשרות מיקרוסקופיה זמן לשגות ויצירת הערימות-Z (פלטפורמה-Z אוטומטי).
- מדידת פגמי התארכות מוקדם באמצעות ניתוח תמונה
- תוכנת פיג'י-ImageJ פתוח ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- בתפריט לבחור לנתח / מדידות גדר, בחר היקפי. עבור כל עובר, להתאים את סרגל מידת Z להתמקד הלוע של העובר כפי שמוצג איור 2 א. פעולה זו תבטיח כי אתם מתמקדים במרכז העובר. כדי למדוד את האורך של העובר, להתאים את סרגל ציר הזמן לקיים את העובר של ריבית תחילת ההתארכות מוקדם (שלב פסיק; איור 2 א). הערת הזמן ( "זמן-התחלה").
- בחר את כלי השורה המפולח. צייר קו מפולח מהקצה של הפה של העובר עד קצה זנבו בעקבות קו האמצע של (איור 2 א) העובר. בעזרת לשונית תפריט לנתח / מדוד, להשיג את אורך הקו נמשך ( "תחילת אורך").
- חזור על המדידה הזו מאותן העובר בסוף התארכות מוקדם (הרגע שבו השרירים מתחילים קבלנות). הערה הזמן ( "זמן-סוף") ולמדוד את אורכו של העובר ( "אורך-סוף") כמפורט לעיל (איור 2 ב).
- חשבתי את המשך (D) של התארכות מוקדם והגידול האורך (L) בשלב זה כדלקמן:
D = "זמן-end" - "זמן-התחלה"
& #160; L = "אורך-end" - "אורך-התחלה" - כדי למדוד את רוחב הראש, להתאים את סרגל קנה מידה שהגיע הזמן העובר בשלב של עניין (שלב 1.2 פי או סוף ההתארכות מוקדם). בחר בכלי הקו הישר. צייר את קו האמצע משוכל (dorso- גחון ציר) של הראש. סעיף זה הוא החלק העבה ביותר של העובר (איור 2 ג). שימוש בתפריט לנתח / מדוד, להשיג את אורך הקו המקביל לרוחב הראש.
- באותו נקודת הזמן, לחזור על פעולה זו על ידי ציור קו האמצע מהשוכל של הזנב (אמצע הקו בין שסתום מעי קצה הזנב; איור 2 ג) ומודד אותו כדי להשיג את רוחב הזנב.
הערה: השתמש מדידה זו כדי להשוות עוברים באותו שלב מעבר פנוטיפים שונים. כדי להבטיח שחזור של מדידה זו, הקפד למצוא מקום הממוקמים ברחבי אונליין באמצע הזנב של חיה שיכולה בקלות להיות מוכר מן החי אחד עלnother. - כדי לחשב את ראש יחס רוחב זנב, לחלק את רוחב הראש ידי רוחב הזנב.
.2 אפיון פגמי התארכות המאוחרת באמצעות ניתוח תמונה
- סנכרון של הזחלים L1 באמצעות אלקליין תת-כלורי טיפול
- מתוך צלחת 60 שאינם מורעבים מ"מ המכיל מבוגרים הרה להולדת רבים, לאסוף את כל התולעים בתוך שפופרת מיקרו צנטריפוגות ידי שטיפת נמטודות מצלחת עם 1 מ"ל של חיץ M9 בעזרת פיפטה פסטר.
- משקעים נמטודות ב 3500 XG 3 דקות ב בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant באמצעות micropipette מבלי להפריע גלולה תולעת.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת חומצת על צינור אחד (0.4 M תת-כלורי, 0.5 M NaOH) ולנער במשך 3 דקות.
הערה: פתרון hypochlorite אלקליין צריך להיות מוכן טרי ועובר בפתרון זה צריך להיות נסער בעדינות אך ללא הרף כדי לייעל פירוקה של מבוגרי חמצון של embryos. לאחר 3 תסיסה דקה, רוב המבוגרים צריכים לשחרר את ביציהם לתוך התמיסה. - ספין ב 3500 XG במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר במהירות להסיר את supernatant באמצעות micropipette מבלי להפריע גלולה.
- לשטוף ארבע פעמים עם 1 מ"ל של חיץ M9 ואחריו צנטריפוגה ב 3500 XG במשך 3 דקות.
- לאחר לשטוף הרביעי, להסיר את הביצים supernatant ו resuspend ב 700 μl של חיץ M9 ללא pipetting מעלה את הביצים (כמו ביצים תדבק הפלסטיק של קצה).
- קלט את הצינור על שייקר 3 מ"מ מסלולית להציב באינקובטור בטמפרטורת הצמיחה המתאימה ולנער בסל"ד 600 לילה.
- מדידת אורך של מסונכרן זחלים
- צנטריפוגה נעצר הזחלים L1 ב 3500 XG במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant. Resuspend את הזחלים 100 μl של חיץ M9 ולהעבירם על כרית agarose בעזרת פיפטה פסטר (רפידות agarose צריך להיות להכיןד כמתואר ב סעיף 1.1.2 ל 1.1.8). מניחים coverslip על כן השיגור.
