Introduction
Por quase 50 anos, os nematóides Caenorhabditis elegans estabeleceu-se como um modelo poderoso para estudar questões importantes no desenvolvimento, neurobiologia, evolução, interações patógeno-hospedeiro, etc. 1 A força deste modelo no estudo do desenvolvimento encontra-se em: seu ciclo de vida curta de 3 dias; a facilidade com que estes animais podem ser geneticamente alteradas; sua transparência que permite a observação de deslocamento e morfologia celular em animais vivos e seu desenvolvimento que é principalmente extra-uterina. As fases de desenvolvimento do nematóide envolvem embriogênese e quatro estágios larvais (L1 a L4), seguido por idade adulta. Durante o desenvolvimento embrionário, epidérmica morfogênese atraiu considerável atenção por sua capacidade de permitir uma melhor compreensão de como epitelial células migram como um grupo, como eles reorganizar suas junções e modificar sua morfologia individual, bem como o seu posicionamento relativo dentro de um epitélio funcional.morfogénese epidérmico é dividido em quatro fases: intercalação dorsal que consiste na reorganização das células epidérmicas dorsal, designado por hipoderme; ventral invólucro, que consiste na migração de células ventrais hipodérmicas para com a linha média ventral, assim, que encerra o embrião de uma monocamada de células epiteliais; início e alongamento final de transformação do embrião em forma de feijão em larvas vermiforme. Seguindo morfogênese, Vigia do embrião e as larvas L1 iniciar a alimentação por meio de bactérias disponíveis no seu ambiente imediato.
alongamento embrionário é, por conseguinte, uma fase tardia do desenvolvimento embrionário. Consiste na extensão do embrião ao longo do seu eixo longitudinal e uma redução do seu diâmetro transversal. Isto envolve uma modificação da forma dramática das células hipodérmicas. Alongamento é dividido em um precoce e uma fase tardia. A fase inicial começa na fase vírgula e termina quando os músculos do corpo de parede começam a contrair na fase de 1,75 vezes em wdo tipo DPI (em peso) de embriões - correspondente a embriões que são 1,75 vezes em comprimento em comparação com os embriões não alongado. Morfogênese que ocorrem nessa fase são impulsionadas principalmente pela contração de feixes de filamentos de actina (FBS) localizadas no pólo apical de células hipodérmicas que impulsionam seu alongamento ao longo do eixo antero-posterior do embrião 2. A contração dos corpos estranhos é o controle por fosforilação das cadeias de miosina-luz por três quinases LET-502 / Rock, MRCK-1 e Pak-1 5. A fase final do alongamento, começa quando os músculos do corpo de parede se tornar funcional e começar a contratação. Trata-se de sinalização mecanotransdução dos músculos do corpo de parede para as células dorsal e ventral hipodérmicas e termina quando os animais chocar 3.
Alongamento defeitos são geralmente caracterizadas por a percentagem de animais que morrem como embriões (letalidade embrionária; Emb) e aqueles prender o seu desenvolvimento como larvas L1 (fenótipo prisão larval; Lva) e ser significativamente menor do que em peso. A identificação do estágio da prisão de desenvolvimento requer observação microscópica de embriões mortos e presos Larvas 3-6.
Recentemente, foi demonstrado que vários genes, tais como o regulador de Cdc42 / Rac efector e pix-1 e Pak-1, o controlo dos processos morfogénicas durante tanto precoce e tardia de alongamento 3,7. Nós também mostrou recentemente que os processos morfogénicas diferem ao longo do eixo ântero-posterior do embrião precoce durante o alongamento 3 7. Estes resultados motivou o desenvolvimento de novas métricas destinadas especificamente às etapas de alongamento precoce ou tardia e outras de medição, permitindo a caracterização da morfologia de embriões ao longo do seu eixo ântero-posterior durante o alongamento inicial.
Estes novos métodos consistem na medição do comprimento de embriões no início e no final de alongamento precoce, bem como a largura da sua eleanúncios e caudas. 7 Dois protocolos foram também desenvolvidos para medir o comprimento das larvas recém-nascidas, sincronizados em L1 estágio 7.
Os ovos dos embriões protegê-los contra o tratamento alcalino, enquanto hipoclorito larvas, e adultos bactérias presentes no meio de cultura são dissolvidos pelo tratamento. Este tratamento é, então, utilizada para purificar embriões a partir de uma população não sincronizada contendo a maioria dos adultos bem alimentados 8. restrição alimentar é usado para sincronizar as larvas recém-nascidas. Medindo a duração dessas larvas é então usada para detectar defeitos de alongamento. Esta medição é preferido em relação à medição de larvas preso em placas de cultura, porque as larvas que eclodem a partir de embriões não totalmente alongados pode recuperar a "comprimento normal" ao alimentar mas irá manter o seu tamanho reduzido, quando preso na ausência de comida.
Aqui, apresentamos protocolos detalhados que permitem a medição da length de alongar embriões, bem como a largura da sua cabeça e cauda utilizando lapso de tempo de microscopia DIC e análise de imagem (Protocolo 1). Nós também fornecemos protocolos detalhados para medir o comprimento de larvas sincronizados usando análise de imagem (Protocolo 2) e citometria de fluxo (Protocolo 3).
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Protocol
1. Caracterização de Defeitos Alongamento adiantados em WT e mutantes Animais
- Embriões de montagem para Normarski DIC Microscopia
- Preparar o seguinte meios de cultura e do material:
- M9 buffer, dissolver 12,8 g / L de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / l KH 2 PO 4, 5 g / L de NaCl, 0,25 g / L MgSO 4 • 7H 2 O em água destilada e em autoclave para esterilizar.
- Placas NGM, dissolve-se 3 g / L de NaCl, 16 g / L de ágar, 2,5 g / l de bactopeptona em ddH 2 O. Autoclave e adicionar 1 mM de MgSO4, CaCl2 1 mM, tampão de fosfato 1 mM e 5 ug / ml de colesterol. Pour 6 ml de NGM por pratos de 60 mm. Permitir que a forma a solidificar durante 24 horas à temperatura ambiente. Adicione algumas gotas de uma cultura saturada de E. OP50 bactérias coli cresceram em caldo de Luria (LB). Deixe as bactérias crescem durante 48 horas e armazenar as placas a 4 ° C.
