Introduction
짧은 라이프 사이클 : 거의 50 년 동안 선충 예쁜 꼬마 선충 개발, 신경 생물학, 진화, 호스트 병원체 상호 작용 등의 중요한 문제를 연구하는 강력한 모델로 자리 매김 한 개발의 연구에서이 모델의 강도에 달려있다 삼일의; 이러한 동물은 유전자 조작 될 수있는 용이성; 대부분 여분의 자궁이다 살아있는 동물과 개발에 세포 변위 및 형태의 관찰을 가능하게 투명성. 선충의 발달 단계는 성인이 다음에 배아 네 애벌레 단계 (L4에 L1)를 포함한다. 배아 발생 동안, 표피 형태 형성 세포는 그들의 접합부를 재구성하는 방법을 그룹으로 마이그레이션 방법 상피의 더 나은 이해를 가능하게하고 개별적인 형태뿐만 아니라 기능적 상피 세포 내에서의 상대 위치를 수정하는 능력에 상당한 관심을 끌었다.표피의 형태 형성은 네 단계로 구분됩니다 지느러미 표피 세포의 구조 조정에 구성된 지느러미 인터에서, 하피라고 함; 따라서 상피 세포 단층의 배아를 감싸는 복부 정중선으로 복부 피하 세포의 이동에 구성된 복부 인클로저; 초기와 후기 신장 벌레 모양의 유충에 콩 모양의 배아를 변환. 다음과 같은 형태 형성, 배아 해치 및 L1 유충은 즉시 환경에서 사용 가능한 박테리아를 사용하여 먹이를 시작합니다.
배아 신장 따라서 배아 발달의 후기이다. 그것은 그것의 길이 방향 축을 따라 배아의 확장과 가로 직경의 감소로 구성되어 있습니다. 이것은 피하 세포의 형상 급격한 변형을 포함한다. 신장은 초기와 후기로 나누어진다. 몸 벽 근육이 w의 1.75 배 단계에서 계약 시작할 때 초기 단계는 쉼표 단계에서 시작 및 종료ILD 형 (중량) 배아 - 비 신장 배아에 비해 길이의 1.75 배입니다 배아에 대응. 그 단계에서 발생하는 형태 형성 공정은 주로 두 배의 안테 - 후방 축에 그들의 연장 운전 피하 세포의 꼭대기에 위치한 극 액틴 필라멘트 다발 FBS ()의 수축에 의해 구동된다. 이물 제거의 수축 세 키나제 LET-502 / ROCK, MRCK-1, PAK-1 (5)에 의해 미오신 라이트 체인의 인산화에 의해 컨트롤입니다. 몸 벽 근육의 기능이되어 계약을 시작할 때 신장의 후기가 시작됩니다. 그것은 지느러미와 복부 피하 세포에 몸 벽 근육에서 mechanotransduction 신호를 포함하고 동물 3 부화 할 때 끝납니다.
및 L1 유충 (애벌레 체포 표현형으로 그 체포 그들의 개발, 신장 결함은 일반적으로 배아로 죽어가는 동물의 비율 (EMB 배아 치사)을 특징으로 레벨a) 및 중량보다 훨씬 짧은 것을. 발달 체포의 단계의 확인은 죽은 태아의 현미경 관찰을 필요로하고 유충 3-6을 체포했다.
그것은 최근에 같은 Cdc42 / 라 세미 레귤레이터 및 이펙터 PIX-1과 박-1, 여러 유전자가, 초기와 후기 신장 3,7 둘 중에 형태 형성 과정을 제어하는 것으로 나타났다. 우리는 또한 최근에 형태 형성 과정 초기 신장 3 ~ 7시 배아의 안테 - 후방 축을 따라 차이가 있음을 보여 주었다. 이러한 연구 결과는 특히 초기 신장 동안 자신의 안테 - 후방 축을 따라 배아의 형태의 특성을 가능하게 일찍 또는 늦게 신장 단계 및 기타 측정을 대상으로 새로운 지표의 개발 동기를 부여.
이러한 새로운 방법은 폭뿐만 아니라 처음부터 초기 신장 끝에 배아의 길이를 측정하는 구성 그광고 및 꼬리. 7 두 프로토콜은 또한 L1 단계 7에서 동기화 새로 부화 유충의 길이를 측정하기 위해 개발되었다.
유충, 성인 및 배양액에 존재하는 세균이 처리에 의해 용해되는 동안 배아 달걀 껍질 알칼리 처리 염소산으로부터 보호. 이러한 처리 후, 잘 공급 성인 (8)의 대부분을 함유하는 비 - 동기화 집단으로부터 배아를 정화하는데 사용된다. 식품 제한은 새로 부화 유충을 동기화하는 데 사용됩니다. 이들 유충의 길이를 측정하는 것은 다음 신장 결함을 검출하기 위해 사용된다. 에서 부화 유충이 아닌 완전히 신장 배아가 공급 될 때 "정상 길이"로 복구 할 수 있지만, 음식이없는 구속 할 때 자신의 소형화를 유지하기 때문에이 측정은 배양 플레이트에 구속 유충의 측정보다 선호된다.
여기서는 르의 측정을 가능 상세한 프로토콜을 제시경과 DIC 현미경과 화상 해석 (1 프로토콜)을 사용하여 배아뿐만 아니라 헤드의 폭과 신장의 꼬리 ngth. 또한 화상 해석 (프로토콜 2) 플로우 세포 계측법 (3 프로토콜)을 사용하여 동기화 된 유충의 길이를 측정하기위한 구체적인 프로토콜을 제공한다.
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Protocol
WT 및 돌연변이 동물의 초기 신장 결함 1. 특성
- Normarski DIC 현미경에 대한 설치 배아
- 다음 문화 매체와 재료를 준비합니다 :
- M9 버퍼, 용해 12.8 g / L 나 2 HPO 4 • 7H 2 O 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L의 NaCl, 0.25 g / L 황산 증류수와 소독하는 오토 클레이브에서 4 • 7H 2 O.
- NGM 판, DDH 2 O 3 g / L의 NaCl 16 g / L의 한천, 2.5 g / L의 bactopeptone을 용해 압력솥과 1 mM의 황산, 1 mM의 염화칼슘 2, 1 mM의 인산 완충액 5 μg의 / ㎖ 콜레스테롤을 추가합니다. 60mm 요리 당 NGM 6 ml에 따르십시오. 매체가 실온에서 24 시간 동안 응고하도록 허용합니다. E.의 포화 문화의 몇 방울을 추가 대장균 OP50 박테리아는 루리아의 국물 (LB)에서 재배. 박테리아가 48 시간 동안 성장, 4 ° C에서 접시를 저장할 수 있습니다.