הערה: המשטח לא צריך להיות אטום עם מסטיק לצורך הניסוי הזה כרוך ברכישה קצרה. - השתמש תאורה בניגוד אובייקטיבית שלב 10X כדי למדוד את אורך הזחלים אם מצלמה בעלת רזולוציה גבוהה משמשת. הגבר את העוצמה של האור כדי להיות מסוגל ללכוד תמונות בתוך כמה אלפיות וכתוצאה מכך לקבל תמונה ברורה של הזחלים (איור 2 ד).
הערה: בעוד trashes השחייה של הזחלים מופחתים על ידי כרית agarose, הם עדיין נעים. לכן, הקלטה מהירה היא חיונית כדי לקבל תמונה ברורה. - פתח פיג'י-ImageJ וחזור על שלב 1.3.1. כדי למדוד את אורך זחלים, לבחור את כלי הקו המפולח. צייר קו מפולח מהקצה של הראש ועד קצה הזנב בעקבות קו האמצע של הזחלים (2D איור, פאנל מימין).
- שימוש בתפריט לנתח / מדוד, להשיג את האורךלמתוח קו מתאים אורך הזחלים מיקרומטר.
- צנטריפוגה נעצר הזחלים L1 ב 3500 XG במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant. Resuspend את הזחלים 100 μl של חיץ M9 ולהעבירם על כרית agarose בעזרת פיפטה פסטר (רפידות agarose צריך להיות להכיןד כמתואר ב סעיף 1.1.2 ל 1.1.8). מניחים coverslip על כן השיגור.
3. אפיון של פגמים מאוחרת התארכות שימוש cytometry זרימה
- סנכרון זחלים
- לטהר עוברים באמצעות טיפול תת-כלורי אלקליין כמפורט בסעיף 2.1 מ מלא 100 צלחות מ"מ של צעירים שניזון היטב ולתת את הצוהר העובר לבין מעצר L1 במאגר M9 עבור 16 עד 24 שעות ב 20 או 25.5 מעלות צלזיוס בהתאם לזן מְנוּתָח.
הערה: צלחת מלאה אחת של מבוגרים דשנים לכל זן מספיקה לניתוח כמתואר להלן.
- לטהר עוברים באמצעות טיפול תת-כלורי אלקליין כמפורט בסעיף 2.1 מ מלא 100 צלחות מ"מ של צעירים שניזון היטב ולתת את הצוהר העובר לבין מעצר L1 במאגר M9 עבור 16 עד 24 שעות ב 20 או 25.5 מעלות צלזיוס בהתאם לזן מְנוּתָח.
- כיול של סדרן התולעת
הערה: זרימת cytometer משמש כאן היא זרימת חלקיקים גדולה cytometer (להלן המכונית סדרן התולעת). סדרן תולעת כולל דיודת לייזר אדום 670 ננומטר, אשר ממוקם מול גלאי הכחדה. סדרן תולעת מכיל גם לייזר ארגון רב-קו עבור עירור פלורסנט. ה- sיש מכשירי tandard שלושה צינורות מכפיל גלאי קרינה (PMT) המשמשים לאיתור פליטות קרינה באזורים הירוקים, צהובים, אדום של הספקטרום. בפרוטוקול המתואר כאן, TOF ישמש כדי למדוד את הגודל של הזחלים, במסלול האדום ישמש לזהות תולעים מתים כי יהיה מוכתם יודיד Propidium (PI). GP (שימוש כללי) קרינה הגבוהה בקרת חלקיקים להשתמש כדי לכייל את המכשיר בקרה פנימי בניסוי שלנו להציג קרינה גבוהה בירוק, צהוב ואדום. הם יהיו אלה החפצים רק במדגם נתח עם פליטה גבוהה זוהתה במסלול הירוק ולאחר מכן יזוהו מבוסס על מאפיין זה.
הערה: לחיות חיים מזוהים מבוסס על עדר הקרינה בערוץ הירוק ואדום, כמו גם על TOF. פליטת autofluorescent מהבטן של הזחלים היא לא ניתן לגילוי בשלב L1.- הפעילו את בלוק לייזר, המחשב, מדחסד המכשיר סדרן תולעת. לחץ על כפתור ההפעלה על תוכנת סדרן תולעת נפתחה כמצוין במדריך ההוראות של המכשיר.
- שים את החלון הקופץ מלא ליזר ארגון. בחר במצב RUN ולחכות כעל הכוחות לייזר להגיע 10 ± 1 מילי-ואט. בחר DONE על חלון שליטה לייזר.
- הגדר את הנדן ולחצים המדגמים 5.10 ± 0.02 ו 5.51 ± 0.01 בהתאמה. אפשר הלחץ לאזן במשך לפחות 15 דקות ולחץ על התיבה לבדוק את לחץ על אישור.
הערה: קצב הזרימה תלוי הנדן והלחצים המדגמים. - ודא לחסל את כל הבועות הנוכחות tubules ערוץ זרימה בין כוס המדגם ובית נבחרי הניתוח. לשם כך, לחץ על לרכוש קפיצי אבובית בעדינות עד לא בועה נרכשת (כפי שניתן לראות בחלון הרכישה).
