Introduction
Al bijna 50 jaar gevestigd het aaltje Caenorhabditis elegans zich als een krachtig model op belangrijke vragen in de ontwikkeling, neurobiologie, evolutie, gastheer-pathogeen interacties, enz. Bestuderen 1 De kracht van dit model in de studie van de ontwikkeling ligt in: de korte levenscyclus van 3 dagen; het gemak waarmee deze dieren genetisch kunnen worden gewijzigd; de transparantie dat de waarneming van de cel verplaatsing en morfologie maakt in levende dieren en de ontwikkeling die is meestal extra-uteriene. De ontwikkelingsstadia van de nematode betrekking embryogenese en vier larvale stadia (L1 tot L4), gevolgd door volwassenheid. Tijdens de embryonale ontwikkeling, epidermale morfogenese vestigde aandacht op zijn vermogen om een beter begrip van hoe epitheelcellen migreren als groep, hoe ze reorganiseren hun verbindingen mogelijk te maken en hun individuele morfologie en hun relatieve positie binnen een functioneel epitheel wijzigen.Epidermale morfogenese is verdeeld in vier fasen: dorsale intercalatie bestaande uit de reorganisatie van de dorsale epidermale cellen, als de onderhuid genoemd; ventrale behuizing, die bestaat in de migratie van ventrale onderhuidse cellen in de richting van het ventrale middellijn aldus het embryo in een epitheliale cel monolaag bekisten; vroege en late rek transformeren van de boon-vormige embryo in wormvormig larven. Naar aanleiding van morfogenese, embryo luik en L1 larven beginnen voeden met behulp van beschikbare bacteriën in hun directe omgeving.
Embryonale rek is derhalve een laat stadium van de embryonale ontwikkeling. Het bestaat uit de verlenging van het embryo langs zijn langsas en een vermindering van de transversale diameter. Het gaat om een dramatische verandering van de vorm van hypodermale cellen. De rek wordt verdeeld in een vroege en een late fase. De eerste fase begint bij de komma stadium en eindigt wanneer het lichaam muur spieren beginnen aanbestedende op 1,75 maal het podium in wild-type (wt) embryo - overeenkomt met embryo's die 1,75 maal de lengte in vergelijking met niet-langwerpige embryo. Morfogene processen die zich in die fase worden vooral gedreven door samentrekking van filamenteus actine bundels (FBS) bij het apicale pool van onderhuidse cellen die hun rek rijden langs de antero-posterior as van het embryo 2. Samentrekking van FB is controle door fosforylering van myosine-lichte ketens door drie kinases LAAT-502 / ROCK, MRCK-1 en PAK-1 5. De late fase van het rek, begint wanneer het lichaam muur spieren functioneel geworden en beginnen contracting. Het gaat om mechanotransductie signalering uit het lichaam muur spieren aan de dorsale en ventrale onderhuidse cellen en eindigt wanneer dieren broeden 3.
Rek defecten worden algemeen gekenmerkt door het percentage dieren sterven als embryo (embryonale letaliteit, EMB) en die de ontwikkeling arrestatie L1 larven (larven arrestatie fenotype; Lva) en beduidend korter dan gew. Identificatie van het stadium van ontwikkelings arrestatie vereist microscopische waarneming van dode embryo's en arresteerde Larven 3-6.
Recent werd aangetoond dat meerdere genen, zoals Cdc42 / Rac regulator en effector pix-1 en pak-1, controle morfogene processen tijdens zowel vroege als late rek 3,7. We hebben onlangs aangetoond dat morfogene werkwijzen verschillen langs de antero-posterior as van het embryo tijdens de vroege elongatie 3 7. Deze bevindingen gemotiveerd de ontwikkeling van nieuwe metriek specifiek gericht vroege of late stadia rek en andere statistieken waardoor de karakterisering van de morfologie van embryo's langs de antero-posterieure as tijdens de vroege rek.
Deze nieuwe werkwijzen omvatten het meten van de lengte van embryo aan het begin en aan het einde van vroege rek en de breedte van hun hijadvertenties en staarten. 7 Twee protocollen werden ontwikkeld om de lengte van de pas uitgekomen larven, gesynchroniseerd op L1 fase 7 meten.
De eierschalen van het embryo beschermen deze tegen alkalisch hypochloriet behandeling, terwijl larven, volwassen en bacteriën in de kweekmedia worden opgelost door de behandeling. Deze behandeling wordt vervolgens gebruikt om embryo's te zuiveren van een niet-gesynchroniseerde populatie een meerderheid van goed gevoede 8 volwassenen. Voedselrestrictie wordt gebruikt om pas uitgekomen larven synchroniseren. Lengtemeetapparaten deze larven wordt vervolgens gebruikt om rek defecten te detecteren. Deze meting heeft de voorkeur boven het meten van gearresteerde larven op kweekplaten omdat larven die uitkomen uit niet-volledig verlengde embryo kan herstellen "normale lengte" wanneer het wordt ingevoerd, maar hun geringe grootte handhaven wanneer gearresteerd in afwezigheid van voedsel.
Hier presenteren wij gedetailleerde protocollen waardoor de meting van de length van het verlengen van embryo's, evenals de breedte van de kop en de staart met behulp van time-lapse DIC microscopie en beeldanalyse (Protocol 1). We bieden ook gedetailleerde protocollen om de lengte van gesynchroniseerde larven met behulp van beeldanalyse (Protocol 2) en Flow-Cytometry (Protocol 3) te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Karakterisering van Vroeg Rek Defecten in WT en Mutant Dieren
- Montage van embryo's voor Normarski DIC Microscopy
- Bereid de volgende cultuur media en materialen:
- M9 buffer, los 12,8 g / l Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / l KH 2PO 4, 5 g / l NaCl, 0,25 g / l MgSO4 • 7H 2 O in gedestilleerd water en autoclaaf te steriliseren.
- NGM platen, los 3 g / l NaCl, 16 g / l agar, 2,5 g / l bactopepton in DDH 2 O. Autoclaaf en voeg 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 1 mM fosfaatbuffer en 5 ug / ml cholesterol. Pour 6 ml NGM per 60 mm schalen. Het medium laten stollen gedurende 24 uur bij kamertemperatuur geroerd. Voeg een paar druppels van een verzadigde kweek van E. coli OP50 bacteriën gekweekt in Luria-bouillon (LB). Laat de bacteriën groeien gedurende 48 uur en de platen bewaren bij 4 ° C.