- 웜 파이를 생성하려면CK. 짧은 파스퇴르 피펫에 0.01 "직경 백금선 마운트 벤젠 버너이 말단을 가열하여, 상기 유리 피펫의 선단에 백금 와이어를 고정. 셔블의 정렬을 생성하기 위해 상기 와이어의 선단을 병합.
- 20 ° C에서 OP50와 60mm NGM 플레이트에 웜 변형 성장.
참고 : 열성 대립 유전자는 최대 25.5 ° C에서 비 허용 온도에서 동물을 성장 필요할 수 있습니다. 플레이트는 프로토콜을 추구하기 위해 많은 젊은 성인과 여전히 음식을 많이 포함해야합니다. - 마스킹 테이프 (그림 1A)의 두 층으로 덮여 두 개의 스페이서 슬라이드 사이의 현미경 슬라이드를 놓습니다.
- 30 초 동안 전자 레인지에서 가열하여 20 mL의 M9 버퍼 아가 분말 0.6 g을 용해시켜 M9 버퍼의 3 % 아가로 오스 용액 (중량 / 부피)를 준비한다. 용액을 5 분 동안 냉각 할 수 있습니다.
주 : 아가로 오스 용액을 전자 레인지에서 용융 후 며칠 동안 이용할 수있다. 그것또한 분주 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. - 두 개의 스페이서 슬라이드 사이에있는 유리 슬라이드에 뜨거운 3 % 아가로 오스 용액의 방울을 놓는다. 거품을 형성하지 마십시오.
- 도 1b에 도시 부드럽게 눌러로 빠르게 다른 슬라이드와 아가로 오스를 다룹니다. 상단 슬라이드 아가로 오스 드롭을 평평하고 마스킹 테이프의 두 층의 두께의 패드를 생성합니다.
- 아가로 실온에서 적어도 1 분 동안 또는 배아 패드로 전송 될 준비가 될 때까지 고형화 할 수있다.
- 웜 선택을 사용하여, M9 버퍼의 400 μl를 포함하는 마이크로 원심 분리기 튜브에 NGM 플레이트에서 30도 공급 젊은 성인 (20)를 전송할 수 있습니다.
- 벌레가 약 5 분 동안 중력에 의해 침전 및 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액을 제거 할 수 있습니다. 이 단계는 선충류와 촬상 박테리아의 최대 값을 제거하는 것을 목적으로한다.
- 각 관에 M9 버퍼의 200 μl를 추가합니다.
- 파스퇴르 핍 사용두기가이 시계 유리 튜브 (버퍼 선충)의 내용을 전송.
- 합니다 (spermatheca과 외음부 사이) 중반 본체 부에서 동물을 잘라 하나 또는 두 개의 25G 5/8 "바늘을 사용합니다.
주 : 메스 블레이드는 바늘 (들)에 대한 대안으로서 사용될 수있다. 수영 선충에서이 작업을 수행과 연습이 필요할 수 있습니다. 아이디어는 위 또는 다수의 주사 바늘을 사용하는 방법에 따라 나이프로 바늘을 사용하는 것이다. 동물이 절개되면, 자웅 동체는 버퍼에 자신의 배아를 놓습니다. - 액체 내에서 순환 와류의 생성을 통해 시계 접시의 중심에 배아를 집중한다.
- 마이크로 피펫을 사용하여 시계 접시에서 M9의 대부분을 제거합니다. 배아와 M9의 약 30 μl를 남겨주세요.
- 패드 떨어져 그것을 밀어 아가로 오스 패드 (그림 1B)를 덮고있는 슬라이드를 제거합니다.
- (완전히 커버 슬립으로 커버 할 수 있도록하기 위해 면도날 패드 컷그림 1C).
- 파스퇴르 피펫을 사용하여, 아가로 오스 패드에 모든 배아 (및 웜의 파편)을 전송합니다.
- 그룹을 200㎕ 마이크로 피펫에 사용되는 팁의 선단에 접착 속눈썹을 사용하여 패드의 중심에서 배아.
- 천천히 기포 형성을 회피 패드 커버 슬립을 배치하고 밀봉.
참고 : 여러 물개 사용할 수 있습니다. 우리는 (일반적으로 수채 화법 그림에 대한 껌을 마스크로 사용) 예술과 공예 상점에서 발견 껌을 그리기 사용합니다. 이 친수성과 굳은 합리적으로 빠르고 벌레에 대한 독성이 없기 때문에이 껌이 사용됩니다. 슬라이드는 매니큐어 또는 VALAP (바셀린, 라놀린과 Parafin 왁스로 만들어진 혼합물)로 밀봉 할 수있다. - 약 15 분 동안 그리기 껌 건조를 허용합니다.
- 다음 문화 매체와 재료를 준비합니다 :
- 초기 신장 4 개의 차원 Normarski DIC 현미경을 사용하여 촬영
주 :이 단계의 목적은 후기 연신의 시작 콤마 조기 신장률을 기록 할 것이다- 몸 벽 근육이 수축을 시작할 때 순간으로 정의. 우리는 또한 시간에 하나 이상의 수정란을 기록하고자합니다. 기록 8 시간은 일반적으로 비 - 동기화 된 배아의 초기 그룹 신장률을 기록해야한다.- 현미경의 무대에 탑재 된 슬라이드를 놓습니다. 현미경은 시간 경과 현미경과 Z - 스택의 생성 (자동 Z-플랫폼)을 가능하게 10X 및 60X 목표뿐만 아니라 DIC 렌즈, 프리즘, 카메라와 캡처 소프트웨어가 장착되어 있는지 확인합니다.
참고 : 온도가 현미경 실 20과 23 °의 C 사이의 일정 있는지 확인합니다. 가열 냉각 챔버 열성 돌연변이를 이용하여, 특히 현미경 스테이지에 요구 될 수있다. - 10 배 목표를 사용하여 사전 형태 형성 단계에서 배아의 그룹을 식별합니다.
- 일단 10X 목적을 밀어 슬라이드에 기름 침지 한 방울을 추가, 위치.
- 60X 대물 렌즈를 사용하여, 상부 및 (E)의 저부를 식별셋업 mbryos는 Z 스택 촬상 파라미터.
참고 : 배아의 두께보다 큰 Z - 스택을 설정하는 것을 망설이지 말라. 0.8 μm의로 인접한 두면 사이의 거리를 설정합니다. 이것은 35 내지 50-Z 평면에서 배아의 전체 깊이를 커버 할 수있게 할 것이다.