- Para gerar o pi vermeCK, um suporte de fio de platina de 0,01 "de diâmetro em uma pequena pipeta de Pasteur. Fixar o fio de platina para a extremidade da pipeta de vidro por aquecimento de essa extremidade com um queimador de benzeno. achatar a extremidade do fio para gerar uma espécie de pá.
- Crescer a tensão verme em 60 mm placas NGM com OP50 a 20 ° C.
NOTA: alelos termossensível pode necessitar de crescimento dos animais, a temperaturas não permissivas a até 25,5 ° C. As placas devem conter muitos adultos jovens e ainda a abundância do alimento a fim de prosseguir os protocolos. - Coloque uma lamela de microscópio entre duas lâminas de espaçamento cobertas por duas camadas de fita adesiva (Figura 1A).
- Prepara-se uma solução de agarose a 3% (peso / volume) em tampão M9 por dissolução de 0,6 g de pó de agarose em 20 ml de tampão M9 por aquecimento no forno de microondas durante 30 seg. Deixe a solução esfriar por 5 min.
NOTA: A solução de agarose pode ser utilizado para alguns dias após a fusão em um forno de microondas. istotambém pode ser dividido em alíquotas e armazenado a 4 ° C durante semanas. - Colocar uma gota da solução de agarose quente de 3% sobre a lâmina de vidro localizado entre os dois espaçadores-lâminas. Evitar a formação de bolhas.
- Rapidamente cobrir a agarose com outro slide como mostrado na Figura 1B e pressione suavemente. O deslizamento de topo irá achatar a gota de agarose e gerar um bloco com a espessura de duas camadas de fita adesiva.
- Permitir que a agarose solidificar durante pelo menos 1 min a temperatura ambiente ou até que os embriões são pronto para ser transferido para a almofada.
- Usando uma picareta verme, transferir 20 a 30 jovens adultos bem alimentados a partir da NGM-placa em um tubo de micro-centrífuga contendo 400 mL de tampão M9.
- Permitir que os vermes para sedimentar por gravidade durante aproximadamente 5 min e remove-se o sobrenadante utilizando uma micropipeta. Esta etapa tem o objetivo de remover o máximo de bactérias escolhidas com os nematóides.
- Adicionar 200 ul de tampão M9 a cada tubo.
- Usando um pip Pasteurette, transferir o conteúdo do tubo (tampão e nemátodos) para um vidro de relógio.
- Use uma ou duas 25G 5/8 "agulhas para cortar os animais no ponto médio do corpo (entre o spermatheca ea vulva).
NOTA: Uma lâmina de bisturi, também pode ser usado como uma alternativa à agulha (s). Faça isso em nematóides natação e pode exigir alguma prática. A ideia é a utilização de agulhas como tesouras ou uma faca como dependendo de como muitas agulhas são utilizadas. Uma vez que os animais são cortados, hermafroditas libertar os seus embriões no buffer. - Concentra-se os embriões no centro do vidro de relógio, através da geração de um vórtice circular no interior do líquido.
- Remover a maior parte da M9 a partir do vidro de relógio utilizando uma micropipeta. Deixar cerca de 30 ul de M9 com os embriões.
- Remover a corrediça de cobertura da almofada de agarose (Figura 1B), deslizando-o fora da almofada.
- Cortar a almofada com uma lâmina de barbear, de modo a ser capaz de cobrir completamente com uma lamela (Figura 1C).
- Com uma pipeta Pasteur, transferir todos os embriões (e detritos sem-fim) sobre o bloco de agarose.
- Grupo os embriões no centro do painel usando um cílio colado na extremidade de uma ponta usada para micropipetas 200 ul.
- colocar-se lentamente uma lamela na plataforma de evitar a formação de bolhas e selá-lo.
NOTA: Vários cimentos podem ser utilizados. Usamos desenho goma encontrada em arte e artesanato lojas (geralmente usada como máscara de goma para a pintura aquarela). Esta goma é utilizado porque é hidrofílica e solidifica razoavelmente rápida e não é tóxico para os vermes. Slides também pode ser selado com unha polonês ou valap (mistura feita de vaselina, lanolina e cera de parafina). - Permitir que o desenho seco gum por cerca de 15 min.
- Preparar o seguinte meios de cultura e do material:
- Gravação precoce Alongamento usando Four-dimensional Normarski DIC Microscopia
NOTA: O objectivo deste passo é para gravar o alongamento precoce de vírgula para o início da tarde alongamento- Definido como o momento quando os músculos do corpo de parede começar contratação. Também pretendemos gravar mais de um embrião no momento. Oito horas de gravação geralmente são obrigados a registrar o alongamento cedo para um grupo de embriões não-sincronizado.- Coloque a-corrediça montada sobre a plataforma de um microscópio. Certifique-se de que o microscópio está equipado com 10X e 60X objectivos, bem como lentes de DIC, Prisma, câmera e software de captura que permitem microscopia de lapso de tempo e de geração de Z-stacks (Z-plataforma automatizada).
NOTA: garantir que a temperatura é constante entre 20 e 23 ° C na sala de microscopia. Uma câmara de refrigeração de aquecimento podem ser necessários no palco microscópio, especialmente quando se utiliza mutantes termossensíveis. - Identificar um grupo de embriões em fases pré-morfogénese usando a objectiva 10X.
- Uma vez localizado, deslize a objetiva de 10X e adicionar uma gota de óleo de imersão no slide.
- Usando o objetivo 60X, identificar a parte superior e inferior do embryos para configurar os parâmetros de imagem Z-stack.
NOTA: Não hesita para definir o Z-pilha maior do que a espessura dos embriões. Defina a distância entre dois planos adjacentes como 0,8 mm. Isto irá permitir a cobrir a profundidade total dos embriões em 35 a 50 Z-planos.