- Om de worm pi genererenck, mount een 0,01 "diameter platina draad op een korte Pasteur pipet. Bevestig de platina-draad aan het uiteinde van de glazen pipet door het verwarmen van dit uiteinde met een benzeen brander. Vlak het uiteinde van de draad aan een soort schop te genereren.
- Groeien de worm spanning op 60 mm NGM platen met OP50 bij 20 ° C.
OPMERKING: temperatuurgevoelige allelen vereisen het kweken van de dieren op niet-permissieve temperaturen tot 25,5 ° C. De platen moeten veel jonge volwassenen en nog genoeg voedsel bevatten om de protocollen te streven. - Plaats een microscoopglaasje tussen twee spacer dia's die vallen onder twee lagen afplakband (Figuur 1A).
- Bereid een 3% agarose-oplossing (w / v) in M9 buffer door oplossen van 0,6 g agarose poeder in 20 ml M9 buffer door verwarmen in de magnetron gedurende 30 sec. Laat de oplossing afkoelen 5 minuten.
OPMERKING: De agarose oplossing kan worden gebruikt voor een paar dagen na smelten in een magnetron. Hetkan ook worden hoeveelheden verdeeld en weken bewaard bij 4 ° C. - Een druppel van 3% agarose hete oplossing op de glasplaatje tussen de twee spacer-dia. Vermijd de vorming van bubbels.
- Snel betrekking hebben op de agarose met een andere dia zoals weergegeven in figuur 1B en druk zachtjes naar beneden. De bovenste schuif zal de agarose druppel plat en het genereren van een pad met de dikte van twee lagen plakband.
- Laat de agarose te stollen gedurende ten minste 1 minuut bij kamertemperatuur of totdat de embryo's direct worden overgedragen aan de pad.
- Met behulp van een worm pick, transfer 20-30 goed gevoed jonge volwassenen uit de NGM-plaat in een micro-centrifuge buis met 400 ul van M9 buffer.
- Laat de wormen om sediment door de zwaartekracht ongeveer 5 minuten en verwijder het supernatant met behulp van een micropipet. Deze stap is bedoeld om het maximum van bacteriën geplukt met de nematoden verwijderen.
- Voeg 200 pl M9 buffer aan elke buis.
- Met behulp van een Pasteur pipette, overdracht van de inhoud van de buis (buffer en nematoden) een horlogeglas.
- Gebruik een of twee 25G 5/8 "naalden om de dieren op het midden van de body sectie (tussen de spermatheca en de vulva) te snijden.
OPMERKING: Een scalpel kan ook worden gebruikt als alternatief voor naald (s). Doe dit op zwemmen nematoden en vergt vaak enige oefening. Het idee is om naalden een schaar of een mes afhankelijk hoeveel naalden worden gebruikt. Zodra de dieren worden opengesneden, hermafrodieten laat de embryo's in de buffer. - Concentreer embryo's in het midden van het horlogeglas met vorming van een cirkelvormige vortex in de vloeistof.
- Verwijder het grootste deel van de M9 van het horlogeglas met behulp van een micropipet. Laat ongeveer 30 ul van M9 met de embryo.
- Verwijder de schuif die de agarose pad (Figuur 1B) door te schuiven van de pad.
- Snijd het pad met een scheermesje om zich volledig bedekken met een dekglaasje (Figuur 1C).
- Met behulp van een Pasteur pipet alle embryo's (en worm puin) op de agarose pad.
- Groep de embryo's in het midden van het kussen met een wimpers gelijmd aan het uiteinde van een tip voor 200 gl micropipetten.
- Plaats langzaam een dekglaasje op het pad te voorkomen bubble vorming en verzegelen.
OPMERKING: Verschillende sealers worden gebruikt. We gebruiken het tekenen gom gevonden in de kunst en ambachtelijke winkels (meestal gebruikt als maskering gom voor aquarel schilderen). Deze gom wordt gebruikt omdat het hydrofiel is en stolt redelijk snel en is niet toxisch voor de wormen. Dia's kunnen ook worden afgedicht met nagellak of valap (mengsel van vaseline, lanoline en Parafin was). - Laat de tekening tandvlees droog gedurende ongeveer 15 min.
- Bereid de volgende cultuur media en materialen:
- Opnemen Vroege Rek met vier-dimensionale Normarski DIC Microscopy
Opmerking: Het doel van deze stap is om vroege verlenging van komma opnemen begin late rek- Gedefinieerd als het moment waarop het lichaam muur spieren starten contracting. We streven ook naar meer dan één embryo in de tijd op te nemen. Acht uur rapporteringsperiode meestal nodig om vroeg rek nemen voor een groep van niet-gesynchroniseerde embryo.- Plaats de gemonteerde-slide op het podium van een microscoop. Zorg ervoor dat de microscoop is uitgerust met een 10x en 60x doelstellingen, alsmede DIC lenzen, prisma, camera en capture software waarmee time-lapse microscopie en het genereren van Z-stacks (geautomatiseerde Z-platform).
LET OP: zorg ervoor dat de temperatuur constant tussen 20 en 23 ° C in de microscopie kamer. Een verwarming koelkamer nodig kan zijn de microscoop podium, vooral bij gebruik van temperatuurgevoelige mutanten. - Identificeer een groep embryo op vooraf morfogenese fasen met de 10X objectief.
- Eenmaal gevestigd, glijden de 10X objectief en voeg een druppel olie immersie op de dia.
- Met de 60X objectief, identificeren de boven- en onderkant van embryos het instellen van de Z-stack imaging parameters.
NB: Aarzel niet om de Z-stack groter is dan de dikte van de embryo's in te stellen. Stel de afstand tussen twee aangrenzende vlakken 0,8 urn. Hierdoor zal de totale diepte van de embryo dekken 35-50 Z-plannen.
LET OP: Als de microscoop bevat een geautomatiseerd xy-platform, kunnen embryo's zich op verschillende locaties van de pad tegelijkertijd worden opgenomen. Om dit te doen, op te nemen xy-coördinaten van elke locatie op het pad dat u wilt analyseren in de loop van het experiment. Zorg ervoor dat de xy bij het instellen van de parameter opname te selecteren en volg de rest van het protocol, zoals aangegeven. Dunne Z-snijden van het embryo tijdens de opname is niet per se nodig is voor de in dit protocol metingen. Opname embryonale ontwikkeling van wt en mutante dieren met de maximale resolutie is echter een goede gewoonte om een bibliotheek van opnames in staat om aanvullende analyses ondersteunen bouwen. - setde time-lapse met 2 min intervallen tussen twee overnames durende 8 uur.