참고 : 현미경 자동화 된 XY 플랫폼을 포함하는 경우, 패드의 서로 다른 위치에있는 배아를 동시에 기록 할 수 있습니다. 이렇게하려면, 기록 XY는 실험의 과정에서 분석하고자하는 패드의 각 위치의 좌표. 기록 매개 변수를 설정할 때 XY를 선택하고 표시된대로 프로토콜의 나머지 부분을 수행해야합니다. 녹화 중 배아의 얇은 Z-절편은 반드시이 프로토콜에 설명 된 측정이 필요하지 않습니다. 최대 해상도 중량 및 돌연변이 동물의 배아 발달을 녹화 그러나 추가 분석을 지원할 수 녹음의 라이브러리를 구축하기 위해 좋은 방법입니다. - 세트8 시간 지속이 인수 사이에 2 분 간격으로 시간 경과입니다.
주 : 노광 시간이 현미경에 설정된 광 강도에 의존 할 것이다. 초기 신장 동안 셀 운동은 매우 느립니다; 노출 시간은 초 이하 당 약 한 프레임이 될 수 있습니다. 배아 초기 형태 형성 단계 (지느러미 인터, 복부 인클로저)에있는 경우, 초기 신장 1 시간 내에 기록 될 것입니다. 확인 광 셔터는 각 획득 사이에 폐쇄된다. - 인수를 실행하고 저장합니다.
- 현미경의 무대에 탑재 된 슬라이드를 놓습니다. 현미경은 시간 경과 현미경과 Z - 스택의 생성 (자동 Z-플랫폼)을 가능하게 10X 및 60X 목표뿐만 아니라 DIC 렌즈, 프리즘, 카메라와 캡처 소프트웨어가 장착되어 있는지 확인합니다.
- 이미지 분석을 이용하여 초기 신장 결함의 측정
- 열기 피지 - ImageJ에 소프트웨어 ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- 메뉴에서 / 설정 측정 분석 선택, 경계를 선택합니다. 각각의 배아를 들어,도 2a에 도시 한 바와 같이 태아의 인두에 초점을 Z 스케일 막대를 조절한다. 이것은 배아의 중심에 초점을 맞출 수 있도록합니다. 배아의 길이를 측정하기 위해 초기 연신 시작시 관심 배아를 갖는 시간 스케일 바를 조정 (쉼표 단계;도 2a 참조). 시간 ( "시간 시작") 참고.
- 분할 줄 도구를 선택합니다. 배아 (그림 2A)의 중간 선 아래 꼬리의 끝 부분까지 배아의 입의 끝에서 분할 선을 그립니다. 메뉴 탭 / 측정 분석하여 그린 라인의 길이 ( "길이 시작")을 얻었다 사용.
- (근육이 수축을 시작할 때 순간) 초기 신장의 끝에서 동일한 배아이 측정을 반복합니다. ( "시간 - 엔드") 시간을 기록하고 배아 (도 2b) 위에 설명 된 바와 같이 ( "길이 단부")의 길이를 측정한다.
- 다음과 같이 초기 단계에서 신장 및 길이의 증가 (L)의 기간 (D)을 계산한다 :
D = "시간 끝"- "시간 시작"
& #(160); L = "길이 엔드"- "길이-시작" - 헤드 폭을 측정하기 위해, 관심 (1.2 배 단계 또는 초기 신장의 끝 부분)의 단계에서 배아를 가지고 시간 척도 막대를 조정합니다. 직선 도구를 선택합니다. 머리의 횡단 (배측 - 복부 축) 중간 선을 그립니다. 이 섹션에서는 배아 (그림 2C)의 가장 두꺼운 부분이다. 메뉴가 / 분석 측정하여, 헤드의 폭에 대응하는 라인의 길이를 얻었다.
- (도 2C를 장내 밸브 꼬리의 끝 사이의 중간 선) 및 테일 폭을 얻기 위해 그것을 측정 동일 시각에, 꼬리의 횡단 중심선을 묘화하여이 과정을 반복한다.
참고 : 다른 표현형에서 동일한 단계에서 배아를 비교하는이 측정을 사용합니다. 이 측정의 재현성을 보장하기 쉽게 한 동물에서 인식 할 수있는 동물의 꼬리의 중간 선 주위에있는 위치를 찾을 수 있는지 확인사람 같아. - 꼬리 폭 비율 헤드를 계산하는 꼬리 폭으로 헤드 폭을 나눈다.
늦은 신장 결함의 특성 (2) 이미지 분석을 이용하여
- 알칼리성 하이포 아 염소산 치료를 사용하여 L1 애벌레의 동기화
- 많은 성인 포란을 함유하는 비 - 고갈 60mm 플레이트에서 M9 완충액 1 ㎖를 파스퇴르 피펫을 이용하여 상기 플레이트 오프 선충 세척하여 마이크로 원심 분리 튜브 내의 모든 웜 모은다.
- 퇴적물 선충 상온에서 3 분 동안 3,500 XG에 웜 펠렛을 방해하지 않고 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액을 제거합니다.
- 각각의 튜브 (0.4 M 차아 염소산, 0.5 M 수산화 나트륨)에 차아 염소산 용액 1 ㎖를 추가하고 3 분 동안 흔들어.
참고 : 알칼리 차아 염소산 용액을 새로 제조해야하며,이 솔루션의 배아 부드럽게 교반해야하지만 지속적으로 EMBR의 성인의 용해와 산소를 최적화 할 수YOS. 3 분 교반 한 후, 대부분의 성인은 용액에 알을 해제해야합니다. - 펠렛을 방해하지 않고 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액을 제거 빨리 상온에서 3 분 동안 3500 × g으로 스핀하고.
- 3 분 동안 3,500 XG에서 원심 분리 M9 버퍼 1 ㎖로 4 회 세척 할 것.
- 네 번째 세척 후, 계란 (계란이 팁의 플라스틱에 집중하는 것처럼)로 pipetting없이 M9 버퍼 700 μL의 상층 액과에 resuspend 계란을 제거합니다.
- 적절한 성장 온도 인큐베이터에 넣고 3 mm 궤도 진탕 기 튜브를 테이프 밤새 600 rpm으로 흔들어.
- 동기화 유충의 길이 측정
- 원심 분리기는 상온에서 3 분 동안 3,500 XG에서 L1 유충을 체포 뜨는을 제거합니다. M9 버퍼 100 ㎕의 유충을 재현 탁하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 아가로 오스 패드에 그들을 전송 (아가로 오스 패드를 준비해야한다D로 1.1.8에 섹션 1.1.2에서 설명). 패드에 커버 슬립을 놓습니다.
주 : 패드가 짧은 인수 관련이 실험을 위해 고무로 밀봉 할 필요가 없습니다. - 고해상도 카메라를 사용하는 경우 유충의 길이를 측정하는 10X 대물 렌즈와 위상차 조명을 사용한다. 유충 (도 2D)의 선명한 화상을 몇 밀리 초 내에 이미지를 캡처하고 그 결과 획득 할 수있는 빛의 강도를 증가시킨다.