NOTA: Se o microscópio contém uma plataforma XY automatizado, embriões localizados em diferentes locais da almofada poderia ser gravados simultaneamente. Para fazê-lo, ficha coordenadas XY de cada localização na almofada que deseja analisar durante o decurso da experiência. Certifique-se de selecionar o xy ao definir o parâmetro de gravação e seguir o resto do protocolo, como indicado. Fina Z-secção do embrião durante a gravação não é necessariamente obrigatório para as medições detalhadas neste protocolo. Gravando o desenvolvimento embrionário dos animais WT e mutantes com a resolução máxima é no entanto uma boa prática, a fim de construir uma biblioteca de gravações capazes de suportar análises adicionais. - Conjunto-se o lapso de tempo com intervalos de 2 minutos entre duas aquisições com duração de 8 horas.
NOTA: O tempo de exposição dependerá da intensidade da luz para definir o microscópio. a movimentação das células durante o alongamento precoce é muito lenta; exposição em tempo poderia ser aproximadamente um quadro por segundo ou menos. Se os embriões estão em estágios iniciais morfogênese (intercalação dorsal, cerco ventral), alongamento no início seria registrada dentro de 1 hora. Certifique-se de obturador de luz está fechado entre cada aquisição. - Executar a aquisição e guardá-lo.
- Coloque a-corrediça montada sobre a plataforma de um microscópio. Certifique-se de que o microscópio está equipado com 10X e 60X objectivos, bem como lentes de DIC, Prisma, câmera e software de captura que permitem microscopia de lapso de tempo e de geração de Z-stacks (Z-plataforma automatizada).
- Medição de Defeitos Alongamento adiantado que usa Análise de Imagem
- Software Fiji-ImageJ Open ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- No menu, selecione Analisar / Definir Medidas, selecione perímetro. Para cada embrião, ajustar a barra de escala Z a concentrar-se na faringe do embrião, como mostrado na Figura 2A. Isto irá assegurar que você se concentrar no centro do embrião. Para medir o comprimento do embrião, ajustar a barra de escala de tempo para que o embrião de interesse no início do início do alongamento (fase vírgula; Figura 2A). Observe o tempo ( "Time-início").
- Escolha a ferramenta de linha segmentada. Desenhar uma linha segmentada da ponta da boca do embrião até a ponta da cauda seguindo a linha média do embrião (figura 2A). Usando a guia do menu Analisar / Medida, obtenha o comprimento da linha desenhada ( "início Duração").
- Repetir esta medição para o mesmo embrião no final de alongamento precoce (momento quando os músculos começar a contrair-). Registar o tempo ( "time-end") e medir o comprimento do embrião ( "Corpo-end"), conforme descrito acima (Figura 2B).
- Calcula-se a duração (D) do alongamento inicial e o aumento de comprimento (L) durante esta fase da seguinte forma:
D = "Time-end" - "Time-começo"
& #160; L = "Comprimento-end" - "Comprimento-começo" - Para medir a largura da cabeça, ajustar a barra de escala de tempo para ter um embrião em fase de interesse (fase de 1,2 vezes, ou no final de alongamento precoce). Escolha a ferramenta de linha reta. Desenhe a linha média transversal (eixo dorso-ventral) da cabeça. Esta seção é a parte mais espessa do embrião (Figura 2C). Usando o menu Analisar / Medir, obtenha o comprimento da linha correspondente à largura da cabeça.
- Ao mesmo ponto de tempo, repetir este passo a tiragem da linha média transversal da cauda (linha média entre a válvula intestinal e a ponta da cauda; Figura 2C) e medi-la para se obter a largura da cauda.
NOTA: Use esta medida para comparar embriões no mesmo estágio em diferentes fenótipos. Para garantir a reprodutibilidade da medição, certifique-se de encontrar um local situado em torno do mid-line da cauda do animal que pode ser facilmente reconhecido de um animal para umnão ela. - Para calcular a cabeça para largura cauda, dividir a largura da cabeça pela largura da cauda.
2. Caracterização de Defeitos Alongamento tarde Utilizando Análise de Imagem
- Sincronização de L1 Larvas usando Alkaline Hipoclorito Tratamento
- A partir de uma placa mm não esfomeados 60 contendo muitos adultos grávidos, recolher todos os vermes em um tubo de micro-centrifugação de lavagem dos nemátodos fora da placa com 1 ml de tampão M9 usando uma pipeta de Pasteur.
- nemátodos de sedimentos, a 3500 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante utilizando uma micropipeta, sem perturbar o sedimento sem-fim.
- Adicionar 1 ml de solução de hipoclorito de cada tubo (0,4 M de hipoclorito, NaOH a 0,5 M) e agitar durante 3 min.
NOTA: solução de hipoclorito alcalino deve ser preparada e embriões nesta solução deve ser agitada suavemente, mas de forma contínua para otimizar a dissolução dos adultos e oxigenação do embryos. Após 3 minutos de agitação, a maioria dos adultos devem libertar os seus ovos na solução. - Girar a 3500 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e remover rapidamente o sobrenadante utilizando uma micropipeta, sem perturbar o sedimento.
- Lavar quatro vezes com 1 ml de tampão M9 seguido de centrifugação a 3500 xg durante 3 min.
- Após a quarta lavagem, remover os ovos de sobrenadante e ressuspender em 700 ul de tampão M9 sem pipetando-se os ovos (como os ovos furaria ao plástico da ponta).
- Tape o tubo num agitador orbital de 3 mm colocado em uma incubadora à temperatura de crescimento apropriado e agitar a 600 rpm durante a noite.
- Comprimento Medição da Synchronized Larvas
- Centrifugar preso larvas L1 a 3500 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. Ressuspender as larvas em 100 ul de tampão M9 e transferi-los para uma almofada de agarose utilizando uma pipeta de Pasteur (almofadas de agarose deve ser preparard conforme descrito no ponto 1.1.2 a 1.1.8). Coloque uma lamela sobre a almofada.
NOTA: O bloco não necessita de ser selado com goma para esta experiência que envolve curto aquisição. - Utilize uma objectiva de contraste de fase e iluminação 10X para medir o comprimento das larvas se uma câmara de alta resolução é usado. Aumentar a intensidade da luz deve ser capaz de capturar imagens dentro de alguns milésimos de segundo e, consequentemente, obter uma imagem clara das larvas (Figura 2D).