OPMERKING: De belichtingstijd is afhankelijk van de lichtintensiteit voor de microscoop. Cel beweging tijdens de vroege rek is erg traag; exposure-time kon ongeveer één beeld per seconde of minder. Wanneer de embryo's in een vroeg stadium morfogenese (dorsale intercalatie, ventrale behuizing), zouden vroege rek worden geregistreerd binnen 1 uur. Zorg ervoor dat het licht sluiter wordt gesloten tussen elke overname. - Voer de overname en op te slaan.
- Plaats de gemonteerde-slide op het podium van een microscoop. Zorg ervoor dat de microscoop is uitgerust met een 10x en 60x doelstellingen, alsmede DIC lenzen, prisma, camera en capture software waarmee time-lapse microscopie en het genereren van Z-stacks (geautomatiseerde Z-platform).
- Meting van vroege rek defecten middels beeldanalyse
- Open Fiji-ImageJ software ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- Kies in het menu Analyseren / Set Metingen, selecteert Perimeter. Voor elk embryo, pas de Z-schaalbalk te richten op de keelholte van het embryo zoals getoond in figuur 2A. Dit zorgt ervoor dat u gericht op het midden van het embryo. Om de lengte van het embryo meten de tijd aanpassen schaalbalk het embryo van belang hebben bij aanvang van het eerste rek (komma stadium Figuur 2A). Let op de tijd ( "Time-begin").
- Kies de gesegmenteerde lijn tool. Trek een gesegmenteerde lijn van de punt van de mond van het embryo tot aan het uiteinde van de staart na de scheiding van het embryo (Figuur 2A). Met behulp van het tabblad menu Analyseren / Meet, de lengte van de getekende lijn ( "Lengte begin") te verkrijgen.
- Herhaal deze meting voor dezelfde embryo eind vroege rek (moment waarop spieren beginnen contracting). Noteer de tijd ( "Time-end") en meet de lengte van het embryo ( "Lengte-end") zoals hierboven (figuur 2B) beschreven.
- Bereken de duur (D) van de vroege rek en de lengtetoename (L) in deze fase als volgt:
D = "Time-end" - "Time-begin '
& #160; L = "Lengte-end" - "Lengte-begin ' - Om de breedte hoofd te meten, past de tijdschaal bar om een embryo in het stadium van belang (1,2-voudig stadium of het einde van de vroege verlenging) te hebben. Kies de lineaire tool. Teken de transversale (dorso-ventrale as) middellijn van het hoofd. Deze sectie is het dikste gedeelte van de embryo (figuur 2C). Met behulp van het menu Analyseren / Meet, het verkrijgen van de lengte van de lijn die overeenkomt met het hoofd breedte.
- Op hetzelfde tijdstip Herhaal deze stap voor het tekenen van de transversale middellijn van de staart (middellijn tussen de intestinale klep en de staartpunt Figuur 2C) en meet het aan de staart breedte te verkrijgen.
OPMERKING: Gebruik deze meting om embryo's te vergelijken in hetzelfde stadium in verschillende fenotypes. Om de reproduceerbaarheid van deze meting te garanderen, zorg ervoor dat een locatie gelegen rond het midden van de lijn van de staart van het dier die gemakkelijk van het ene dier kan worden herkend aan een vondstnother. - Om de kop tot staart breedte verhouding berekenen, deelt het hoofd breedte bij de staart breedte.
2. Analyse van Late Rek Gebreken Met behulp van Image Analysis
- Synchronisatie van L1 Larven gebruik van Alkaline Hypochloriet Treatment
- Vanuit een niet-uitgehongerde mm plaat 60 met veel zwangere volwassenen, verzamel alle wormen in een micro-centrifugebuis door het wassen van de nematoden van de plaat met 1 ml M9 buffer met behulp van een Pasteur pipet.
- Sediment nematoden bij 3500 g gedurende 3 min bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof met behulp van een micropipet zonder de worm pellet.
- Voeg 1 ml hypochloriet oplossing aan elke buis (0,4 M hypochloriet, 0,5 M NaOH) en schud gedurende 3 minuten.
LET OP: Alkaline hypochloriet oplossing moet vers worden bereid en embryo's in deze oplossing moet voorzichtig worden geschud, maar er voortdurend naar om de ontbinding van de volwassenen en de zuurstofvoorziening van de embr optimaliserenyos. Na 3 min schudden, moeten de meeste volwassenen hun eieren los in de oplossing. - Spin bij 3500 g gedurende 3 min bij kamertemperatuur en snel de bovenstaande vloeistof met behulp van een micropipet zonder de pellet te verstoren.
- Was vier keer met 1 ml M9 buffer, gevolgd door centrifugatie bij 3500 g gedurende 3 minuten.
- Na de vierde wasbeurt, verwijder het supernatant en resuspendeer eieren in 700 pi M9 buffer zonder pipetteren de eieren (zoals de eieren zou vasthouden aan het plastic van de tip).
- Tape de buis op een 3-mm orbitale schudinrichting geplaatst in een incubator bij de geschikte groeitemperatuur en schudden bij 600 rpm overnacht.
- Lengte Meting van Synchronized Larven
- Centrifugeer gearresteerd L1 larven aan 3500 xg gedurende 3 min bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de larven in 100 pi M9 buffer en over te brengen op een agarose pad met behulp van een Pasteur pipet (agarose pads moeten voorbereidend zoals beschreven in paragraaf 1.1.2 tot 1.1.8). Plaats een dekglaasje op het pad.
OPMERKING: De pad hoeft niet te worden afgedicht met lijm voor dit experiment die korte acquisitie omvat. - Gebruik een 10X objectief en fasecontrast verlichting aan de lengte van de larven meten of een hoge resolutie camera wordt gebruikt. Verhoging van de intensiteit van het licht om te kunnen foto's binnen een paar milliseconden te vangen en dus het verkrijgen van een duidelijk beeld van de larven (figuur 2D).