참고 : 유충의 수영 삭제 한 사용자가 아가로 오스 패드에 의해 감소하는 동안, 그들은 여전히 이동하고 있습니다. 따라서, 고속 기록은 선명한 화상을 얻기 위해 필수적이다. - 피지 - ImageJ에를 열고 단계 1.3.1를 반복합니다. 유충의 길이를 측정하기 위해, 분할 줄 도구를 선택합니다. 유충 (그림 2D, 오른쪽 패널)의 중간 선 아래 꼬리의 끝 부분에 머리까지의 끝에서 분할 선을 그립니다.
- 의 길이를 구하는 측정 / 분석 메뉴 사용법마이크로 미터의 유충의 길이에 대응하는 그린 라인.
- 원심 분리기는 상온에서 3 분 동안 3,500 XG에서 L1 유충을 체포 뜨는을 제거합니다. M9 버퍼 100 ㎕의 유충을 재현 탁하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 아가로 오스 패드에 그들을 전송 (아가로 오스 패드를 준비해야한다D로 1.1.8에 섹션 1.1.2에서 설명). 패드에 커버 슬립을 놓습니다.
유동 세포 계측법을 사용하여 늦은 신장 결함 3. 특성
- 애벌레 동기화
- 잘 자란 젊은 성인의 100 전체 mm 플레이트에서 2.1 절에 설명 된대로 알칼리 차아 염소산 처리를 사용하여 배아를 정화하고 배아 해치 20 또는 25.5 ° C에서 24 시간에 16 M9 버퍼에 L1 체포가 변형에 따라하자 분석 하였다.
참고 : 변형 당 잘 자란 성인의 한 전체 접시 아래에 설명 된 분석에 충분하다.
- 잘 자란 젊은 성인의 100 전체 mm 플레이트에서 2.1 절에 설명 된대로 알칼리 차아 염소산 처리를 사용하여 배아를 정화하고 배아 해치 20 또는 25.5 ° C에서 24 시간에 16 M9 버퍼에 L1 체포가 변형에 따라하자 분석 하였다.
- 웜 분류기의 교정
주 : 여기에서 사용되는 사이토 흐름 세포 계측기 (이하 웜 분류기라고 함) 큰 입자 흐름이다. 웜 분류기는 멸종 검출기의 전면에 위치한 670 nm의 적색 다이오드 레이저가 포함되어 있습니다. 웜 분류기는 형광 여기에 대한 여러 줄 아르곤 레이저가 포함되어 있습니다. 의 Standard 장비는 세 광전자 증 튜브 스펙트럼의 녹색, 노란색 및 빨간색 영역에서 형광 방출을 감지하는 데 사용 (PMT) 형광 검출기가있다. 여기에 설명 된 프로토콜에 TOF는 유충의 크기를 측정하는 데 사용되며, 적색 채널 프로피 듐 요오다 이드 (PI)로 염색한다 죽은 벌레를 식별하는 데 사용된다. GP (일반용) 높은 형광 제어 입자가 악기를 교정하는 데 사용하고 실험에서 내부 통제로, 녹색, 노란색, 빨간색으로 높은 형광을 표시합니다. 그들은 녹색 채널에서 검출 높은 발광 분석 시료의 유일한 목적이 될 것이며, 이후 이러한 특성을 기반으로 식별됩니다.
주 : 살아있는 동물 녹색 및 적색 채널에서뿐만 아니라 TOF에 대한 형광의 유무에 기초하여 식별된다. 유충의 장에서 Autofluorescent 방출 L1 단계에서 검출되지 않습니다.- 레이저 블록, 컴퓨터, 압축기의 온 스위치웜 분류기 악기를 거라고. 기기의 사용 설명서에 표시된 열린 웜 분류기 소프트웨어의 START 버튼을 누릅니다.
- 아르곤 레이저 제어 팝업 창을 관찰한다. RUN 모드를 선택하고 레이저 힘은 10 ± 1 mW에 도달으로 기다립니다. 레이저 제어 창에서 완료를 선택합니다.
- 시스 각각 5.10 ± 0.02 및 5.51 ± 0.01 시료 압력을 설정합니다. 압력이 최소 15 분 동안 평형 압력 OK 체크 박스를 클릭 할 수 있습니다.
주 : 유량 시스 샘플 압력에 의존한다. - 샘플 컵과 분석 챔버 사이의 유동 채널 세관에있는 모든 거품을 제거해야합니다. 이렇게하려면 ACQUIRE를 클릭하고 (인수 창에서 볼 수 있듯이) 더 거품이 획득되지 않을 때까지 부드럽게 가느 다란 관을 가볍게.
- 형광 및 TOF 측정 및 검출 다음의 모든 매개 변수의 설정 :
- TOF, 내선, 녹색, 노란색 및 빨간색에 대한 스케일을 설정녹색과 노란색과 빨간색 900 700에서 1. 설정 PMT 제어 표에 설명 된대로 256 세트 이득.
주 : 두 여기 필터 (488 내지 514 ㎚) 가능하고 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 황색 형광 단백질 (YFP) 또는 여러 아르곤 레이저와 이러한 파장에서 여기 된 임의의 형광체를 여기 시키는데 사용될 수있다. 적절한 필터 장치의 필터 챔버 내에 삽입 될 필요가있다. 우리는 다음과 같은 실험을 위해 488 nm의 필터를 사용했다.
- TOF, 내선, 녹색, 노란색 및 빨간색에 대한 스케일을 설정녹색과 노란색과 빨간색 900 700에서 1. 설정 PMT 제어 표에 설명 된대로 256 세트 이득.
- 웜 정렬을 교정하려면 도구 메뉴에서 "실행 제어 입자"를 선택합니다. 컵에 1 배 GP (일반용) 높은 형광 제어 입자의 20 ㎖를 (이 입자가 악기를 교정하기 위해 세포 계측법 제조업체에서 판매 정확한 크기의 형광 물질이다) 넣습니다.
- 외장 및 샘플 흐름을 시작 ACQUIRE 버튼을 클릭합니다.
참고 : 21 ± 6과 AC 제어의 입도 분포에 관한 평균 기대그 평균 (CV) ≤11 주위에 변화의 oefficient. 이력서는> (11)이며, 평균은 깨끗한 버튼을 여러 번 클릭하거나 유동 채널을 쓸어 넘겨 세관 청소> (27) 시도하는 경우.