NOTA: Enquanto os trashes de natação de larvas são reduzidos pela almofada de agarose, eles ainda estão se movendo. Portanto, a gravação rápida é essencial para obter uma imagem clara. - Abra Fiji-ImageJ e repita o passo 1.3.1. Para medir o comprimento de larvas, escolha a ferramenta de linha segmentada. Desenhar uma linha segmentada a partir da ponta da cabeça até à ponta da cauda seguindo a linha média das larvas (Figura 2D, painel da direita).
- Usando o menu Analisar / Medida, obtenha o comprimento doA linha desenhada correspondente ao comprimento das larvas em micrómetros.
- Centrifugar preso larvas L1 a 3500 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. Ressuspender as larvas em 100 ul de tampão M9 e transferi-los para uma almofada de agarose utilizando uma pipeta de Pasteur (almofadas de agarose deve ser preparard conforme descrito no ponto 1.1.2 a 1.1.8). Coloque uma lamela sobre a almofada.
3. Caracterização de Defeitos Alongamento tardia utilizando citometria de fluxo
- sincronizar Larvas
- Purificar embriões que utilizam o tratamento Hipoclorito de Sódio, conforme descrito no ponto 2.1 do total de 100 placas mm de bem alimentados adultos jovens e deixar a escotilha embrião e a prisão L1 em tampão M9 de 16 a 24 horas a 20 ou 25,5 ° C, dependendo da estirpe analisados.
NOTA: Uma placa cheia de adultos bem alimentados por estirpe é suficiente para a análise descrito abaixo.
- Purificar embriões que utilizam o tratamento Hipoclorito de Sódio, conforme descrito no ponto 2.1 do total de 100 placas mm de bem alimentados adultos jovens e deixar a escotilha embrião e a prisão L1 em tampão M9 de 16 a 24 horas a 20 ou 25,5 ° C, dependendo da estirpe analisados.
- A calibração do Sorter Worm
NOTA: O citômetro de fluxo usado aqui é um fluxo grande de partículas citômetro (doravante referido como o classificador de verme). O classificador inclui um sem-fim 670 nm do laser de diodo vermelho, que está localizado em frente de um detector de extinção. O classificador de worm também contém um multi-linha laser de argônio para a excitação fluorescente. os standard instrumentos tem três detectores de tubos fotomultiplicadores (PMT) fluorescência usado para detectar emissões de fluorescência nas regiões verdes, amarelos e vermelhos do espectro. No protocolo aqui descrito, TOF vai ser utilizado para medir o tamanho das larvas, o canal vermelho será usado para identificar lagartas mortas que serão corados com iodeto de propídio (PI). GP (General Purpose) alta fluorescência de Controle partículas utilizadas para calibrar o instrumento e como um controlo interno em nosso experimento exibir alta fluorescência em verde, amarelo e vermelho. Eles serão os únicos objetos na amostra analisada com alta emissão detectada no canal verde e serão posteriormente identificados com base em esta característica.
NOTA: Living animais são identificados com base na ausência de fluorescência no canal verde e vermelho, bem como sobre a TOF. autofluorescente emissão a partir do intestino das larvas não é detectável na fase L1.- Ligar o bloco de laser, o computador, a um compressord o instrumento verme classificador. Pressione o botão START sobre o software classificador de minhoca aberto como indicado no manual de instruções do instrumento.
- Observe a janela pop-up do controle laser de argônio. Selecione o modo RUN e esperar que as potências de laser chegar a 10 ± 1 mW. Selecione FEITO na janela de controle de laser.
- Defina a bainha e as pressões de amostra para 5,10 ± 0,02 e 5,51 ± 0,01, respectivamente. Permitir que a pressão a equilibrar durante pelo menos 15 minutos e clique na caixa de verificação de pressão OK.
NOTA: O caudal depende da bainha e as pressões de amostra. - Certifique-se para eliminar todas as bolhas presentes nos túbulos de canais de escoamento entre o copo de amostra e da câmara de análise. Para fazer isso, clique em adquirir e suavemente dê pequenos toques túbulo até que nenhuma bolha são adquiridas (como visto na janela de aquisição).
- Configuração de todos os parâmetros de medição e detecção da seguinte forma fluorescente e TOF:
- Definir as escalas para TOF, Ext, Verde, Amarelo e Vermelho para256. Set ganho como descrito na Tabela 1. Set PMT Controle em 700 para o verde e amarelo e 900 para o vermelho.
NOTA: Dois filtros de excitação estão disponíveis (488 nm e 514 nm) e pode ser utilizado para excitar, quer a proteína verde fluorescente (GFP) ou a proteína fluorescente amarela (YFP), ou quaisquer fluorocromos excitada a estes comprimentos de onda com o laser de árgon de várias linhas. filtros apropriados necessitam de ser inserido na câmara de filtro do equipamento. Utilizou-se o filtro de 488 nm para a experiência seguinte.
- Definir as escalas para TOF, Ext, Verde, Amarelo e Vermelho para256. Set ganho como descrito na Tabela 1. Set PMT Controle em 700 para o verde e amarelo e 900 para o vermelho.
- Para calibrar o classificador de sem-fim, selecione "partículas de controle Executar" no menu de ferramentas. Coloque 20 ml de 1x GP (General Purpose) alta fluorescência de Controle de Partículas no copo (estas partículas são partículas fluorescentes de tamanho preciso, vendidos pelo fabricante citometria de calibrar seu instrumento).
- Clique no botão AQUISIÇÃO para começar a bainha e o fluxo da amostra.
NOTA: Espere uma média relacionada com a distribuição de controle de partículas de 21 ± 6 e acoefficient de variação em torno dessa média (CV) ≤11. Se o CV é> 11 ea média é> 27 tente limpar os túbulos clicando várias vezes no botão limpa ou sacudindo o canal de fluxo.
