Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Özet

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzamasının erken ve geç aşamalarında meydana gelen morfojenik kusurları izlemek için özel olarak tasarlanmış protokolleri detaylandırıyoruz. Sonuç olarak, bu protokoller, bu fazları düzenleyen genleri tanımlamak ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca diferansiyel gereksinimlerini karakterize etmek için tasarlanmıştır.

Özet

Embriyonik gelişim sırasında morfojenik süreçlerin değişimini kontrol eden sinyal yollarının incelenmesi, sağlam ve hassas ölçümler gerektirir. Nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzaması, embriyonun uzunlamasına ekseni boyunca uzamasından oluşan geç bir gelişim aşamasıdır. Bu gelişim aşaması, hipodermal hücreler ve altta yatan vücut duvarı kasları arasındaki hücreler arası iletişim tarafından kontrol edilir. Bu sinyal mekanizmaları, hücre iskeletini ve hücre-hücre bağlantılarını yeniden şekillendirerek hipodermal hücrelerin morfolojisini kontrol eder. Larva evrelerinde embriyonik ölümcüllüğün ve gelişimsel durmasının ölçülmesinin yanı sıra hipodermal ve kas hücrelerinde hücre iskeleti ve hücre-hücre adezyon yapılarının değiştirilmesi, bu sinyal yolaklarını incelemek için 25 yılı aşkın bir süredir kullanılan klasik fenotiplerdir. Son çalışmalar, özellikle erken veya geç uzamayı hedefleyen ve embriyonun antero-posterior ekseni boyunca morfojenik kusurları karakterize eden yeni metriklerin geliştirilmesini gerektirdi. Burada, uzayan embriyoların uzunluğunun ve genişliğinin yanı sıra senkronize larvaların uzunluğunun doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayan ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Bu yöntemler, uzamayı kontrol eden genleri tanımlamak, bu genlerin bu aşamanın hem erken hem de geç aşamalarını kontrol edip etmediğini ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca eşit olarak gerekli olup olmadığını değerlendirmek için yararlı araçlar oluşturur.

Giriş

Kısa yaşam döngüsü: Yaklaşık 50 yıldır nematod Caenorhabditis elegans gelişimi, nörobiyoloji, evrim, konukçu-patojen etkileşimleri, vb önemli soruları incelemek için güçlü bir model olarak kendini kabul ettirdi ¹ gelişme çalışmada bu modelin gücü yatıyor 3 gün; bu hayvanlar genetik olarak değiştirilmiş olabilir hangi ile kolaylığı; Çoğunlukla rahim dışı olduğunu yaşayan hayvanların ve gelişimi, hücre deplasman ve morfolojisi gözlem sağlayan şeffaflığı. nematod gelişim evreleri yetişkinlikte ardından embriyogenezis ve dört larva aşamalarını (L4 L1), içerir. embriyonik gelişim sırasında, epidermal morfogenezisi hücreleri onların kavşak yeni....

Protokol

WT ve Mutant Hayvanlarda Erken Uzama Kusur 1. Karakterizasyonu

1. Normarski DIC Mikroskopi için montaj Embriyolar
   1. Aşağıdaki kültür ortamları ve malzeme hazırlayın:
      1. M9 tampon, çözülür 12.8 g / L Na ₂ HPO ₄ • 7H _2, O, 3 g / L KH ₂ PO _4, 5 g / L NaCl, 0.25 g / L MgSO damıtılmış su ve sterilize edilmesi için otoklav içinde ₄ • 7H ₂ O.
      2. NGM plakalar, GKD ₂ O 3 g / L NaCI, 16 g / l ağar, 2.5 g / L baktopepton çözülür Otoklav ve 1 mM MgSO _4, 1 mM _CaCl2, 1 mM fosfat tamponu ve 5 ug / ml kolesterol ekleyin. ....

Sonuçlar

Baş, bagaj ve Baş / Kuyruk genişliği Oranı Sağlam Metrik vardır.

Burada anlatılan protokoller başarılı düzenleyiciler ve Rho GTPases pix-1 efektör işlevini, pak-1 karakterize ve let-502 erken uzama ⁷ sırasında kullanılmıştır. Bir guanin-değişim faktörü .......

Tartışma

Bu protokol erken karakterize etmek roman ölçümleri ve embriyonik uzama geç evreleri açıklar.

1. bölümde, kritik bir adım pad üzerinde bakteri potansiyel varlığıdır. Embriyolar hermetik pad ve görüntü alımı sırasında lamel arasında içine alınır. slayt Sızdırmazlık iki saatten fazla süren edinimi sırasında hayvanların kuruma önlemek için gereklidir. Bildiğimiz kadarıyla, slayt ve lamel arasındaki agaroz pedleri monte etmek için kullanılan sızdırmazlık hiçbiri hava geçirgen bulunmaktadır. bakt.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ağar	BioShop	AGR001.500
Agarose Bioshop		AGA001.500
CaCl2 (Kalsiyum Klorür)	Bio Basic Inc.	CT1330
Kolesterol	Sigma-aldrich	C8667
Temizleme solüsyonu	birlik Biometrica	300-5072-000
Cam lameller	Fisherbrand	12-542B
Cam kaydıraklar	Fisherbrand	12-552-3
Yüksek floresan kontrol parçacıkları	birliği Biometrica	310-5071-001
K2HPO4 (potasyum fosfat, dibazik)	Bio Basic Inc.	PB0447
K2HPO4 (potasyum fosfat, monobazik)	Bio Basic Inc.	PB0445
MgSO 4 < / alt > (magnezyum sülfat)	Sigma-aldrich	230391
Na2< / sub >HPO< sub>4< / sub> (sodyum fosfat, dibazik)	Bio Basic Inc.
NaCl (sodyum klorür)	Bio Basic Inc.	DB0483
Pebeo Çekme Sakızı 45  ML	Pé bé o	PDG033000	herhangi bir sanat/zanaat mağazası
Peptone	BioShop	PEP403.500
Kılıf tampon	birliği Biometrica	300-5070-100
COPAS Biosort	birliği Biometrica

SDB0487