- 동물 TOF의 취득
참고 목적은 레이저 소스 및 흡광 검출기의 플로우 셀에서 통과 할 때 빛을 산란시킨다. 이 광 걸리는 시간은 대상물의 축 방향 길이를 측정하는 데 사용되는 비행 물체 (비행 시간 TOF)에 의해 산란된다. 오브젝트 (멸종 EXT)에 의해 마스크되는 빛의 범위는 불투명도 / 광학 밀도의 척도로서 사용된다.- 동기화 야생형의 10 μl를 배치 (중량) L1 시계 유리 및 해부 현미경을 사용하여 죽은 계란의 비율을 추정한다.
참고 : 중량에 높은 EMB (이상 20 %)를 표시 동기화 L1은 추가 분석을 위해 사용해서는 안됩니다. - 전송이 미세 원심에서 L1 동기화 (approximately 15 ML 원뿔 튜브에 L1을 포함하는 M9의 700 μL). 10 μg의 / ㎖ (희석 1 ㎎ / ㎖ 원액으로부터 1/100 번째)의 최종 농도로 요오드화 프로피 디움 (PI)을 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
참고 : 죽은 계란과 애벌레 PI를 사용하여 염색 빨강 채널을 사용하여 높은 형광 물체로 감지됩니다. - 스테인드 인구를 희석 M9 버퍼의 10 ML을 추가합니다. 희석 인구 5 mL를 취하여 M9 15 mL로 추가하여 네 번 희석한다. 샘플 컵이 희석을 놓습니다.
- 클릭의 ACQUIRE하여 샘플 흐름을 실행하고 유량을 관찰합니다.
주 : 정확한 측정을 위해, 유량 / 초 15 ~ 25 개체를 유지한다. - 필요하다면, 소정 유량에 도달하기 위해 컵에 동물의 양을 조정한다.
참고 : 유량 뜻은 3.2.3와 애벌레 난의 농도에 나타낸 바와 같이, 일정한 압력 (외피와 샘플)에 따라 달라집니다n은 컵. 유량이 25 이상이면 개체 / 초 컵 일부 버퍼를 추가한다. 그것은 미만 15 개체 / 초는 컵 (단계 3.3.3에서) 농축 L1을 추가 할 경우. - 대상의 적절한 농도에 도달하면, 컵의 부피를 평가 높은 형광 GP 제어 입자 4X 용액이 용적의 1/4 번째의 추가.
- 게이팅 및 정렬 매개 변수를 조정합니다. 이렇게하려면 메뉴에서 '게이팅'을 클릭하고 'TOF 대'를 선택 와 '녹색'. 메뉴에서 '정렬'을 클릭하고 'TOF 대'와 '레드'를 선택합니다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 게이팅 및 정렬 그래픽은 나타날 것이다.
참고 :이 (녹색과 적색의 발광)를 제어 입자의 시각화를 허용, PI 거품으로 얼룩진 죽은 동물 (발광 녹색 빨강 및되지 않음) 사는 동물 (녹색이나 붉은 어느 채널에서 더 배출) (그림 3A ). - ACQ을 클릭하여 실험을 실행UIRE.
참고 : 약 10,000 개체, 그래서 약 8,000 동물, 애벌레 사이의 작은 크기의 차이를 식별 분석합니다. 실험을 중지하고 STORE를 클릭하여이 .txt 형식으로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
- 동기화 야생형의 10 μl를 배치 (중량) L1 시계 유리 및 해부 현미경을 사용하여 죽은 계란의 비율을 추정한다.
- 동기화 인구의 생활 동물의 상대 크기 측정
- 대용량 데이터 테이블을 관리 할 수 소프트웨어를 사용하여 .txt 파일을 엽니 다.
- 분석 된 객체 (100)보다 높은 임의 단위 녹색 채널에 발광을 특징으로 조정 입자와 관련된 TOF 값 추출물 (이 값은, 섹션 3.2.5에 설정된 파라미터들에 의존한다). 새 열을 생성하고 통제 입자 '이라고 부른다. '샘플'라는 제어 입자를 제외한 다른 모든 개체를 포함하는 열을 만듭니다. 참고 : 새 입자 배치 요구의 형광 방출은 인수를 시작하기 전에 확인해야합니다. 이것의 식별을 가능하게하는 형광 임계 값을 설정한다L1s 제어 입자.
- 각 분석 균주 유량 (인해 예컨대 계란의 플러그의 존재)가 변경 한 실험의 부분을 식별한다. 이렇게하려면 :
- 시간의 인자 (도 3B)와 같은 각각의 샘플에 대해 '조정 입자'의 TOF 플롯.
- 추세선 도구를 사용하여 선형 추세선을 그리고 차트에서 식을 표시합니다.
주 : 조정 입자의 TOF 시간 이상 일정하게한다 (수평 라인,도 3B). 데이터 Y = AX + B에 그려진 선형 추세선의 방정식을 고려하여, 'A'값이 낮은 것을 10-4 있는지 확인하십시오. 제어 입자의 배향 파열 표시 시간 구간 내에서 모든 측정 분석에서 제거되어야한다.
- 보다 낮은 10과 높은 TOF 죽은 태아와 거품 (빨간색에서 방출 이상 15)과 작은 파편과 큰 계란 플러그 (제거어)는 각각 70보다 '샘플'측정에서.
- 분석 된 각 변형에 대한 통제 입자 '분포를 플롯. 도 3c에서 보는 바와 같이 이러한 분포는 거의 완벽 오버레이한다. 이것은 다른 균주 수득 TOF 측정을 비교할 수있는 것을 보장한다. 주 : 샘플 조정 입자의 분포가 제어 된 샘플의 것과 중첩되지 않는 경우도 조정 입자를 사용할 수있다 위에 TOF 샘플 소자 정규화. 다음으로 정규화 TOF가 계산된다 :
- 중량이 제어 샘플입니다 유전자형 G = (G에 대한 샘플 TOF) / (G 평균 통제 입자 'TOF) × (평균 통제 입자'중량에 대한 TOF)에 대한 TOF를 정상화.
- 동물 중량 우리의 경우 (그림 3D)에서, 제어 샘플을 포함하여 각 변형에 대한 애벌레 TOF 분포를 플롯. (각각의 집단에 대한 평균, 평균 (SEM)의 표준 오차를 측정
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Representative Results
헤드폰, Tail- 및 헤드 / 테일 폭 비율은 강력한 지표입니다.