- Aquisição de TOF animal
NOTA: A luz dispersa quando um objecto passa na célula de fluxo entre a fonte de laser e o detector de extinção. O tempo que leva para que a luz seja dispersa por um objecto (tempo de voo, TOF) é usado para medir o comprimento axial do objecto. A extensão da luz mascarado pelo objeto (extinção, EXT) é utilizada como uma medida da sua opacidade densidade / óptico.- Coloque 10 ml de sincronizada do tipo selvagem (wt) L1 em um vidro de relógio e estimar a percentagem de mortos-ovos usando um microscópio de dissecação.
NOTA: sincronizado L1 exibindo alta Emb (superior a 20%) em peso não deve ser usado para posterior análise. - Transferência sincronizada de L1 a partir da microcentrífuga (umproximadamente 700 ul de M9 contendo L1) para um tubo de 15 ml. Adicionou-se iodeto de propídio (PI) a uma concentração final de 10 ug / ml (diluição 1/100 de uma solução mãe de 1 mg / ml) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
NOTA: Os ovos e as larvas mortos serão coradas utilizando PI e detectado como objetos altamente fluorescentes utilizando o canal vermelho. - Adicionar 10 ml de tampão M9 para diluir populações coradas. Tomar 5 ml de as populações diluído e diluí-los quatro vezes por adição de 15 ml de M9. Coloque esta diluição no copo de amostra.
- Execute o fluxo de amostra por ACQUIRE clicando e observar a taxa de fluxo.
NOTA: Para se ter uma medição precisa, o caudal deve ficar entre 15 e 25 objetos / seg. - Se necessário, ajustar a quantidade de animais no copo para atingir a vazão desejada.
NOTA: A vontade caudal depende das pressões (bainha e da amostra) que são constantes como indicado em 3.2.3 e na concentração de larvas in copo. Se a taxa de fluxo é maior do que 25 objetos / sec adicionar algum tampão no copo. Se for menor do que 15 objetos / sec Adicionar L1 concentrado (a partir do passo 3.3.3) no copo. - Uma vez que a concentração adequada de objeto for atingido, avaliar o volume no copo e adicione 1/4 th deste volume em solução alta fluorescente GP Controle de Partículas 4x.
- Ajuste o parâmetro gating e classificação. Para fazer isso, clique em "gating" no menu e selecione 'vs. TOF' e "verde". Clique em "Triagem" no menu e selecione 'TOF vs.' e 'Red'. Gating e classificação de gráficos irá aparecer como mostrado na Figura 3A.
NOTA: Isto irá permitir a visualização das partículas de controle (emissão em verde e vermelho), animais mortos corados pelo PI e bolhas (emissão em vermelho e não Verde) e animais vivos (sem emissão em canais nem verdes, nem vermelhas) (Figura 3A ). - Executar o experimento clicando ACQÙire.
NOTA: Para identificar as diferenças pequenas entre larvas, analisar cerca de 10.000 objetos, para que cerca de 8.000 animais. Interromper a experiência e exportar os dados como formato .txt, clicando no STORE.
- Coloque 10 ml de sincronizada do tipo selvagem (wt) L1 em um vidro de relógio e estimar a percentagem de mortos-ovos usando um microscópio de dissecação.
- Medição do tamanho de vida relativo Animals in Sincronizadas Populações
- Abra o arquivo .txt usando um software capaz de gerenciar grandes tabelas de dados.
- A partir dos objectos analisados extrair os valores TOF associados com partículas de controlo que são caracterizados pela emissão no canal verde mais elevado do que 100 unidades arbitrárias (este valor depende dos parâmetros definidos na secção 3.2.5). Criar uma nova coluna e chamá-lo "partículas de controle '. Criar uma coluna que contém todos os outros objetos, exceto as partículas de controle chamado "amostra". NOTA: a emissão de fluorescência de novas necessidades de lote de partículas a serem verificados antes de iniciar as aquisições. Isto irá definir o limite fluorescente que permite a identificação departículas de controlo de mais de L1.
- Para cada cepa analisada identificar a parte da experiência, em que a taxa de fluxo foi alterada (devido à presença de um tampão de ovos, por exemplo). Para fazer isso:
- Traçar a TOF de "partículas de controle 'para cada amostra como um fator de tempo (Figura 3B).
- Desenhe a linha de tendência linear utilizando a ferramenta de linha de tendência e exibir a equação no gráfico.
NOTA: O TOF de partículas de controle deve ser constante ao longo do tempo (linha horizontal, Figura 3B). Considerando-se a equação da linha de tendência linear desenhado na dados y = ax + b, garantir que o 'a' valor é menor que 10 -4. Todas as medições feitas nas secções de tempo que indica uma ruptura no alinhamento das partículas de controlo deve ser removido a partir da análise.
- Remover os embriões mortos e as bolhas de emissão (maior do que 15 no vermelho), bem como de pequenos detritos grandes e tampões de ovo (TOF inferior a 10 e de altaer de 70 respectivamente) a partir da medição 'sample'.
- Traçar a distribuição de 'partículas de controle' para cada cepa analisada. Como pode ser visto na Figura 3C estas distribuições devem sobrepor quase perfeitamente. Isso garante que as medições TOF obtidos para diferentes estirpes podem ser comparados. NOTA: normalização de elementos de amostras de TOF sobre partículas de controlo pode ser usado se as distribuições de partículas de controlo de uma amostra de não sobreposição com a de amostras de controlo. TOF normalizada são calculados como se segue:
- Normalizar TOF para o genótipo G = (TOF amostra para G) / ( 'partícula de controle' TOF média para G) x (média 'partícula de controle' TOF de peso), onde peso é a amostra de controlo.
- Traçar distribuição Larvas TOF para cada estirpe incluindo amostra de controlo, no nosso caso em peso animais (Figura 3D). Medir a média e o erro padrão da média (SEM) para cada população (
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Representative Results
Cabeça-, Cauda e Rácio de cabeça / cauda de largura são métricas robusto.