OPMERKING: Tijdens het zwembad trashes van larven worden verminderd door de agarose pad, ze zijn nog steeds in beweging. Daarom hoge opnamesnelheden essentieel om een duidelijk beeld te verkrijgen. - Open Fiji-ImageJ en herhaal stap 1.3.1. Om de lengte van de larven te meten, kiest de gesegmenteerde lijn tool. Trek een gesegmenteerde lijn van de punt van de kop tot aan het uiteinde van de staart volgens de middellijn van de larven (figuur 2D, rechter paneel).
- Met behulp van het menu Analyseren / Meet, de lengte van de te verkrijgengetekende lijn overeenkomt met de lengte van de larven in micrometer.
- Centrifugeer gearresteerd L1 larven aan 3500 xg gedurende 3 min bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de larven in 100 pi M9 buffer en over te brengen op een agarose pad met behulp van een Pasteur pipet (agarose pads moeten voorbereidend zoals beschreven in paragraaf 1.1.2 tot 1.1.8). Plaats een dekglaasje op het pad.
3. Karakterisering van Late Rek Gebreken Met behulp van flowcytometrie
- Synchroniseer Larven
- Zuiveren embryo's met behulp van de alkalische hypochloriet behandeling zoals beschreven in paragraaf 2.1 van de volle 100 mm platen van weldoorvoede jonge volwassenen en laat de embryo luik en de L1 arrestatie in M9 buffer voor 16 tot 24 uur bij 20 of 25,5 ° C afhankelijk van de stam geanalyseerd.
LET OP: Een volledige plaat van weldoorvoede volwassenen per stam is voldoende voor de hieronder beschreven analyse.
- Zuiveren embryo's met behulp van de alkalische hypochloriet behandeling zoals beschreven in paragraaf 2.1 van de volle 100 mm platen van weldoorvoede jonge volwassenen en laat de embryo luik en de L1 arrestatie in M9 buffer voor 16 tot 24 uur bij 20 of 25,5 ° C afhankelijk van de stam geanalyseerd.
- Kalibratie van de Worm Sorter
OPMERKING: De flowcytometer hier gebruikt is een groot deeltje flowcytometer (hierna de worm sorter). De worm sorter is voorzien van een 670 nm rode laser diode, die is gelegen in de voorkant van een uitsterven detector. De worm sorter bevat ook een multi-line argon laser voor fluorescerende excitatie. de standard instrumenten drie fotomultiplicatorbuizen (PMT) fluorescentie detectors gebruikt om fluorescentie-emissie in het groene, gele en rode gebieden van het spectrum te detecteren. In de hier beschreven protocol, wordt TOF worden gebruikt om de grootte van de larven te meten, wordt het rode kanaal worden gebruikt om dode wormen die worden gekleurd met propidiumjodide (PI) te identificeren. GP (General Purpose) Hoge Fluorescentie Controle Particles gebruikt om het instrument te kalibreren en als een interne controle in ons experiment hoge fluorescentie weergegeven in groen, geel en rood. Zij zullen de enige objecten in de analyse met hoge emissie gedetecteerd in het groene kanaal monster en worden vervolgens geïdentificeerd op basis van deze eigenschap.
LET OP: Levende dieren worden geïdentificeerd op basis van de afwezigheid van fluorescentie in de groene en rode kanaal als op de TOF. Autofluorescente emissie uit de darm van de larven niet detecteerbaar L1 fase.- Schakel de laser blok, de computer, de compressor eend de worm sorter instrument. Druk op de START-knop op de geopende worm sorteermachine software, zoals aangegeven in de gebruiksaanwijzing van het instrument.
- Houd u aan de pop-up venster argon laser controle. Selecteer RUN-modus en wacht als de laser bevoegdheden oplopen tot 10 ± 1 mW. Selecteer DONE op de laser controle venster.
- Stel de schede en het monster druk om 5,10 ± 0,02 en 5,51 ± 0,01, respectievelijk. Laat de druk in evenwicht gedurende minstens 15 min en klik op de DRUK OK vakje.
OPMERKING: De stroomsnelheid is afhankelijk van de huls en het monster drukken. - Zorg ervoor dat alle luchtbellen aanwezig in het stromingskanaal buisjes tussen het monster beker en de analyse kamer te elimineren. Om dit te doen, klikt u op verwerven en tik zachtjes tegen het buisje tot er geen bubble verworven (zoals te zien in het venster acquisitie).
- Instellen van alle parameters voor tl en TOF metingen en detectie als volgt:
- Stel de schalen voor TOF, Ext, groen, geel en rood aan256. Set winst zoals beschreven in Tabel 1. Stel PMT Control bij 700 voor Groen en Geel en tot 900 voor Red.
OPMERKING: Twee excitatie filters zijn (488 nm en 514 nm) en kan worden gebruikt om ofwel Green fluorescent protein (GFP) of geel fluorescerend eiwit (YFP) of fluorochromen geëxciteerd bij deze golflengten met multiline argonlaser wekken. Gepaste filters nodig hebben in de filter kamer van de apparatuur in te voegen. We gebruikten de 488 nm filter voor het volgende experiment.
- Stel de schalen voor TOF, Ext, groen, geel en rood aan256. Set winst zoals beschreven in Tabel 1. Stel PMT Control bij 700 voor Groen en Geel en tot 900 voor Red.
- Om de worm sorter kalibreren, selecteer "run controle deeltjes" in het gereedschap menu. Doe 20 ml van 1x GP (General Purpose) Hoge Fluorescentie Controle Deeltjes in de beker (deze deeltjes zijn fluorescerende deeltjes van precieze grootte, verkocht door de fabrikant cytometrie om hun instrument te kalibreren).
- Klik op de knop Ophalen om schede en monsterstroom beginnen.
OPMERKING: Verwacht een gemiddelde verband met de controle korrelverdeling 21 ± 6 en acoefficient van de variatie rond dat gemiddelde (CV) ≤11. Als de CV is> 11 en het gemiddelde is> 27 proberen om de buisjes te reinigen door te klikken meerdere malen op de Clean-knop of door de knop van de stroom kanaal.