- ההתקנה של כל הפרמטרים למדידת פלורסנט TOF וזיהוי כדלקמן:
- הגדר את הכף עבור TOF, שלוחה, ירוק, צהוב ואדום כדי256. גדר רווח כמתואר בטבלה 1. שליטת סט PMT ב 700 עבור ירוק וצהוב וכדי 900 עבור האדום.
הערה: שני מסנני עירור זמינים (488 ננומטר 514 ננומטר) וניתן להשתמש בו כדי להלהיב או ירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP) או חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) או כל fluorochromes נרגש באורכי גל אלה עם לייזר ארגון מרובה. מסננים מתאימים צריכים להיות מוכנסים לתא המסנן של הציוד. השתמשנו מסנן 488 ננומטר לצורך הניסוי הבא.
- הגדר את הכף עבור TOF, שלוחה, ירוק, צהוב ואדום כדי256. גדר רווח כמתואר בטבלה 1. שליטת סט PMT ב 700 עבור ירוק וצהוב וכדי 900 עבור האדום.
- כדי לכייל את סדרן התולעת, בחר "חלקיקים שליטים לרוץ" בתפריט כלי. שים 20 מיליליטר של GP 1x (שימוש כללי) חלקיקי בקרת קרינה גבוהה בגביע (חלקיקים אלה הם חלקיקי ניאון של גודל מדויק, נמכרים על ידי יצרן cytometry לכייל המכשיר שלהם).
- לחץ על לחצן לרכוש להתחיל נדן ותזרים מדגם.
הערה: צפה בממוצע קשור להפצת חלקיקי שליטת 21 ± 6 ומצoefficient שונה סביב אומר כי (CV) ≤11. אם CV הוא> 11 והממוצע הוא> 27 לנסות לנקות את tubules ידי לחיצה מספר פעמים על הכפתור הנקי או על ידי מצליף ערוץ הזרימה.
- רכישת בעלי החיים TOF
הערה: אור מפזר כאשר אובייקט עובר תא הזרימה בין מקור ליזר גלאי ההכחדה. הזמן שלוקח עבור האור להיות מפוזר על ידי העצם המעופף (זמן הטיסה, TOF) משמש כדי למדוד את האורך הצירי של האובייקט. מידת האור רעולי פנים על ידי האובייקט (הכחדה, EXT) משמש כמדד צפיפות אופטית אטימות / שלה.- מקום 10 μl של wild-type המסונכרן (WT) L1 בכוס שעון להעריך את האחוז המת-ביצים באמצעות מיקרוסקופ לנתח.
הערה: מסונכרן L1 מוצג Emb גבוהה מדי (למעלה מ -20%) ב WT לא אמור לשמש לניתוח נוסף. - העברת מסונכרן L1 מן microcentrifuge (אpproximately 700 μl של M9 המכילים L1) כדי צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף יודיד propidium (PI) בריכוז סופי של 10 מ"ל / מיקרוגרם (דילול 1/100 ה מפתרון מניות 1 מ"ג / מ"ל) ו דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: ביצי מלח וזחלים תהיינה מוכתמים באמצעות PI ואובחנו כאובייקטים פלורסנט במידה רבה תוך שימוש במסלול האדום. - הוסף 10 מיליליטר של חיץ M9 לדלל אוכלוסיות מוכתמות. קחו 5 מ"ל של אוכלוסיות בדילול לדלל אותם ארבע פעמים על ידי הוספת 15 מ"ל של M9. מניחים דילול זו בגביע המדגם.
- הפעל את זרימת מדגם ידי לרכוש לחיצה ולבחון את קצב הזרימה.
הערה: על מנת לקבל מדידה מדויקת, את קצב הזרימה צריכה להישאר בין 15 ל 25 חפצים / sec. - במידת הצורך, להתאים את כמות החיות כוס להגיע קצב הזרימה הרצויה.
הערה: יזרום שיעור תלוי לחצים (נדן מדגם) שנשארים באותה רמה כפי שמצוין 3.2.3 ועל ריכוז של i הזחליםn הגביע. אם קצב הזרימה הוא גבוה מ -25 אובייקטים / sec להוסיף קצת חיץ בתוך הכוס. אם הוא נמוך מ -15 אובייקטים / sec להוסיף L1 מרוכז (משלב 3.3.3) בגביע. - לאחר ריכוז של האובייקט המתאים הוא הגיע, להעריך את עוצמת הקול בתוך הכוס ולהוסיף 1/4 ה הכרך הזה ב- High פלורסנט GP בקרת חלקיקים 4x פתרון.
- התאם את פרמטר gating ומיון. לשם כך, לחץ gating 'בתפריט ובחר' TOF לעומת ' ו 'גרין'. הקישו על 'מיון' בתפריט ובחר 'TOF לעומת' ו 'אדום'. Gating וגרפיקה מיון מכן יופיע כמוצג באיור 3 א.
הערה: זה יאפשר להדמיה של החלקיקים השליטים (פליטה ירוקה ואדום), חיות מתות תוכתמנה PI ובועות (פליטה אדומה ולא ירוק) ובעלי חי חיים (לא פליטה לא ערוצים ירוקים ולא אדומים) (איור 3 א ). - הפעל את הניסוי על ידי לחיצת ACQUire.