Os protocolos aqui descritos têm sido utilizados com sucesso para caracterizar a função dos reguladores e dos efectores de Rho GTPases pix-1, Pak-1 e deixou-502 durante o alongamento precoce 7. Pix-1 e Pak-1 de código, respectivamente, para um factor de permuta de guanina (GEF) e um efetor específico para Rac / Cdc42 GTPases e deixá-502 códigos para um efetor para RHO-1 7. Neste estudo, pix-1 e Pak-1 foram mostrados para controlar a morfogénese epidérmica durante o alongamento precoce 7. Esta medição cabeça e cauda largura estudo utilizou como métricas demonstram, pela primeira vez, que as células hipodérmicas localizados no EMB anteriorryo seguem diferentes programas morfogênicos do que aqueles localizados em sua posterior 7. Para estabelecer a reprodutibilidade ea robustez dessas métricas, largura da cabeça foi medida de forma independente cinco vezes em 12 embriões de tipo selvagem (wt) no estágio 1,2 vezes. Variações entre os cinco grupos diferentes de medição foram comparados então avaliada utilizando o teste de Brown-Forsythe (usando pacote estatístico R) revelando não haver diferenças significativas entre as medições (F- p-valor de teste> 0,5; Figura 4A), sugerindo que as medições para um grupo de embriões são reprodutíveis. Avaliação dos efeitos de reprodutibilidade e de lote associados a estas medidas foi feito através da medição da largura da cabeça de embriões em peso na fase de 1,2 vezes a partir de imagens 4D-DIC feito em três dias diferentes (n = 12 embriões). Entre os três grupos de medição, a variação não foi significativamente diferente e sem efeitos significativos lotes foram encontrados para impactar o cabeça-wresultados IDþ medição (F-test valor de p> 0,5; Figura 4B).
Resultados semelhantes foram obtidos para medições de largura e cauda para medições feitas em diferentes estágios do alongamento precoce (dados não mostrados). Estes dados estabelecida cabeça de largura, cauda de largura e de cabeça / largura cauda como métricas sólidas para caracterizar defeitos alongamento início.
Medindo Cabeça e largura da cauda, bem como comprimento dos embriões Permite a Caracterização de genes que controlam Alongamento precoce ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.
A medição do comprimento dos embriões, assim como a largura da sua cabeça e a cauda foi realizado em embriões WT e mutantes portadoras nulo ou termossensível forte perda de alelos funcionais de genes que controlam o início de alongamento: pix-1 (gk416);Pak-1 (ok448) e deixe-502 (sb118ts) 7. Medimos a cabeça / cauda (H / T) relação entre a largura de embriões WT e mutantes no início (fase de 1,2 vezes) e no final do alongamento cedo a temperaturas não permissivas (Figura 4C para a esquerda e o painel direito, respectivamente). Embora no início do alongamento inicial houve nenhuma change- ou uma reduzida H / rácio T foi observado em pix-1, 1-Pak e deixou-502 mutantes quando comparado com animais WT (estádio 1.2 vezes, Figura 2C, painel esquerdo ), no final de alongamento cedo todos os três mutantes mostraram uma proporção significativamente mais elevada H / T de embriões wt (teste t P -Valores <0,006; Figura 4C; painel da direita). Isto demonstrou que pix-1, 1-Pak e deixam-502 embriões mutantes exibem morfologia anormal ântero-posterior no final do alongamento inicial. Outras análises comparando a largura da cabeça e cauda largura betweeN estágio 1,2 vezes, e o final do alongamento inicial, utilizando os mesmos parâmetros de medição revelou que a largura da cabeça é menos reduzido em pix-1, Pak-1 e deixou-502 mutantes, enquanto a largura da cauda reduz significativamente menos em mutantes let-502 apenas 7. Isto revelou que deixe-502 controles da morfogênese semelhante ao longo do eixo antero-posterior do embrião, enquanto pix-1 e pak-1 controle da morfogênese ocorrendo principalmente na parte anterior do embrião 7. A diferença de comprimento entre os embriões no final versus o início do alongamento precoce (Figura 4D) também foi medida. Descobrimos que o alongamento inicial foi significativamente reduzida em pix-1, 1-Pak e deixou-502 mutantes em peso quando comparado com o que sugere que a alteração da morfogénese anterior em pix-1 e mutantes Pak-1 por si só é suficiente para reduzir significativamente a elongatioN do embrião.
Protocolo 2 e 3 foram utilizados para avaliar o comprimento das larvas de fundos detidos em WT e mutantes. O comprimento dessas larvas foi avaliada usando tanto de análise de imagem (Protocolo 2) 7 e citometria de fluxo (protocolo nº 3; dados não publicados). Medidas de comprimento larvas usando análise de imagem resulta em medidas absolutas de comprimento dos animais em micrômetros de uma maneira (Figura 5A) robusto e altamente reprodutível. Esta análise revelou que sincronizado visor larvas mutante reduziram significativamente comprimento quando comparado ao peso (Figura 5A) 7. A medição destes larvas usando o protocolo baseado em citometria de fluxo (Protocolo 3) deram origem a resultados comparáveis (Figura 5B). No entanto, deve notar-se que o grande número de larvas medido usando a última abordagem aumentou significativamente a robustez estatística da comparação genótipo (t - teste p -Valores <10 -24). Com base nestes resultados, a abordagem citometria de fluxo pode ser uma escolha melhor sobre análise de imagem para caracterizar animais mutantes que apresentam defeitos de alongamento muito subtis.