- Overname van Animal TOF
OPMERKING: Licht verspreidt wanneer een voorwerp passeert in de stroomcel tussen de laserbron en het uitsterven detector. De tijd die het licht wordt verstrooid door het vliegend voorwerp (vluchttijd, TOF) wordt gebruikt om de axiale lengte van het object te meten. De omvang van licht gemaskeerd door het object (extinctie, EXT) wordt gebruikt als een maat voor de ondoorzichtigheid / optische dichtheid.- Plaats 10 gl van gesynchroniseerde wildtype (wt) L1 in een horlogeglas en een schatting van het percentage dode eieren met behulp van een stereomicroscoop.
OPMERKING: Gesynchroniseerde L1 tonen Emb hoog (hoger dan 20%) in gew mag niet worden gebruikt voor verdere analyse. - Transfer gesynchroniseerd L1 uit de microcentrifuge (approximately 700 gl bevattende M9 L1) naar een 15 ml conische buis. Voeg propidium jodide (PI) bij een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml (verdunning 1/100 van een 1 mg / ml voorraadoplossing) en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: Dead eieren en larven worden gekleurd met PI en gedetecteerd als zeer fluorescerende objecten met behulp van het rode kanaal. - Voeg 10 ml M9 buffer om op gebrandschilderd bevolking te verdunnen. Neem 5 ml van de verdunde bevolking en verdun ze vier keer door de toevoeging van 15 ml M9. Plaats deze verdunning in het monster beker.
- Laat het monster stroom door te klikken verwerven en te observeren het debiet.
LET OP: Om een nauwkeurige meting te hebben, het debiet moet blijven tussen 15 en 25 objecten / sec. - Pas indien nodig het bedrag van dieren in de beker op het gewenste debiet te bereiken.
OPMERKING: De stroomsnelheid zal afhankelijk van de druk (mantel en staal) die constant zijn zoals in 3.2.3 en de concentratie van larven in de beker. Als het debiet hoger is dan 25 objecten / sec voeg wat buffer in de beker. Als deze lager is dan 15 items / sec toe geconcentreerd L1 (uit stap 3.3.3) in de beker. - Zodra de juiste concentratie van doel wordt bereikt, beoordelen het volume in de beker en voeg 1/4 e van dit volume in High Fluorescent GP Controledeeltjes 4x oplossing.
- Pas de gating en sorteren parameter. Om dit te doen, klikt u op 'Gating' op het menu en selecteer 'TOF vs.' en 'Green'. Klik op 'sorteren' op het menu en selecteer 'TOF vs.' en 'Red'. Gating en sorteren grafieken verschijnen dan zoals getoond in figuur 3A.
LET OP: Dit zal de visualisatie van de controle deeltjes (emissie in groen en rood) mogelijk te maken, dode dieren gekleurd door PI en bellen (emissie in Rood en niet groen) en levende dieren (geen emissie in noch Groen of Rood kanalen) (figuur 3A ). - Voer het experiment door te klikken ACQUire.
LET OP: om kleine verschillen in grootte tussen de larven identificeren, analyseren ongeveer 10.000 objecten, dus ongeveer 8.000 dieren. Stop met het experiment en de gegevens als .txt-indeling exporteren door te klikken op STORE.
- Plaats 10 gl van gesynchroniseerde wildtype (wt) L1 in een horlogeglas en een schatting van het percentage dode eieren met behulp van een stereomicroscoop.
- Meting van de relatieve omvang van levende dieren in Synchronized Populaties
- Open het .txt bestand met behulp van een software in staat om grote hoeveelheden gegevens tabellen beheren.
- Van de geanalyseerde objecten extraheren de TOF behorende bij controle deeltjes die worden gekenmerkt door emissie in het groene kanaal hoger dan 100 arbitraire eenheden (dit is afhankelijk van de in punt 3.2.5 parameters). Maak een nieuwe kolom en noemen het 'control deeltjes'. Maak een kolom met alle andere voorwerpen behalve de controle deeltjes genaamd 'monster'. LET OP: de fluorescentie-emissie van nieuwe deeltje batch moet worden gecontroleerd voor aanvang van de acquisities. Dit zal de fluorescerende drempel waardoor de identificatie van de setcontrole deeltjes op L1s.
- Voor elk geanalyseerd stam identificeren van het gedeelte van het experiment waarbij de stroomsnelheid is gewijzigd (door de aanwezigheid van een prop eieren bijvoorbeeld). Om dit te doen:
- Zet de TOF "zeggenschap deeltjes 'voor elk monster als een factor van tijd (figuur 3B).
- Teken de lineaire trendlijn met behulp van de trendlijn gereedschap en de vergelijking op de kaart weer te geven.
NB: De TOF controle deeltjes moet constant in de tijd (horizontale lijn, Figuur 3B). Gezien de vergelijking van de lineaire trendlijn getekend op de gegevens y = ax + b, ervoor te zorgen dat de 'a' waarde lager is dan 10 -4. Alle metingen binnen de tijd delen voor weergave van een breuk in de uitlijning van de controle deeltje moet uit de analyse worden verwijderd.
- Verwijder de dode embryo en bellen (emissie hoger dan 15 in het rood) evenals kleine puin en grote ei pluggen (TOF lager dan 10 en higher zijn dan 70, respectievelijk) van het 'monster' meting.
- Zet de distributie 'control deeltjes' voor elke stam geanalyseerd. Zoals blijkt uit figuur 3C deze distributies moet bijna perfect overlappen. Zodat TOF metingen verkregen voor verschillende stammen te vergelijken. OPMERKING: normalisatie van steekproefelementen TOF via control deeltjes kunnen worden gebruikt als de verdelingen van deeltjes in een controle monster geen overlay met die van controlemonsters. De genormaliseerde TOF worden berekend als volgt:
- Normaliseren TOF voor genotype G = (sample TOF voor G) / (gemiddelde 'control deeltje' TOF voor G) x (gemiddelde 'control deeltje' TOF voor wt), waar wt is de steekproef voor controles.
- Plot Larven TOF distributie voor elke stam inclusief de controle monster, in ons geval wt dieren (Figuur 3D). Meet het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde (SEM) voor elke populatie (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hoofd-, staart- en Head / Tail-breedteverhouding zijn robuust Metrics.