הערה: כדי לזהות הבדלים קטנים בין זחלים, לנתח כ -10,000 חפצים, כך כ -8,000 בעלי חיים. הפסק את הניסוי ולייצא את הנתונים כפי .txt תבנית בלחיצה על STORE.
- מקום 10 μl של wild-type המסונכרן (WT) L1 בכוס שעון להעריך את האחוז המת-ביצים באמצעות מיקרוסקופ לנתח.
- מדידה של הגודל היחסי של חיות בעלות באוכלוסיות מסונכרנות
- פתח את קובץ .txt באמצעות תוכנה מסוגלת לנהל טבלאות נתונים גדולים.
- מהאובייקטים נתחו לחלץ את ערכי TOF הקשורים חלקיקים מלאים מאופיינים פליטה בערוץ הירוק גבוהה מ -100 יחידות שרירותיות (ערך זה תלוי בפרמטרים הקבועים בסעיף 3.2.5). צור עמודה חדשה וקורא לזה 'חלקיקים שליטים ". צור עמודה המכילה את כל האובייקטים האחרים למעט חלקיקי השליטה שנקראו 'מדגם'. הערה: פליטת הקרינה של צרכימים יצוו חלקיקים חדשים להיות מאומתת לפני תחילת הרכישות. זה יהיה לקבוע את סף הניאון המאפשר זיהוי שלחלקיקי שליטת L1s.
- עבור כל זן נתח לזהות את החלק של הניסוי שבי את קצב הזרימה השתנה (בשל נוכחותם של תקע של ביצים למשל). לשם כך:
- מגרש את TOF של 'חלקיקים שליטים "עבור כל דגימה כגורם זמן (איור 3).
- צייר את קו המגמה ליניארי שימוש באפשרות קו המגמה ולהציג את המשוואה על התרשים.
הערה: TOF של חלקיקי שליטה צריך להיות קבוע לאורך זמן (קו אופקי, איור 3 ב). בהתחשב המשוואה של קו המגמה ליניארי נמשך על נתונים y = ax + b, להבטיח כי '' ערך נמוך כי 10 -4. כל המדידות שנעשו בתוך מדורי זמן מוצגים קרע היישור של חלקיקי בקרה צריכות להסירו בניתוח.
- הסר את העוברים ובועות מתים (פליטה גבוהה מ -15 באדום) וכן פסולת קטנה אטם ביצה גדולה (TOF נמוך מ -10 וגבוהאה מ -70 בהתאמה) ממדידת 'מדגם'.
- מגרש את ההפצה של החלקיקים שליטים "עבור כל זן המנותח. כפי שניתן לראות באיור 3C הפצות אלה צריכות כיסוי כמעט מושלמת. הדבר מבטיח כי מדידות TOF המתקבלות עבור זנים שונים ניתן להשוות. הערה: נורמליזציה של אלמנטי מדגם TOF על חלקיקי שליטה יכולים לשמש אם ההפצות של חלקיקי שליטת מדגם שאינה מסתירים עם זה של דגימות בקרה. TOF המנורמל מחושב כדלהלן:
- לנרמל TOF עבור גנוטיפ G = (מדגם TOF עבור G) / ( 'החלקיקים המלאים' ממוצע TOF עבור G) x ( 'החלקיקים מלאים' ממוצע TOF עבור WT) שבו WT הוא מדגם השליטה.
- מגרש הפצה הזחלים TOF עבור כל זן כולל מדגם שליטה, במקרה שלנו WT חיות (איור 3D). מדוד את הממוצע ואת סטיית התקן של הממוצע (SEM) לכל אוכלוסיית (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הראש, זנב והראש / יחס רוחב זנב הם מדדים חזקים.
הפרוטוקולים המתואר כאן שימשו בהצלחה כדי לאפיין את הפונקציה של הרגולטורים ומפעילים של Pix-1 GTPases Rho, פאק-1 ולתת-502 במהלך התארכות מוקדם 7. Pix-1 וקוד פאק-1 בהתאמה עבור גורם גואנין-החליפין (GEF) וכן מפעיל ספציפי עבור Rac / Cdc42 GTPases ולתת-502 קודים עבור מפעיל עבור RHO-1 7. במחקר זה, Pix-1 ו פאק-1 הוצגו לשלוט morphogenesis אפידרמיס במהלך התארכות מוקדם 7. במחקר זה נעשה שימוש למדידת ראש וזנב רוחב בתור מדדים להפגין בפעם הראשונה, כי תאי hypodermal ממוקמים EMB הקדמיryo אחרי תוכניות morphogenic שונות מאלו ממוקמים האחוריים שלה 7. כדי להקים את השחזור וחוסנם של מדדים אלה, רוחב הראש נמדד באופן עצמאי חמש פעמים ב -12 wild-type (WT) עובר בשלב 1.2 פי. שונויות בין חמש הקבוצות השונות של מדידה הושוו העריך אז באמצעות מבחן בראון-פורסייט (באמצעות חבילת סטטיסטי R) חושף כי אין הבדלים משמעותיים בין המדידות (F- מבחן ערכי p-> 0.5; איור 4 א) טוען כי מדידות עבור קבוצה עוברים הם לשחזור. הערכת ההשפעות שחזור יצוו קשורות למדידות אלה נעשתה באמצעות מדידה של רוחב הראש עובר WT בשלב 1.2 פי מהדמית 4D-DIC נעשתה בשלושה ימים שונים (n = 12 עובר). מעבר לשלוש קבוצות מדידה אלה, השונים לא היה שונה משמעותיים ללא תופעות יצוו משמעותיות נמצאו להשפיע על ראש-wתוצאות המדידה idth (F-מבחן p -Value> 0.5; איור 4).