Figura 1. Preparação de um Agarose Pad. Um, Microscópio deslizante colocado entre dois espaçadores-lâminas cobertas por duas camadas de fita adesiva. B, A almofada de agarose é coberta com uma outra corrediça suportada pelos dois espaçadores-lâminas. C, a forma e o tamanho finais do bloco de agarose após o corte com uma lâmina de barbear para caber a lamela. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
g2.jpg "/>
. Figura 2. Medição de precoce e Defeitos Elongação tardias A - B, A medição do comprimento de um embrião em fase de vírgula (A) e no final de alongamento precoce (B). A linha vermelha, utilizado para medir os embriões foi desenhada utilizando a ferramenta de linha segmentada da ImageJ. C, cabeça e cauda largura são medidos em embriões na fase de 1,2 vezes (esquerda) e no final de alongamento precoce (à direita). As setas representam a localização das zonas de medição (modificado de Martin et al., 2014). Barra de escala:. 20 mm D, comprimento de larvas é medido para L1-larvas sincronizados. painel da direita, uma vista ampliada da imagem capturada (esquerda). A linha vermelha foi tirado usando a ferramenta de linha segmentada de ImageJ. Ele é usado para medir o comprimento da larva. Barra de escala:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A medição do comprimento do Synchronized Larvas Usando citometria de fluxo. A, Gating e triagem janela de COPAS Biosort mostrando Verde e emissão de partículas Red controle, bolhas, mortos e animais vivos em relação ao seu tempo-Of-Flight (TOF ). B, TOF de partículas de controle em diferentes pontos de tempo para uma experiência representativa. A inclinação da função linear da TOF em função do tempo é de cerca de 10 -5, indicando que TOF de partículas de controle é constante ao longo do tempo durante todo o experimento. C, Distribuição de TOFS partículas de controlo expressas como percentagem do valor máximo de distribuições. Distribuições de controle de partículas não normalizados e normalizados são representados por pak-1 (ok448). Outras distribuições não são normalizadas. D, distribuição de TOFS para a vidaanimais expressa como uma percentagem do valor máximo das distribuições. TOFS não são normalizadas em partículas de controle, exceto para pak-1 (ok448), como indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Pix-1, Pak-1 e deixe-502 Mutantes atuais Defeitos precoce de alongamento. A - B, Reprodutibilidade e robustez avaliação da largura da cabeça medições A, cinco medições independentes da largura da cabeça para os embriões em peso na fase de 1,2 vezes (n = 12 embriões).. Médias e desvios padrão (barras de erro) são indicadas. Não significativas (ns) diferenças entre as medidas foram calculados utilizando o teste de Brown-Forsythe (uspacote estatístico ING R) (F-teste Valor de p> 0,5). B, medida de largura Cabeça para embriões wt em três dias diferentes (n = 12 embriões). As médias e desvios-padrão são indicadas bem; não houve diferença significativa na variância entre as medições (ns; Brown-Forsythe F-teste valor de p> 0,5) C, as distribuições de cabeça relação largura / cauda na fase de 1,2 vezes (painel esquerdo), na extremidade de início. alongamento (painel da direita) em peso, let-502 mutantes (sb118ts) a 23 pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) e - 24 ° C. Note-se que as mães de embriões permitem-502ts utilizados para este estudo foram crescidas a 25,5 ° C. D, Distribuição do alongamento em peso, pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) e deixou-502 (sb118ts) mutantes entre estágio vírgula e o início da tarde de alongamento. A caixa-parcelas representam a min, max, 25 th, 50 th (mediana) e 75percentis das populações. * T -test valor de p <0,05, ** t -test valor de p <0,006 (modificado de Martin et al., 2014). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) e L et-502 (sb118ts) Larvas Defeitos Presente comprimento. A, Corpo de larvas medido em peso, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) e deixe-502 (sb118ts) animais medido utilizando análise de imagem (Protocolo 2). B, comprimento larvas Relativa medido utilizando fluxo citómetro ( Protocol 3). Os números entre parênteses correspondem ao número de animais utilizados para the medições. Meios de comprimentos e erro padrão da média (SEM; barras de erro) são representados. T de Student -test valores p são indicados (p). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve novas métricas para caracterizar início e fases tardias de alongamento embrionário.
Na seção 1, o passo crítico é a potencial presença de bactérias no teclado. Os embriões são hermeticamente fechado entre a almofada e a lamela durante a aquisição de imagem. Selagem a lâmina é necessário para evitar a dessecação dos animais durante a aquisição que dura mais do que duas horas. Para nosso conhecimento, nenhum dos cimentos usados para montar almofadas de agarose entre lâmina e lamela são permeáveis ao ar. Por conseguinte, quando uma grande quantidade de bactérias (ou embriões) está presente no teclado, que podem ser privados de oxigénio depois de algumas horas levando a sua morte prematura. Tendo em embriões de três vezes - o que corresponde a embriões que são 3 vezes em comprimento em comparação com embriões não alongados - gravadas juntamente com os embriões de interesse vai ser um bom indicador de potenciais condições de hipóxia, uma vez que os embriões vai parar de se mover em theicascas de ovo r na ausência de oxigénio. Não há medidas morfológicas deve ser feita em condições de hipóxia ou em embriões mortos.
Um outro passo crucial quando se utiliza imagiologia de lapso de tempo é a temperatura à qual o desenvolvimento do embrião ocorre. Mutantes termossensíveis são actualmente utilizados em C. elegans. O efeito biológico de mudança de temperatura pode ser imediata ou retardada dependendo da meia-vida da proteína e a natureza da mutação a carrega. Consequentemente, a temperatura à qual o embrião é exposta deve ser constante ao longo do tempo e devem ser controlados por meio de ventilação apropriada da sala de microscopia ou uma câmara de aquecimento-arrefecimento na platina do microscópio.
Seção 2 é dependente de sincronização larvas usando tratamento Hipoclorito de Sódio. Sob certas circunstâncias, este tratamento pode conduzir a letalidade embrionária (Emb). Emb acima de 20% da população em peso sugere uma toxicidade elevada durante deleite hipocloritomento que podem impactar negativamente a morfogênese. L1 sincronizado exibindo alta Emb em peso fundo não deve ser usado para posterior análise. Esta restrição também se aplica ao protocolo 3.
Nós não recomendamos o uso de drogas anestésicas para imobilizá-larvas. Levamisol em particular, imobiliza o nematóide através da indução de tetania muscular que tende a diminuir as larvas introdução de viés experimental. Se o tempo de exposição não é suficientemente rápido, como resultado das limitações do microscópio, recomendamos a redução da motilidade das larvas, aumentando a concentração da agarose na almofada e reduzindo a quantidade de líquido entre a almofada e a lamela. Deve ser tomado cuidado no entanto, não para desidratar as larvas, uma vez que a dessecação irá reduzir o seu tamanho.