여기에 설명 된 프로토콜이 성공적으로 조절기와의 Rho GTP 아제 PIX-1의 이펙터 기능, 박-1 특성화 렛 502 초 신장 7 동안 사용되어왔다. 구아닌 교환 인자 PIX-1 각각 박 -1- 코드 (GEF)과 RHO-1 7 이펙터에 대한 라 세미 / Cdc42 GTP 아제에 대한 구체적이고 할 수-502 코드 이펙터. 이 연구에서, PIX-1 박-1 초기 신장 동안 7 표피 형태 형성을 제어하는 것으로 하였다. 측정 본 연구에 사용 머리와 꼬리 폭 측정은, 처음으로 전방에 위치하는 EMB 피하 세포를 보여료의 후방 7에있는 것보다 다른 형태 형성 프로그램을 따릅니다. 이러한 측정의 재현성 및 안정성을 확립하기 위해, 헤드 폭 1.2 배 단계에서 독립적 12 야생형 (중량) 배아에 5 회 측정 하였다. 그룹에 대해 측정하는 것이 제안, 측정의 다섯 가지 그룹 간의 차이를 비교 한 후 측정 사이에 유의 한 차이 (도 4a F- 시험 P- 값> 0.5) 공개하지 (R 통계 패키지를 사용하여) 브라운 포사이드 테스트를 사용하여 평가 배아의 재현이다. 이러한 측정치와 연관된 재현성 및 배치 효과를 평가 세 가지 일 (N = 12 배아)에서 수행 4D-DIC 촬상 1.2 배 내지 단계 배아의 헤드 폭의 측정을 통해 이루어졌다. 이 세 가지 측정 그룹에 걸쳐 분산이 크게 차이가 없었다 및 유의 배치 효과는 헤드 w에 영향을 찾을 수 없습니다IDþ 측정 결과 (F-테스트 페이지 - 값> 0.5도 4B).
유사한 결과가 꼬리 폭 측정 초기 연신의 다른 단계에서 수행되는 측정을 수득 하였다 (데이터는 보이지 않음). 이러한 데이터는 초기 신장 결함을 특성화하는 강력한 지표로 머리 폭, 꼬리 폭과 헤드 / 테일 폭 비율을 설립했다.
머리와 꼬리 폭뿐만 아니라 태아의 길이를 측정하는 것은 배아의 안테 - 후부 축 따라 초기 신장 제어 유전자의 특성을 허용합니다.
배아의 길이뿐만 아니라, 자신의 머리와 꼬리의 폭의 측정은 실시 중량 및 돌연변이 배아 행해졌 초기 신장 조절 유전자 기능 대립 손실 강한 null 또는 감온 : PIX-1 (gk416)를;(ok448) - 1 박 및하자-502 (sb118ts) 7. 우리는 헤드 / 테일 (H / T)가 시작 부분에 중량 및 돌연변이 배아의 폭의 비율 (1.2 배 스테이지) 측정 및 비 - 허용 온도에서 초기 신장의 끝에 (도 4c는 좌측 및 우측 패널에 각각). 초기 연신 초기에 어떠한 변경 - 또는 감소 H 거기 없지만 / T 비는 박-1 PIX-1에서 관찰되었다 렛 502 돌연변이 중량 동물 (1.2 배 단,도 2c, 왼쪽 패널에 비해 도 4c; 오른쪽 패널)), 초기 신장 마지막 세 돌연변이 배아 중량보다 상당히 높은 H / T의 비 (t -test -values P <0.006을 나타내었다. 이것은 PIX-1 박-1 및 송출 502 돌연변이 배아 신장 초기의 끝에 이상 안테 - 후방 형태를 표시하는 것을 보여 주었다. 추가 분석 헤드 폭을 비교하고, 꼬리 betwee 폭1.2 배 스테이지와 같은 측정 파라미터를 사용하여 초기 연신 단, N은 헤드 폭 이하 PIX-1 박-1 감소하게-502 돌연변이 테일 폭하자-502 변이주에 훨씬 적은 감소하면서 것이 밝혀 만 7. PIX-1과 박-1 제어 형태 형성 과정이 배아 (7)의 앞쪽 부분에 주로 발생하면서는, 배아의 안테 - 후방 축을 따라 유사하게 그하자-502 컨트롤 형태 형성 과정을 밝혔다. 초 연신율 (도 4d)의 시작 단부에 대 배아 간의 길이의 차이는 또한 측정 하였다. 우리는 혼자 크게 elongatio을 줄이기 위해 충분한 비교할 때 초기 신장이 크게 PIX-1과 박-1 돌연변이 체의 전방 형태 형성의 변경을 제안 중량 박세리-1, PIX-1 감소 할-502 돌연변이 체를했다 발견배아의 N.
프로토콜 2 및 3 중량 및 돌연변이 배경에서 체포 유충의 길이를 평가하기 위해 사용되었다. (; 미공개 데이터 프로토콜 3) 이들 유충의 길이는 모두 이미지 분석 (프로토콜 2) (7) 및 유동 세포 계측법을 이용하여 평가 하였다. 견고하고 높은 재현성 방법 (도 5a)에 마이크로 미터에서 동물의 길이의 절대 측정치의 화상 해석 결과를 이용하여 유충 길이 측정. 이 분석은 중량 (도 5a)에 비해 동기 돌연변이 유충 표시 크게 길이를 감소하는 것이 밝혀 7. 유동 세포 계측법 기반 프로토콜 (프로토콜 3)를 사용하여 이러한 유충의 측정 비교 결과 (그림 5B)를했다. 그러나, 후자의 방법을 사용하여 측정 유충의 많은 크게 유전자형 비교 (t 통계적 견고성을 증가 주목해야한다 - 테스트 페이지의 -values <10 -24). 이러한 결과에 따라 유동 세포 계측법 방식은 매우 미묘한 신장 결함을 표시하는 돌연변이 동물을 특성화하기 위해 영상 분석을 통해 더 나은 선택 일 수있다.