תוצאות דומות התקבלו למדידות רוחב זנב למדידות נעשו בשלבים שונים של התארכות מוקדם (מידע לא מוצג). נתונים אלה מבוססים רוחב ראש, זנב-רוחב וראש / יחס רוחב זנב כמו מדדים חזקים לאפיין פגמי התארכות מוקדם.
מדידת ראש ורוחב זנב כמו גם אורך של העוברים מאפשר אפיון הגנים המעורבים בבקרת התארכות מוקדם לאורך ציר אנטרו-האחורי של העובר.
מדידת אורך של העוברים, כמו גם את רוחב הראש והזנב שלהם נעשה על עוברי WT ו מוטנטים נושאת null או חזק thermosensitive הפסד של אללים פונקציה בגנים השולטים התארכות מוקדם: PIX-1 (gk416);פאק-1 (ok448) ולתת-502 (sb118ts) 7. מדדנו את הראש / זנב (H / T) יחס רוחב של עוברים WT ו מוטציה בהתחלה (1.2 פי הבמה) ובסוף של התארכות מוקדם בטמפרטורות אוֹסְרָנִי (איור 4C שמאלה הפאנל הימני בהתאמה). בעוד בתחילת ההתארכות הראשונה לא היה כל שינויים ארגוניים או H מופחת / יחס T נצפה Pix-1, פאק-1 ולתת-502 מוטציות בהשוואת חיות WT (שלב 1.2 פי, איור 2C, פנל משמאל ,) בסוף התארכות מוקדם שלושה כל מוטנטים הראו יחס H / T גבוה באופן משמעותי מאשר עוברים WT (t -test p -values <0.006; 4C איור; פאנל מימין). זה הוכיח כי Pix-1, פאק-1 ולתת-502 עובר מוטציה להציג מורפולוגיה אנטרו-אחורי נורמלית בסוף ההתארכות מוקדם. ניתוח נוסף השוואת ראש רוחב זנב רוחב between בשלב 1.2 פי וסוף התארכות מוקדם, תוך שימוש באותה פרמטרי מידות חשף כי רוחב הראש פחות מצטמצם ב Pix-1, פאק-1 ולתת-502 מוטציות בעוד רוחב הזנב מפחית באופן משמעותי פחות מוטנטים let-502 רק 7. זה גילה שמאפשר-502 בקרות תהליכי morphogenic דומה לאורך ציר אנטרו-האחורי של העובר, ואילו Pix-1 ו פאק-1 תהליכי morphogenic מלאים המתרחשים בעיקר בחלק הקדמי של העובר 7. ההבדל אורך בין עוברים בסוף לעומת תחילת התארכות מוקדם (איור 4D) נמדדה גם. מצאנו התארכות מוקדם כי צומצם משמעותית ב Pix-1, פאק-1 ולתת-502 מוטציות בהשוואה WT מציע שינוי של המורפוגנזה הקדמי Pix-1 ו פאק-1 מוטנטים בלבד מספיקה כדי לצמצם את elongatio משמעותיתn של העובר.
פרוטוקול 2 ו -3 שימשו להעריך את אורך הזחלים נעצר רקע WT ו מוטציה. אורכו של הזחלים הללו הוערך באמצעות שני ניתוח התמונה (פרוטוקול 2) 7 ו זרימת cytometry (פרוטוקול 3; נתונים שלא פורסמו). מדידות של אורך זחלים באמצעות תוצאות ניתוח תמונה במדידות מוחלטות של האורך 'החיות מיקרומטרים בתוך (איור 5 א) באופן חזק מאוד לשחזור. ניתוח זה חשף כי תצוגת זחלי מוטציה מסונכרנת מופחת אורך באופן משמעותי בהשוואת WT (איור 5 א) 7. מדידה של הזחלים הללו באמצעות פרוטוקול מבוסס-cytometry זרימה (פרוטוקול 3) נתן תוצאות דומות (איור 5). עם זאת, יש לציין כי מספר הרב של זחלים, הנמדד על פי הגישה השנייה גדילה משמעותית את החוסן הסטטיסטי של השוואת גנוטיפ (t - מבחן p -values <10 -24). בהתבסס על ממצאים אלה, גישת הזרימה cytometry עשויה להיות בחירה טובה יותר על ניתוח תמונה כדי לאפיין חיות מוטנטים מוצגות פגמי התארכות עדינים מאוד.