Na seção 3, a medição do comprimento das larvas usado comparação das taxas de fluxo entre as amostras analisadas. Para fazer isso, a distribuição de partículas de controlo necessita de ser compavermelho. Se as distribuições totalmente sobrepostas, o TOF (tempo-de-voo) valores obtidos para as amostras correspondentes podem ser comparadas, se não, estes valores necessitam de ser normalizadas. A normalização da amostra-TOF-TOF sobre partículas de controlo (conforme detalhado no 3.4.5.1) tem sido usada com sucesso como mostrado para Pak-1 (ok448) (Figura 3C e Figura 5B). Comprimento relativo de 1-Pak (ok448) vs em peso mostrou ser semelhante em pelo menos 3 experiências independentes, com ou sem normalização (dados não mostrados). No entanto, recomendamos, confirmando os resultados obtidos com a normalização com os obtidos sem ele, especialmente quando se comparam as larvas com diferenças pequenas. Deve notar-se que a medição do comprimento de larvas usando citometria de fluxo fornece um comprimento relativamente a uma amostra de controlo, neste caso, em peso larvas em vez de um comprimento absoluto, em micrómetros como por análise de imagem. Isto implica que as medições de experimentos independentes não podeser combinada a menos de computação proporção de tamanho ao longo do peso.
O tampão utilizado para a diluição no copo de amostra terá um impacto sobre a taxa de fluxo. Observou-se que a bainha de tampão recomendado pelo fabricante contém detergente que aumenta a quantidade de bolhas geradas durante a aquisição. Usando tampão M9, que não contêm detergente, reduziu significativamente a formação de bolhas, mas foi menos eficaz em evitar o entupimento dos ovos nos túbulos do classificador, que afecta a taxa de fluxo de amostras. entupimento do ovo é facilmente detectado durante a aquisição, por uma diminuição acentuada da TOF observável de partículas de controlo durante alguns segundos, seguido por um TOF- também elevada durante alguns segundos. entupimento do ovo também pode levar à obstrução do canal e a paragem completa do fluxo de partículas (menos que 5 objetos por segundo). Se isso ocorrer, clique no botão limpa até caudal é restaurado. Quaisquer medidas que ocorrem durante estes eventoss devem ser excluídos da análise de dados. tampão bainha pode ser recomendada para experimentos envolvendo cepas caracterizadas por altas taxas de ovos mortos.
A pressão da amostra e a bainha (definido no passo 3.2.3), podem mudar (ligeiramente) e ao longo do tempo deve ser ajustado manualmente ao longo da experiência de forma a assegurar uma taxa de fluxo muito constante. Redução ou aumento da taxa baixa será observável na análise dos resultados e traçando as TOFS de partículas de controle ao longo do tempo (Figura 3C). A redução da taxa de fluxo resultará no aumento dos TOFS médios de partículas ao longo do tempo, enquanto que um aumento da taxa de fluxo resultará na frente. A alteração da taxa de fluxo irá impactar negativamente a sensibilidade do método para detecção de diferenças de tamanho entre pequenas populações de larvas.
Métodos com o objetivo de identificar os genes que controlam o alongamento e que requerem gravação microscopia de lapso de tempo são geralmente elevadosly demorado e tedioso quando fenotipagem vários genótipos. A abordagem baseada em fluxo citómetro, enquanto exigindo que os equipamentos não estão disponíveis para todos os laboratórios, é menos demorado e, consequentemente, mais eficiente quando várias estirpes precisam ser caracterizados. Este método também é mais estatisticamente robusta em comparação com medições usando análise de imagem (avaliada pelo teste t de Student comparando distribuições mutantes e peso TOF; Figura 5A e B). Este método pode então ser altamente adequado para as estirpes que expressam defeitos de alongamento com baixa expressividade / penetrância.
Vários métodos usando citometria de fluxo foram desenvolvidos no passado para medir a aptidão de nemátodos 9-12. Estes métodos utilizam animais dispensada numa placas de 96 poços e o módulo de reflexo do classificador de sem-fim ". O módulo Reflex permite a análise directa da população de nemátodos dispensado dentro de placas de 96 poços. Por conseguinte, estes métodos são capazes de characteRize centenas de condições por dia e constituem uma forma robusta em que para medir a aptidão de uma população não-sincronizado. Eles são no entanto, não é bem adequado para identificar diferenças de tamanho pequeno entre L1 sincronizado. Medição de pequenas diferenças entre as larvas L1 requer a medição através de um grande número de animais, o que é incompatível com a utilização de placas de 96 poços e o módulo de reflexo que podem caracterizar eficientemente objectos 100, no máximo, por poço. O método aqui descrito foi concebido para o efeito, à custa do débito, que é significativamente reduzida. Ele permite a caracterização de 3 a 4 condições por hora uma vez que o instrumento é calibrado, o que é uma melhoria significativa sobre o uso de análise de imagem no protocolo 2.
Medição da relação de cabeça e cauda largura é o primeiro método que foi desenvolvido para caracterizar processos morfogénicas que ocorrem de forma desigual ao longo do eixo ântero-posterior do embrião 7. Quandoaplicado aos genes mostrados para controlar o alongamento inicial, estes métodos irá clarificar a distribuição espacial das vias de sinalização que controlam a morfogénese nessa fase. Medição do comprimento de larvas preso usando análise de imagem ou citometria de fluxo em combinação com a medição do comprimento dos embriões no final de alongamento cedo irá permitir a identificação de genes que controlam tanto o alongamento cedo ou mais tarde, ou ambos, com elevada sensibilidade e precisão. Esses procedimentos podem, então, contribuir significativamente para a futura compreensão da regulação espacial e temporal das vias de sinalização que controlam o alongamento embrionário em C. elegans. Além disso, estas abordagens pode também ser adaptado para estudar vias de sinalização que controlam o comprimento do corpo, tais como a insulina e a TGF-beta vias 13, 14 e crónica exposição aos contaminantes ambientais 15, 16. Estas medições podem ser feitas em diferentes estágios larvais ou em adultos using menores variações de protocolos 2 e diferenças de tamanho 3. Medição de L1 é mais exigente com o classificador de verme que objetos maiores, como L3, L4 larvas ou adultos. Protocolo n.º 3 pode então ser facilmente adaptado para fazer essas medições.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
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