아가로 오스 패드 1. 준비 그림. 테이프. B 마스킹 두 층으로 덮여 개의 스페이서 슬라이드 사이에 배치 된 A, 현미경 슬라이드, 상기 아가 패드 개의 스페이서 슬라이드 지원 다른 슬라이드에 덮여있다. C로 절단 후의 최종 형상 및 아가 패드의 크기 면도날이 coverslip에 맞게. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
g2.jpg "/>
.도 2 초기 및 후기 신장 결함의 측정 A - B, 콤마 단계 (A)에서의 배의 길이의 신장 및 조기 (B)의 끝에서 측정. 배아를 측정하는 데 사용되는 적색 라인 (왼쪽) 1.2 배 단계에서 초기 신장 (오른쪽)의 끝에서 배아에서 측정 ImageJ에. C, 머리와 꼬리 폭의 분할 선 도구를 사용하여 그려졌다. 화살표는 측정 영역의 현지화 대표 (마틴 등의 알에서 수정을., 2014). 스케일 바 :. 20 μm의 D, 유충의 길이가 동기화 L1-유충을 측정한다. 오른쪽 패널은 촬영 화상 (왼쪽)의 확대도이다. 빨간색 선은 ImageJ에의 분할 줄 도구를 사용하여 그려졌다. 유충의 길이를 측정하기 위해 사용된다. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
흐름 - 세포 계측법. A, 게이팅 및 녹색 및 제어 입자의 빨간 발광 표시 COPAS Biosort의 분류 창을 사용하여 동기화 유충의 길이 그림 3. 측정, (죽은 및 비행 시간에 대한 살아있는 동물, TOF 거품 ). B, 대표적인 실험 상이한 시점에서 조정 입자의 TOF. 대 시간 TOF의 선형 함수의 기울기는 조정 입자의 TOF 실험 내내 시간 일정한 것을 나타내는 약 10-5이다. C, 분포의 최대 값의 백분율로 표시 제어 입자 TOFs 분포. 비 표준화 및 표준화 된 제어 입자 분포에 대한 표현 박세리-1 (ok448). 다른 배포판은 표준화되지 않습니다. D, 생활 TOFs의 분포동물 분포의 최대 값의 백분율로 나타냈다. TOFs가 지시 된 바와 같이 박-1 (ok448)을 제외한 조정 입자에 정규화되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 픽스 - 1 박-1 및하자-502 돌연변이 현재 초기 신장 결함. A - B는 머리의 재현성 및 안정성 평가는 측정 폭 A, 1.2 배 스테이지 (N = 12 배아)의 중량 배아 대한 헤드 폭의 독립적 인 측정 다섯.. 수단 및 표준 편차 (오차 막대)가 표시됩니다. 측정 사이의 비 상당한 (NS) 차이는 브라운 - 포사이드 테스트를 사용하여 계산 하였다 (우리를ING R 통계 패키지) (F-테스트 p- 값> 0.5). B, 세 가지 다른 일 (N = 12 배아에서 중량 배아에 대한 헤드 폭 측정). 수단 및 표준 편차뿐만 아니라 표시된다; 측정에 걸쳐 분산 유의 한 차이가 없었다 (NS는, 브라운 포사이드 F 테스트 P- 값> 0.5) C, 헤드 / 테일 폭 비율의 분포 초기의 끝에서 1.2 배의 단 (좌측 패널)에. 중량의 신장 (오른쪽 패널), PIX-1 (gk416), 박세리-1 (ok448), 23에서 할 수-502 (sb118ts) 돌연변이 - 24 ° C. 사이에 본 연구에 사용하자 - 502ts 배아의 어머니가 25.5 ° C. D, 중량의 신장, PIX-1 (gk416), 박세리-1 (ok448)의 분배에서 성장하고 있음을 참고하자-502 (sb118ts) 돌연변이 콤마 단계와 후기 연신 시작. 상자 - 플롯은 최소, 최대, 25 일, 50 일 (중앙값) 75를 나타냅니다인구의 번째 백분위 수. * t -test 페이지 - 값 <0.05, ** t -test 페이지 - 값 <0.006 (마틴 등의 알에서 수정., 2014). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 픽스-1 (gk416), 박-1 (ok448) 및 L 등-502 (sb118ts) 애벌레 현재 길이 결함. 중량 측정 애벌레의 A, 길이 PIX-1 (gk416), 박 -1- (ok448)과 송출 (502 sb118ts) 동물을 이미지 분석 (프로토콜 2). B, 유동 세포 계측기를 사용하여 측정 된 상대 유충 길이 (측정 프로토콜 3). 괄호 안의 숫자는 제 사용 동물의 수에 대응전자 측정. 길이와 평균의 표준 오차 수단 (SEM; 오차 막대)가 표시됩니다. P- 값 -test 학생의 t는. (p)를 표시하는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 초기 특성화하는 새로운 메트릭 및 배아 신장의 후반 단계에 대해 설명합니다.
섹션 1에서 중요한 단계는 패드 박테리아의 잠재적 인 존재이다. 배아는 밀봉 패드와 이미지 수집시 커버 슬립 사이에 동봉되어 있습니다. 슬라이드를 씰링하는 두 시간 이상 지속 취득 중에 동물의 탈수를 방지하기 위해 필요하다. 우리의 지식, 슬라이드와 커버 슬립 사이의 아가로 오스 패드를 장착하는 데 사용되는 실러의 아무도는 통기성 없습니다. 박테리아 (또는 배아) 다량의 패드 상에 존재하는 경우에 결과적으로, 그들은 그들의 조기 사망에 이르는 몇 시간 후, 산소를 박탈 할 수있다. 3 배 배아를 갖는 - 비 신장 배아에 비해 길이가 3 배입니다 배아에 해당하는 - 잠재적 인 저산소 조건의 좋은 지표가 될 것이다 관심의 배아와 함께 기록, 그 배아가 파묻혀 이동을 중지하기 때문에산소가없는 상태에서의 R 달걀 껍질. 어떤 형태 학적 측정은 저산소 조건 또는 죽은 배아에서 수행 될 수 없습니다.
타임 랩스 영상을 사용하여 다른 중요한 단계는 배아 발달이 일어나는 온도이다. 열성 돌연변이 현재 C.에서 사용 간스. 온도 변화의 생물학적 효과를 즉각적이거나 단백질의 반감기와 운반 돌연변이의 성질에 따라 지연된다. 따라서, 배아가 노출되는 온도는 시간이 지남에 따라 일정해야하며 현미경 스테이지에서 현미경 실이나 가열 냉각 실 적절한 환기에 의해 제어되어야한다.
2 장에서는 알칼리 차아 염소산 처리를 사용하여 유충 동기화에 따라 달라집니다. 특정 상황에서,이 치료는 배아 치사 (EMB)가 발생할 수 있습니다. 중량 인구의 20 % 이상 EMB는 차아 염소산 치료 동안 높은 독성을 제안합니다부정적인 형태 형성에 영향을 미칠 수있는, 표준. 중량 배경에 높은 EMB를 표시 동기화 L1은 추가 분석을 위해 사용해서는 안됩니다. 이 제한은 또한 프로토콜 3에 적용됩니다.
우리는 애벌레를 고정하기 위해 마취 약물의 사용을 권장하지 않습니다. Levamisol 특히, 실험 바이어스를 도입 유충을 축소하는 경향이 근육 근육 경련의 유도를 통해 선충을 고정화. 노출 시간은 현미경의 한계로 인해 충분히 빠르게하지 않으면, 우리는 패드에서 아가 로스의 농도를 증가시키고, 패드 및 커버 슬립 사이에 액체의 양을 감소시켜 유충의 운동성을 감소 바랍니다. 케어는 탈수가 자신의 크기를 줄일 수 있기 때문에, 유충을 건조하는하지 않는, 그러나주의해야한다.