איור 1. הכנת כרית agarose. A, שקופיות מיקרוסקופ ממוקם בין שני מכוסה spacer-שקופיות על ידי שתי שכבות של נייר דבק. B, משטח agarose מכוסה מפולת בוץ נוספת בתמיכת שתי מגלשות spacer. C, צורה וגודל הסופי של כרית agarose לאחר חיתוך עם סכין גילוח כדי להתאים coverslip. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
g2.jpg "/>
. איור 2. מדידה מוקדם ופגמי התארכות מאוחרים A - B, מדידת האורך של עובר פסיק במה (א) ו בסוף ההתארכות מוקדם (B). הקו האדום, המשמש למדידת עבר צויר באמצעות כלי השורה המפולח של ImageJ. C, ראש ורוחב זנב נמדד עובר בשלב 1.2 פי (משמאל) בסוף ההתארכות מוקדם (מימין). חצים מייצגים את הלוקליזציה של אזורים הנמדדים (שונים מ- Martin et al., 2014). סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר D, אורך של זחלים נמדד עבור L1-זחלים מסונכרנים. פנל ימני הוא תצוגה מוגדלת של התמונה שצולמה (משמאל). הקו האדום נמשך באמצעות כלי השורה המפולח של ImageJ. הוא משמש כדי למדוד את האורך של הזחל. סרגל קנה מידה:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
s = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> 
מדידת איור 3. של האורך של זחלים מסונכרנים באמצעות זרימת cytometry. A, Gating וחלון מיון של COPAS Biosort מראה ירוק ופליטה אדומה של חלקיקים שליטים, בועות, חי למת חיות ביחס לזמן של הטיסה שלהם (TOF ). ב, TOF של חלקיקים שליטים בנקודות זמן שונות עבור ניסוי נציג. השיפוע של הפונקציה ליניארית של TOF לעומת הזמן הוא סביב 10 -5, המציין כי TOF של חלקיקי שליטה הוא קבוע לאורך זמן לאורך הניסוי. C, חלוקת TOFs חלקיקים המלא המבוטאים באחוזים של ערך המקסימאלי של הפצות. הפצות חלקיקי שליטה הלא מנורמלות המנורמלות מיוצגות עבור פאק-1 (ok448). הפצות אחרות הן לא מנורמלות. D, חלוקת TOFs לחייםחיות מבוטאות באחוזים של הערך המקסימאלי של ההפצות. TOFs אינו מנורמל על חלקיקים מלאים למעט פאק-1 (ok448) כפי שצוין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. Pix-1, פאק-1 and Let-502 מוטאנטים הווה פגמים התארכות הקדומה. A - B, הערכה שחזור וחוסנם של ראש ממידות הרוחב א ', חמש מדידות בלתי תלויות של רוחב הראש מהפריה WT בשלב 1.2 פי (n = 12 עוברים).. ממוצעים וסטיות תקן (ברי שגיאה) מסומנים. הבדלים משמעותיים (NS) ללא בין מדידות חושבו בעזרת מבחן בראון-פורסייט (לנוing R חבילה סטטיסטית) (F-מבחן p-value> 0.5). B, מדידת רוחב ראש מהפרית WT בשלושה בימים שונים (n = 12 עובר). ממוצעים וסטיות תקן מסומנים וכן; לא נמצא הבדל משמעותי השונות ברחבי מדידות (ns; בראון-פורסייט F-מבחן ערכי p-> 0.5) C, הפצות של יחס רוחב ראש / זנב בשלב 1.2 פי (פאנל משמאל), בסוף מוקדם. התארכות (פאנל מימין) ב WT, Pix-1 (gk416), פאק-1 (ok448) ולתת-502 (sb118ts) מוטציות ב 23 - 24 ° C. הערה על כך שאמהות עוברים לתת-502ts נעשה שימוש במחקר זה גדלו ב 25.5 מעלות צלזיוס. D, הפצה של התארכות ב WT, Pix-1 (gk416), פאק-1 (ok448) ולתת-502 (sb118ts) מוטנטים בין בשלב פסיק ואת תחילת התארכות מאוחר. תיבת-חלקות לייצג את דקות, מקסימום, 25 th, 50 ה (חציון) ו -75עשירונים ה של האוכלוסיות. * T -test p -Value <0.05, ** t -test p -Value <0.006 (שונה מ- Martin et al., 2014). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. Pix-1 (gk416), פאק-1 (ok448) ו- L et-502 (sb118ts) פגמים אורך הווה הזחלים. A, אורך של הזחלים נמדד WT, Pix-1 (gk416), פאק-1 (ok448) ולתת-502 (sb118ts) חיות נמדד באמצעות ניתוח תמונה (פרוטוקול 2). B, אורך הזחלים יחסית למדוד באמצעות-cytometer זרימה ( פרוטוקול 3). מספרים בסוגריים מתאימים את מספר בעלי החיים המשמש המדידות דואר. אמצעי אורכים ואת סטיית התקן של הממוצע (SEM; ברי שגיאה) מיוצג. T של סטודנט -test ערכי p- מסומן (p). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר מדדי רומן לאפיין מוקדם שלבים מאוחר של התארכות עוברית.