De hier beschreven protocollen zijn met succes gebruikt om de functie van regulatoren en effectoren van Rho GTPases pix-1, pak-1 karakteriseren en laat-502 tijdens de vroege elongatie 7. Pix-1 en pak-1 code respectievelijk een guanine-exchange factor (GEF) en een effector specifiek voor Rac / Cdc42 GTPases en laat-502 codeert voor een effector voor Rho-1 7. In deze studie pix-1 en pak-1 werd aangetoond dat epidermale morfogenese controleren tijdens de vroege elongatie 7. Herbij kop en staart breedtemeting als statistieken tonen voor de eerste keer dat onderhuidse cellen die zich in de voorste embryo volgen verschillende morfogenetische programma's dan die zich in zijn achterste 7. Om de reproduceerbaarheid en de robuustheid van deze statistieken vast te stellen, werd het hoofd breedte onafhankelijk vijf maal op 12 wild-type (wt) embryo's gemeten op 1,2 maal het podium. Afwijkingen tussen de vijf verschillende groepen metingen werden vergeleken vervolgens beoordeeld met de Brown-Forsythe proef (met R statistiekpakket) onthullen geen significante verschillen tussen de metingen (F- proef p- waarde> 0,5; Figuur 4A) suggereert dat metingen van een groep embryo reproduceerbaar. Beoordeling van reproduceerbaarheid en batch effecten geassocieerd met deze metingen werd gedaan door middel van het meten van de breedte van hoofd gew embryo's in 1,2-voudige fase van DIC 4D-beeldvorming uitgevoerd op drie verschillende dagen (n = 12 embryo's). Dezedrie meetgroepen, het verschil was niet significant verschillend en geen significante batch effecten bleken beïnvloeden het hoofd-width meetresultaten (F-toets p -waarde> 0,5 Figuur 4B).
Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor staart breedtematen en metingen gedaan op verschillende stadia van hun rek (gegevens niet getoond). Deze gegevens opgericht head-width, staart-breedte en kop / staart breedte verhouding zo robuust metrics vroeg rek defecten te karakteriseren.
Het meten van kop en staart Width evenals Lengte van de Embryowet Maakt voor de karakterisering van genen die vroege Verlenging langs de Antero-posterior as van het embryo.
Meting van de lengte van de embryo's, evenals de breedte van de kop en staart werd uitgevoerd op wt en mutante embryo's met nul of warmte gevoelige verliesgevende-functieverlies allelen van genen die vroege rek: pix-1 (gk416);pak-1 (ok448) en laat-502 (sb118ts) 7. We maten de kop / staart (H / T) breedteverhouding van wt en mutant embryo's in het begin (1,2-voudig trap) en aan het einde van de eerste rek bij niet-permissieve temperatuur (Figuur 4C linker en respectievelijk rechter paneel). Terwijl aan het begin van vroege rek was er geen veranderings- of verminderde H / T-verhouding werd waargenomen in pix-1, pak-1 en laat-502 mutanten in vergelijking met wt dieren (1,2-voudig fase, figuur 2C, linkerpaneel ) eind vroege rek alledrie mutanten vertoonden een significant hogere H / T verhouding dan wt embryo (t-test p-waarden <0,006; Figuur 4C, rechter paneel). Dit toonde dat pix-1, pak-1 en laat-502 mutant embryo tonen abnormale antero-posterior morfologie eind vroege rek. Verdere analyse vergelijken breedte kop en staart breedte between 1,2-voudige fase en eind vroege rek, met dezelfde meetparameters gebleken dat de breedte dier minder wordt verlaagd pix-1, pak-1 en laat-502 mutanten terwijl de breedte staart vermindert minder let-502 mutanten alleen 7. Hieruit bleek dat laat-502 controles morfogene processen eveneens langs de antero-posterior as van het embryo, terwijl pix-1 en pak-1 control morfogene processen hoofdzakelijk plaatsvinden op het voorste deel van het embryo 7. Het lengteverschil tussen het embryo aan het einde tegenover het eerste begin van elongatie (figuur 4D) werd eveneens gemeten. We vonden dat vroege rek significant verminderd in pix-1, pak-1 en laat-502 mutanten in vergelijking met wt suggereert dat wijziging van de voorste morfogenese in pix-1 en pak-1 mutanten alleen voldoende om aanzienlijke vermindering van de elongation van het embryo.
Protocol 2 en 3 werden gebruikt om de lengte van aangehouden larven wt en mutant achtergronden beoordelen. De lengte van de larven werd bepaald met behulp van zowel beeldanalyse (protocol 2) 7 en stroomcytometrie (Protocol 3; ongepubliceerde gegevens). Metingen lengte larven via beeldanalyse kunnen er absolute metingen van lengte dieren in micrometers in een robuuste en zeer reproduceerbare wijze (Figuur 5A). Deze analyse onthulde dat gesynchroniseerd mutant larven scherm aanzienlijk verminderd lengte in vergelijking met wt (figuur 5A) 7. Meting van deze larven met de stroom-cytometrie gebaseerd protocol (protocol 3) leverde vergelijkbare resultaten (Figuur 5B). Er moet echter worden opgemerkt dat het grote aantal larven gemeten met de laatste benadering sterk toegenomen statistische robuustheid van genotype vergelijking (t - -test p-waarden <10 -24). Op basis van deze bevindingen kan de stroom-cytometrie benadering een betere keuze via beeldanalyse zijn om mutante dieren met zeer subtiele defecten rek karakteriseren.