섹션 3에서, 유충의 길이 측정은 분석 샘플 사이의 유량의 비교를 사용했다. 이렇게하려면, 제어 입자의 분포는 안돼요 할 필요가빨간. 이러한 값들은 정규화 될 필요가없는 경우에 완전히 오버레이 분포 경우는 TOF (비행 시간) 대응 샘플에 대해 얻어진 값과 비교 될 수있다. (3.4.5.1에 설명 된대로) 박-1 (ok448) (그림 3C 및도 5b)에 대한 그림과 같이 조정 입자-TOF를 통해 샘플-TOF의 정상화가 성공적으로 사용되어왔다. 중량 박 VS-1 (ok448)의 상대적인 길이 또는 정규화없는 적어도 3 개의 독립적 인 실험에서 유사한 것으로 밝혀졌다 (데이타는 미도시). 작은 크기의 차이를 비교 유충 특히 그러나,없이 수득 된 것과 정규화 한 결과를 확인, 추천한다. 또한 유동 세포 계측법을 사용하여 유충 길이 측정 유충보다는 화상 분석에 관해서는 마이크로 미터의 길이의 절대 중량이 경우, 대조군 샘플에 비해 길이를 제공한다는 것을 주목해야한다. 이것은 그 독립적 인 실험에서 측정 할 수없는 의미중량 이상 크기 비율을 계산하지 않는 조합.
샘플 컵에 희석에 사용되는 완충액의 유량에 영향을 미칠 것이다. 우리는 제조자에 의해 권장 시스 버퍼 취득시 발생하는 기포의 양을 증가 세제를 포함 관찰 하였다. 세제를 함유하지 않는, M9 버퍼를 이용하여 현저하게 기포의 형성을 감소하지만, 샘플의 유량에 영향을 분류기의 세뇨관 계란의 막힘을 피하는데 덜 효율적이다. 에그 플러깅 용이 초간 또한 상승 TOF- 하였다 초간 조정 입자의 관찰 TOF의 현저한 감소에 의해 취득 중에 검출된다. 계란 플러그는 채널의 폐쇄 및 입자의 흐름 (초당 이하가 5 개체)의 전체 체포 될 수 있습니다. 이 발생할 경우 유량이 복원 될 때까지 CLEAN 버튼을 클릭합니다. 이 이벤트 기간 동안 발생하는 모든 측정(S)는 데이터 분석에서 제외한다. 시스 버퍼는 죽은 계란의 높은 비율을 특징으로 균주를 포함하는 실험을 권장 할 수있다.
(단계 3.2.3로 설정) 시료와 시스 압력은 시간이 지남에 따라 (약간)를 변경할 수 있고, 매우 일정한 유량을 확보하기 위해 실험을 통하여 수동으로 조정한다. 결과를 분석 시간 (그림 3C)를 제어 입자의 TOFs을 플롯 할 때 감소 또는 낮은 속도의 증가는 관찰 할 수 있습니다. 유량 증가는 반대 결과 반면 유량의 감소는 시간이 지남에 따라 입자의 평균 TOFs의 증가를 초래한다. 유량의 변화에 부정적인 유충의 집단 사이에 작은 크기의 차이를 검출에있어서의 감도에 영향을 미칠 것이다.
신장을 조절하는 유전자를 확인하는 것을 목표로하고 경과 현미경 기록을 요구하는 방법이 일반적으로 높다몇 가지 유전자형을 표현형 때 LY의 시간이 소요되는 지루한. 모든 실험실에서 사용할 수없는 장치를 필요로하는 반면 유동 사이토 기반 방식은 덜 시간 소모적 여러 균주를 특징으로 할 필요가있을 때, 결과적으로보다 효율적. (돌연변이 및 TOF 질량 분포를 비교 학생 T- 테스트하여 평가도 5A와 B)이 방법은 이미지 분석을 이용하여 측정 값에 비해 통계적 또한 더 강하다. 이 방법은 낮은 표현력 / 침투와 신장 결함을 나타내는 균주에 매우 적합 할 수있다.
유동 세포 계측법을 사용하는 여러 가지 방법이 선충 9-12의 체력을 측정하기 위해 이전에 개발되어왔다. 이러한 방법은 96 웰 플레이트 웜 소터 '의 플렉스 모듈 분배 동물을 사용한다. 리플렉스 모듈은 96 웰 플레이트 내에서 분배 선충 인구의 직접 분석 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 방법은 characte 할 수 있습니다비 동기화 된 인구의 체력을 측정 할 수있는 강력한 방법을 하루에 조건 수백 리제 및 구성한다. 그들은 그러나, 잘 동기화 L1 사이의 작은 크기의 차이를 식별하는 데 적합하지 않습니다. L1 유충 간의 작은 차이의 측정은 96 웰 플레이트의 웰 당 효율적 가장 100 개체의 특성있다 플렉스 모듈의 사용과 양립 동물의 다수에 걸쳐 측정을 필요로한다. 여기에 기재된 방법은 크게 감소 된 처리량의 비용이 목적을 위해 설계된다. 이 프로토콜 2 이미지 분석을 이용하여 위에 표시된 개선 장비가 교정되면 시간당 3 ~ 4 조건의 특성을 수 있습니다.
머리와 꼬리 폭 비율의 측정은 배아 (7)의 안테 - 후방 축을 따라 불균일하게 발생하는 형태 형성 과정을 특성화하기 위해 개발 된 첫 번째 방법이다. 언제초기 신장을 제어하는 도시 유전자인가,이 방법은 단계의 형태 형성을 제어하는 신호 전달 경로의 공간 분포를 명확히 할 것이다. 화상 분석 또는 초기 신장 끝에 배아의 길이의 측정을 조합하여 유세포 분석기를 사용하여 구속 유충의 길이 측정은 높은 감도 및 정밀도 이른 또는 늦은 신장 또는 둘 모두를 제어하는 유전자의 동정을 가능하게한다. 이러한 절차는 다음 C.에서 배아 신장을 제어하는 신호 전달 경로의 공간 및 시간 규제의 미래를 이해하는 데 크게 기여할 수있다 간스. 더욱이, 이러한 접근은 또한 인슐린과 같은 TGF 베타 몸체 길이를 제어하는 신호 전달 경로를 연구하기 위해 적응 될 수있는 환경 오염 물질 (15) 16, 13, 14 및 만성 노출 경로. 이러한 측정저기서 다른 유생 또는 성인 할 수L1의 프로토콜 2와 3 측정 크기 차이 g 사소한 변화는 L3, L4 유충 또는 성인으로 큰 개체보다 웜 분류기와 더 도전입니다. 프로토콜 3는 쉽게 이러한 측정을 수행하도록 구성 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
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