בסעיף 1, השלב הקריטי הוא הימצאות אפשרית של חיידקים על כן השיגור. העוברים מוקפים הרמטית בין המשטח ואת coverslip במהלך רכישת תמונה. איטום המגלשה נדרש להימנע התייבשות של חיות במהלך הרכישה שנמשך יותר משעתיים. למיטב ידיעתנו, אף אחד האיטום לשמש לעלות רפידות agarose בין שקופיות coverslip הם אוויר-חדיר. כתוצאה מכך, כאשר כמות גדולה של חיידקים (או עוברי) נמצאת על המשטח, הם עשויים להיות משולל חמצן אחרי כמה שעות המובילות למוות בטרם העת. לאחר עובר פי שלושה - מתאים עובר כי הם פי 3 באורך לעומת עוברים שאינם מוארכים - רשם יחד עם עוברי עניין יהיה אינדיקטור טוב של תנאי חוסר חמצן פוטנציאל, שכן עובר אלה יפסיקו לנוע theiקליפות ביצים r בהיעדר חמצן. אין מדידות מורפולוגיים צריכים להיעשות על תנאי חוסר חמצן או על עוברים מתים.
עוד צעד קריטי בעת שימוש זמן לשגות הדמיה היא הטמפרטורה שבה התפתחות העובר מתרחשת. מוטציות Thermosensitive משמשות כיום ב C. elegans. ההשפעה הביולוגית של משמרת הטמפרטורה עשויה להיות מיידית או מושהית תלוי מחצית החיים של החלבון ואת אופי המוטציה שלו נושאת. כתוצאה מכך, הטמפרטורה שבה עובר חשופה צריכה להיות קבועה לאורך זמן וצריכה להיות נשלטה על ידי אוורור הנכון של חדר מיקרוסקופ או תא חימום-קירור על במת מיקרוסקופ.
סעיף 2 תלוי סנכרון זחלים באמצעות טיפול תת-כלורי אלקליין. בנסיבות מסוימות, טיפול זה עלול להוביל הקטלניות עובריות (EMB). Emb מעל 20% באוכלוסייה WT מרמז על רעילות גבוהות במהלך פינוק תת-כלוריment העשויים להשפיע morphogenesis שלילי. L1 מסונכרן מוצגות Emb גבוהה ברקע WT לא אמור לשמש לניתוח נוסף. הגבלה זו חלה גם על פרוטוקול 3.
אנחנו לא ממליצים על השימוש בתרופות הרדמה כדי לשתק זחלים. Levamisol בפרט, שמגביל נמטודות באמצעות אינדוקציה של tetany שריר שנוטה להתכווץ הזחלים המטים ניסיון. אם זמן חשיפה הוא לא מהיר מספיק כתוצאת המגבלות של המיקרוסקופ, אנו ממליצים להקטין את תנועתיות של זחלים על ידי הגדלת הריכוז של agarose בפנקס והפחתת כמות הנוזל בין המשטח ואת coverslip. יש להקפיד עם זאת, לא כדי לייבש את הזחלים, מאז התייבשות תפחית גודלם.
בסעיף 3, מדידת אורך הזחלים בשימוש השוואה של ספיקות בין דגימות נותחו. לשם כך, חלוקת חלקיקי שליטה צריכה להיות compaאָדוֹם. אם הפצות כיסוי במלואה, TOF (זמן של טיסה) ערכים שהתקבלו עבור דגימות מתאימות ניתן להשוות, אם לא, ערכים אלה צריכים להיות מנורמלים. נורמליזציה של המדגם-TOF מעל חלקיקים-TOF מלא (כמפורט 3.4.5.1) שמשה בהצלחה כמוצגת עבור פאק-1 (ok448) (איור 3 ג ו איור 5). אורך יחסית של פאק-1 (ok448) לעומת WT נמצא דומה לפחות 3 ניסויים בלתי תלויים עם או בלי נורמליזציה (מידע לא מוצג). עם זאת, אנו ממליצים, המאשרים את התוצאות שהושגו עם נורמליזציה עם אלו המתקבלות בלעדיו, במיוחד כאשר משווים זחלים עם הבדלים קטנים. יצוין כי מדידת אורך הזחלים באמצעות-cytometry זרימה מספקת ביחס אורך למדגם שליטה, במקרה זה, WT הזחלים ולא אורך מוחלט מיקרומטר כמו לניתוח תמונה. משמעות הדבר הוא כי מדידות מניסויים עצמאיים לא יכולותלהיות משולב אלא חישוב יחס גודל מעל WT.
המאגר המשמש דילול בגביע המדגם יהיה השפעה על קצב הזרימה. הבחנו כי למאגר הנדן בהתאם להמלצת היצרן מכיל דטרגנט כי מגדיל את כמות בועות שנוצרו במהלך רכישה. באמצעות חיץ M9, אשר אינו מכיל חומרי ניקוי, הפחית משמעותית את היווצרות של בועות אבל היה פחות יעיל הימנעות חיבור של הביצים tubules של סדרן, אשר משפיע על קצב הזרימה של דגימות. פקיקת ביצה מזוהית בקלות במהלך הרכישה על ידי ירידה ניכרת של TOF הנצפה של חלקיקים מלאים במשך כמה שניות ואחריו TOF- גבוהה גם במשך כמה שניות. פקיקת ביצה עשויה גם להוביל את החסימה של הערוץ ואת מעצרו המלא של זרימת החלקיקים (פחות מ -5 חפצים לשנייה). אם זה אמור להתרחש, לחץ על כפתור CLEAN עד קצב זרימה משוחזר. כל המדידות המתרחשים במהלך האירוע אלההים יש נכלל בניתוח הנתונים. חיץ נדן עשוי להיות מומלץ עבור ניסויים מעורבי זנים מאופיינים בשיעורים גבוהים של ביצים מתות.