Figuur 1. Bereiding van een Agarose Pad. A, microscoopglaasje geplaatst tussen twee spacer slides waarop twee lagen plakband. B, wordt de agarose pad bedekt met een andere dia ondersteund door de twee afstandhouder slides. C, de uiteindelijke vorm en afmeting van de agarose pad na knippen met een scheermesje om het dekglaasje te passen. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
g2.jpg "/>
. Figuur 2. Meting van vroege en late Rek Defecten A - B Meting van de lengte van een embryo in komma trap (A) en aan het einde van eerste rek (B). De rode lijn, wordt gebruikt om de embryo's te meten werd getekend met de gesegmenteerde lijn instrument van ImageJ. C, hoofd en staart breedte worden gemeten in embryo's in 1,2-voudige fase (links) en aan het eind van de vroege rek (rechts). Pijlen geven de lokalisatie van meetvelden (gemodificeerd van Martin et al., 2014). Schaal bar:. 20 urn D, Lengte van de larven wordt gemeten voor gesynchroniseerde L1-larven. Rechterpaneel is een vergroot aanzicht van het opgenomen beeld (links). De rode lijn werd getrokken met behulp van de gesegmenteerde lijn instrument van ImageJ. Het wordt gebruikt om de lengte van de larven te meten. Schaal bar:. 100 um Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Meting van de lengte van Synchronized Larven gebruik van Flow-cytometrie. A, Gating en sorteren raam van COPAS Biosort tonen Groen en Rood uitstoot van controle deeltjes, bellen, dode en levende dieren ten aanzien van hun time-of-Flight (TOF ). B, TOF controle deeltjes op verschillende tijdstippen voor een representatief experiment. De helling van de lineaire functie van TOF versus tijd ongeveer 10 -5, wat aangeeft dat TOF controle deeltjes tijd constant is gedurende het experiment. C, verdeling van deeltjes control TOFS uitgedrukt als percentage van de maximale waarde van distributies. Non-genormaliseerd en genormaliseerde controle deeltje distributies zijn vertegenwoordigd pak-1 (ok448). Andere uitkeringen worden niet genormaliseerd. D, distributie van TOFS voor het levendieren uitgedrukt als percentage van de maximale waarde van de verdelingen. TOFS worden niet genormaliseerd op controle deeltjes behalve pak-1 (ok448) zoals aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Pix-1, Pak-1 and Let-502 Mutants Present Early Rek Gebreken. A - B, reproduceerbaarheid en robuustheid evaluatie van het hoofd breedte afmetingen A, vijf onafhankelijke metingen van het hoofd breedte voor wt embryo's in 1,2-voudige fase (n = 12 embryo's).. En standaardafwijking (foutenstaven) zijn aangegeven. Niet significant (ns) verschillen tussen metingen werden berekend met behulp van de Brown-Forsythe-test (using R statistisch pakket) (F-toets p-waarde> 0,5). B, hoofd breedte maat voor wt embryo's op drie verschillende dagen (n = 12 embryo's). Gemiddelden en standaarddeviaties worden eveneens weergegeven; Er was geen significant verschil in variantie over de metingen (ns; Brown-Forsythe F-proef p-waarde> 0,5) C, Distributions of kop / staart width ratio 1,2-voudige fase (linker paneel), eind vroeg. rek (rechter paneel) in gew, pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) en laat-502 mutanten (sb118ts) bij 23-24 ° C. Merk op dat moeders van laat-502ts embryo's die voor deze studie werden bij 25,5 ° C. D, verdeling van de rek in gew, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) en laat-502 (sb118ts) mutanten tussen komma podium en het begin van de late verlenging. De box-plots vertegenwoordigen de min, max, 25 e, 50 e (mediaan) en 75ste percentielen van de bevolking. * T-test p-waarde <0,05, ** t-test p-waarde <0,006 (gemodificeerd van Martin et al., 2014). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) en L et-502 (sb118ts) Larven Present Lengte Gebreken. A, Lengte van de larven gemeten in gew, pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) en laat-502 (sb118ts) dieren gemeten met behulp van beeldanalyse (Protocol 2). B, lengte Relatieve larven gemeten met behulp van flow cytometer ( Protocol 3). Getallen tussen haakjes overeen met het aantal dieren dat voor the metingen. Middelen van de lengtes en standaardafwijking van het gemiddelde (SEM; error bars) zijn vertegenwoordigd. Student's t-test p-waarden worden aangegeven (p). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft roman metrics om vroeg te karakteriseren en late stadia van de embryonale rek.
In hoofdstuk 1, de kritische stap is de mogelijke aanwezigheid van bacteriën op het pad. De embryo's zijn hermetisch afgesloten tussen het pad en het dekglaasje tijdens beeldacquisitie. Het afdichten van de slide is nodig om uitdrogen van de dieren tijdens het verwerven die meer dan twee uur duurt te voorkomen. Voor zover wij weten, geen van de jagers gebruikt om agarose pads tussen glijbaan en dekglaasje te monteren zijn luchtdoorlatend. Derhalve bij een grote hoeveelheid bacteriën (of embryo's) aanwezig op het pad is, kunnen deze weinig zuurstof na enkele uren leidt tot de voortijdige dood. Met drievoudige embryo - overeenkomend met embryo's die 3-voudige lengte vergeleken met niet-langwerpige embryo - opgenomen samen met de embryo's van belang een goede indicator van mogelijke hypoxische omstandigheden, aangezien deze embryo stoppen met bewegen in their eierschalen in afwezigheid van zuurstof. Geen morfologische metingen moeten worden gedaan op hypoxische omstandigheden of op dode embryo's.
Een andere belangrijke stap bij het gebruik van time-lapse imaging is temperatuur waarbij de ontwikkeling van het embryo plaatsvindt. Temperatuurgevoelige mutanten worden momenteel gebruikt in C. elegans. Het biologische effect van temperatuurverschuiving kan onmiddellijk plaatsvinden of vertraagd, afhankelijk van de halfwaardetijd van het eiwit en de aard van de mutatie draagt zijn. Derhalve dient de temperatuur waarbij het embryo bloot constant kan worden gehandhaafd en worden geregeld door geschikte ventilatie van de ruimte microscopie of verwarming koelkamer op de microscoop podium.
Deel 2 is afhankelijk van de larven synchronisatie met behulp van alkalisch hypochloriet behandeling. Onder bepaalde omstandigheden kan deze behandeling leiden tot embryonale letaliteit (Emb). Emb boven 20% in gew populatie suggereert verhoogde toxiciteit tijdens hypochloriet treatment die een negatieve invloed kunnen hebben op morfogenese. Gesynchroniseerde weergave van L1 hoge Emb in gew achtergrond mag niet worden gebruikt voor verdere analyse. Deze beperking geldt ook voor protocol 3.
We raden het gebruik van anesthetica aanbevelen aan larven te immobiliseren. Levamisol name immobiliseert de nematode door de inductie van spier tetanie die neigt de larven invoering experimentele voorspanning krimpen. Als belichtingstijd niet snel genoeg ten gevolge van de beperkingen van de microscoop, raden wij aan een lagere beweeglijkheid van de larven door verhoging van de concentratie van de agarose in het kussen en het verminderen van de hoeveelheid vloeistof tussen het kussen en het dekglaasje. Zorg dient echter te worden gehouden, de larven niet uitdrogen, omdat verdroging hun grootte te verminderen.
In paragraaf 3, het meten van de lengte van de larven gebruikte vergelijking van de debieten tussen geanalyseerde monsters. Om dit te doen, de verdeling van de controle deeltjes moet Compa zijnrood. Als de verdelingen volledig overlay kan de TOF (time-of-flight) waarden verkregen voor overeenkomstige monsters te vergelijken, indien niet, moeten deze waarden worden genormaliseerd. Normalisatie van sample-TOF via Controledeeltjes-TOF (zoals beschreven in 3.4.5.1) is met succes gebruikt als getoond pak-1 (ok448) (Figuur 3C en Figuur 5B). Relatieve lengte van pak-1 (ok448) en wt bleek vergelijkbaar in ten minste 3 onafhankelijke experimenten met of zonder normalisatie te zijn (gegevens niet getoond). Toch raden wij u, ter bevestiging van de resultaten verkregen met normalisatie met die verkregen zonder dat, in het bijzonder bij het vergelijken van de larven met kleine omvang verschillen. Opgemerkt wordt dat de meting van de lengte larven middels stroomcytometrie heeft een lengte ten opzichte van een controlemonster, in casu gew larven in plaats van een absolute lengte micrometer als voor beeldanalyse. Dit betekent dat de metingen van onafhankelijke experimenten kan nietgecombineerd worden, tenzij het berekenen van de grootte verhouding meer dan gew.
De buffer wordt gebruikt voor verdunning in het monster cup zal een impact hebben op de stroomsnelheid te hebben. We zagen dat de mantel buffer aanbevolen door de fabrikant bevat detergens dat de hoeveelheid belletjes die tijdens acquisitie verhoogt. Gebruik M9 buffer, die geen detergens bevat, aanzienlijk verminderd blaasvorming maar was minder efficiënt bij het voorkomen van het verstoppen van eieren in de tubuli van de sorteerder, waarbij het debiet van monsters beïnvloedt. Ei plugging wordt gemakkelijk gedetecteerd tijdens de overname door een duidelijke afname van de waarneembare deeltjes TOF controle gedurende enkele seconden, gevolgd door een verhoogde TOF- ook enkele seconden. Egg plugging kan ook leiden tot de obstructie van het kanaal en de volledige arrestatie van het deeltje stroom (minder dan 5 objecten per seconde). Als dit gebeurt, klikt u op de knop CLEAN totdat stroomsnelheid wordt hersteld. De metingen die tijdens deze gebeurteniss moeten worden uitgesloten van de data-analyse. Schede buffer kan worden aanbevolen voor experimenten met stammen gekenmerkt door een hoge tarieven van dode eieren.
Het monster en schede druk (vastgesteld in stap 3.2.3), kan (enigszins) tijd veranderen en moet handmatig gedurende het experiment worden aangepast om een constant debiet te verzekeren. Verlaging of verhoging van het lage tarief zal waarneembaar zijn bij het analyseren van de resultaten en het uitzetten van de TOFS controle deeltjes na verloop van tijd (figuur 3C). Vermindering van de stroomsnelheid resulteert in de toename van de gemiddelde TOFS deeltjes tijd, terwijl een verhoging van de stroomsnelheid resulteert in het tegenovergestelde. Verandering van het debiet zal een negatieve invloed hebben op de gevoeligheid van de werkwijze het detecteren kleine maatverschillen tussen populaties larven.
Methoden gericht op genen die rek identificeren en die time-lapse microscopie opname zijn over het algemeen hoogly tijdrovend en vervelend wanneer fenotypering meerdere genotypes. De stroom cytometer-gebaseerde benadering, terwijl die materiaal niet voor alle laboratoria, minder tijdrovend en daardoor efficiënter als verschillende stammen moeten worden gekarakteriseerd. Deze methode is ook meer statistisch robuust in vergelijking met metingen met behulp van beeldanalyse (beoordeeld door T-test van de student te vergelijken mutante en wt TOF distributies Figuur 5A en B). Deze methode kan dan zeer geschikt voor stammen die rek gebreken met lage expressiviteit / penetrantie.
Verschillende werkwijzen gebruikt stroomcytometrie ontwikkeld in het verleden fitheid van nematoden 9-12 meten. Deze methoden dieren verdeeld in een 96-well platen en de Reflex module van de worm sorter. De Reflex-module maakt directe analyse van de nematode bevolking verdeeld in 96-well platen. Derhalve zijn deze methoden kunnen karakrize honderden omstandigheden per dag en vormt een robuuste wijze om de conditie van een niet-gesynchroniseerde populatie te meten. Ze zijn echter niet goed geschikt voor kleine grootte verschillen tussen gesynchroniseerd L1 identificeren. Meting van kleine verschillen tussen L1 larven vereist de meting over een groot aantal dieren, die onverenigbaar is met het gebruik van 96-well platen en de Reflex module die efficiënt 100 objecten hooguit per putje kan karakteriseren. De hier beschreven methode is ontworpen voor dit doel ten koste van de doorvoer, die aanzienlijk wordt verminderd. Het maakt de karakterisering van 3-4 omstandigheden per uur nadat het instrument is afgesteld, wat een duidelijke verbetering ten opzichte via beeldanalyse in protocol 2.
Meting van kop en staart breedteverhouding is de eerste methode die is ontwikkeld om morfogene processen die ongelijk langs de antero-posterior as van het embryo 7 karakteriseren. Wanneertoegepast om genen getoond vroeg rek beheersen, zullen deze werkwijzen de ruimtelijke verdeling van signaalwegen morfogenese in dat stadium verduidelijken. Meten van de lengte van aangehouden larven behulp van beeldanalyse of flowcytometrie in combinatie met meting van de lengte van het embryo eind vroege rek zullen de identificatie van genen die ofwel vroeg of laat rek of beide met een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid mogelijk. Deze procedures kunnen dan een belangrijke bijdrage leveren aan de toekomstige begrip van de ruimtelijke en temporele regulering van signaalwegen embryonale rek in C. elegans. Bovendien kunnen deze methoden worden aangepast om signaalwegen lichaamslengte zoals insuline en TGF-beta Studiepaden 13, 14 en chronische blootstelling aan milieuverontreinigingen 15, 16. Deze metingen kunnen worden gedaan op verschillende larvale stadia of volwassenen using kleine wijzigingen van de Protocollen 2 en 3. Het meten grootte verschillen in L1 is een grotere uitdaging met de worm sorter dan grotere voorwerpen zoals L3, L4 larven of volwassenen. Protocol 3 kunnen dan gemakkelijk worden aangepast aan deze metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