לחץ מדגם הנדן (נקבע על הצעד 3.2.3), עשוי לשנות (מעט) לאורך זמן צריך להיות מותאם באופן ידני לאורך הניסוי כדי להבטיח קצב זרימה מאוד מתמיד. הפחתה או הגדלת השיעור הנמוך תהיה נצפה כאשר מנתחים את התוצאות התוויית TOFs של חלקיקים שליטים על הזמן (איור 3 ג). הפחתת קצב הזרימה תגרום לעלייה של TOFs הממוצע של חלקיקים לאורך זמן, תוך גידול של קצב הזרימה יגרום ההפך. שינוי של קצב הזרימה לא ישפיע באופן שלילי את הרגישות של השיטה באיתור ההבדלים בגודל קטן בין אוכלוסיות של הזחלים.
שיטות במטרה לזהות גני שליטת התארכות מחייב הקלטת מיקרוסקופיה הזמן לשגות הן בדרך כלל גבוהותly זמן רב ומייגע כאשר phenotyping מספר גנוטיפים. גישת הזרימה המבוססת-cytometer, תוך הדורשים ציוד אינו זמין לכל המעבדות, היא פחות זמן רב ועל כן יעיל יותר כאשר מספר זנים צריכים להתאפיין. שיטה זו היא גם יותר סטטיסטי חזקה לעומת מדידות באמצעות ניתוח תמונה (מוערך על ידי מבחן טי של תלמיד השוואה של התפלגויות מוטציה ו WT TOF; איור 5 א 'וב'). שיטה זו עשויה להיות אז מתאימה במיוחד עבור זני המבטאים פגמי התארכות עם האקספרסיביות / חדירות נמוכות.
מספר שיטות באמצעות-cytometry זרימה פותחו בעבר למדידת כושר של נמטודות 9-12. שיטות אלה להשתמש חיות לוותר בתוך 96-גם צלחות ואת מודול רפלקס של סדרן התולעת ". מודול רפלקס מאפשר ניתוח ישיר של האוכלוסייה נמטודות לוותר בתוך 96-גם הצלחות. כתוצאה מכך, שיטות אלה מסוגלים characteRize מאה תנאים ליום ומהווה באופן חזק בם כדי למדוד את הכושר של אוכלוסייה הלא מסונכרן. עם זאת, הן לא מותאמות היטב כדי לזהות הבדלים קטנים בין L1 המסונכרן. מדידת הבדלים קטנים בין הזחלים L1 דורש למדוד על פני מספר רב של בעלי חיים, אשר אינה עולה בקנה אחד עם השימוש צלחות 96-היטב של מודול רפלקס שעשויים לאפיין 100 אובייקטים ביעילות לכל היותר לכל טוב. השיטה המתוארת כאן נועדה למטרה זו על חשבון התפוקה, אשר מצטמצמת משמעותית. היא מאפשרת אפיון של 3 עד 4 תנאים לשעה פעם המכשיר מכויל, וזה שיפור ניכר לעומת באמצעות ניתוח תמונה בפרוטוקול 2.
מדידת יחס רוחב הראש והזנב היא השיטה הראשונה אשר פותחה כדי לאפיין תהליכי morphogenic המתרחשים באופן לא אחיד לאורך ציר אנטרו-האחורי של העובר 7. מתילהחיל גנים הראו לשלוט התארכות מוקדם, שיטות אלה יבהירו את הפריסה המרחבית של מסלולי איתות שליטה morphogenesis בשלב זה. מדידת אורך הזחלים נעצרו או באמצעות ניתוח תמונה או cytometry זרימה בשילוב עם מדידת האורך עובר בסוף ההתארכות מוקדם תאפשר זיהוי של גני השליטה או מוקדם או מאוחר התארכות או שניהם עם רגישות ודיוק גבוהים. הליכים אלה עשויים אז לתרום משמעותיים להבנת עתיד של הרגולציה במרחב ובזמן של מסלולי איתות שליטת התארכות עוברית ב C. elegans. יתר על כן, גישות אלה ניתן להתאים גם ללמוד מסלולי איתות השליטה אורך הגוף כגון אינסולין TGF-beta מסלולים 13, 14 וכרוני חשיפה מזהמים סביבתיים 15, 16. ניתן לעשות מדידות אלה בשלבי זחל שונים או אצל מבוגרים מנצליםg שינויים קלים של פרוטוקולים 2 ו -3 הבדלים בגודל מדידה ב L1 הם יותר מאתגר עם סדרן התולעת מאשר עצמים גדולים כגון L3, זחלים או מבוגרי L4. פרוטוקול 3 אז ניתן להתאים בקלות לעשות מדידות אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
