Introduction
Kısa yaşam döngüsü: Yaklaşık 50 yıldır nematod Caenorhabditis elegans gelişimi, nörobiyoloji, evrim, konukçu-patojen etkileşimleri, vb önemli soruları incelemek için güçlü bir model olarak kendini kabul ettirdi 1 gelişme çalışmada bu modelin gücü yatıyor 3 gün; bu hayvanlar genetik olarak değiştirilmiş olabilir hangi ile kolaylığı; Çoğunlukla rahim dışı olduğunu yaşayan hayvanların ve gelişimi, hücre deplasman ve morfolojisi gözlem sağlayan şeffaflığı. nematod gelişim evreleri yetişkinlikte ardından embriyogenezis ve dört larva aşamalarını (L4 L1), içerir. embriyonik gelişim sırasında, epidermal morfogenezisi hücreleri onların kavşak yeniden nasıl bir grup olarak göç nasıl epitel daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve onların bireysel morfolojisi yanı sıra işlevsel epitel içinde göreceli konumunu değiştirmek kabiliyetini önemli ölçüde dikkat çekti.Epidermal morfogenezisi dört evreye ayrılır: dorsal epidermal hücrelerin yeniden organizasyonunda oluşan sırt interkalasyon, hipodermis olarak anılacaktır; böylece epitel hücre tek tabaka embriyo encasing ventral orta hat doğru ventral hipodermal hücrelerinin göç oluşan ventral muhafaza; erken ve geç uzama vermiform larva haline fasulye şeklinde embriyoyu dönüştürme. Aşağıdaki morfogenezi, embriyo kapak ve L1 larvaları kendi yakın çevrede mevcut bakterileri kullanarak beslemeye başlarlar.
Embriyonik uzama nedenle embriyonik gelişim geç bir aşamasıdır. Bu uzunlamasına ekseni boyunca embriyo uzatılması ve enine çapa sahip bir azalma oluşur. Bu hipodermal hücre şeklinin dramatik bir değişiklik gerektirir. Uzama, erken ve geç faz ayrılmıştır. Vücut duvarı kasları w 1.75 kat aşamada sözleşme başladığınızda erken evre virgül aşamasında başlar ve biterILD tipi (WT) embriyo - olmayan uzatılmış embriyolar göre uzunluğu 1.75 kat olan embriyolar tekabül etmektedir. Bu aşamada ortaya çıkan morfojenik süreçler esas embriyo 2 anteroposterior ekseni boyunca onların uzama sürücü hipodermal hücrelerinin apikal kutbunda bulunan ipliksi aktin demetleri (FB'ler) kasılmasıyla tarafından tahrik edilmektedir. FBs Daralma üç kinazlar LET-502 / ROCK, MRCK-1 ve PAK-1 5 ile miyozin-hafif zincirlerin fosforilasyon ile kontrol edilmesidir. vücut duvarı kasları işlevsel hale ve taahhüt başlattığınızda uzama geç faz başlar. Bu sırt ve karın hipodermal hücrelere vücut duvarı kasları gelen mechanotransduction sinyalizasyon içerir ve hayvanlar 3 yumurtadan biter.
ve L1 larvaları (Larva tutuklama fenotip olarak bu durdurma onların gelişimi; uzama kusurları genellikle embriyolar olarak ölen hayvanların yüzdesi (Emb Embriyonik öldürücü); ile karakterize edilir Lva) ve ağırlık önemli ölçüde daha kısa olması. gelişimsel duraklama evresi tanımlanması ölü embriyo mikroskobik gözlem gerektirir ve Larva 3-6 tutukladı.
Son zamanlarda, bu Cdc42 / rac regülatörü ve efektör pix-1 ve Pak-1 gibi birçok gen, erken ve geç uzama 3,7 sırasında hem morfojenik süreçlerini kontrol gösterilmiştir. Biz de son zamanlarda morfojenik süreçler erken uzama 3 7 sırasında embriyoların anteroposterior ekseni boyunca farklı olduğunu gösterdi. Bu bulgular, özellikle erken uzama sırasında ön-arka eksen boyunca embriyoların morfolojik karakterizasyonu sağlayan erken ya da geç uzama aşamalarını ve diğer ölçümleri hedefleyen yeni metrik gelişimini motive etti.
Bu yeni yöntemler kendi genişliği yanı sıra başında ve erken uzama sonunda embriyoların uzunluğu ölçülerek ibaret oreklamlar ve kuyrukları. 7 İki protokolleri de L1 aşamada 7'de senkronize yumurtadan yeni çıkmış larvaların uzunluğunu ölçmek için geliştirilmiştir.
larva, yetişkin ve kültür ortamı mevcut bakteri tedavisi ile çözülür ise embriyoların yumurta kabukları alkali hipoklorit muameleye karşı korunmaları. Bu işlem daha sonra besili yetişkin 8 çoğunluğunu ihtiva eden bir senkronize olmayan nüfusu embriyolar saflaştırmak için kullanılır. Gıda kısıtlama yeni yumurtadan larva senkronize etmek için kullanılır. Bu larvaların uzunluğunun ölçülmesi sonra uzama kusurları tespit etmek için kullanılır. yumurtadan larva olmayan tam olarak uzatılmış embriyolar beslerken, "normal uzunluğu" olarak geri ancak gıda yokluğunda yakalandıklarında indirgenmiş büyüklüğünü korumak çünkü bu ölçüm kültür levhaları üzerinde tutuklandı larva ölçülmesi tercih edilmektedir.
Burada, biz le ölçümünü sağlayan ayrıntılı protokolleri mevcutzaman atlamalı DIC mikroskopi ve görüntü analizi (Protokol 1) kullanılarak embriyolar ve bunların baş genişliği ve kuyruk uzatılması ngth. Biz de görüntü analizi (Protokol 2) ve Flow-Sitometri (Protokol 3) kullanılarak senkronize larva uzunluğunu ölçmek için ayrıntılı protokolleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
WT ve Mutant Hayvanlarda Erken Uzama Kusur 1. Karakterizasyonu
- Normarski DIC Mikroskopi için montaj Embriyolar
- Aşağıdaki kültür ortamları ve malzeme hazırlayın:
- M9 tampon, çözülür 12.8 g / L Na 2 HPO 4 • 7H 2, O, 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L NaCl, 0.25 g / L MgSO damıtılmış su ve sterilize edilmesi için otoklav içinde 4 • 7H 2 O.
- NGM plakalar, GKD 2 O 3 g / L NaCI, 16 g / l ağar, 2.5 g / L baktopepton çözülür Otoklav ve 1 mM MgSO 4, 1 mM CaCl2, 1 mM fosfat tamponu ve 5 ug / ml kolesterol ekleyin. 60 mm yemekleri başına NGM 6 ml dökün. karışım oda sıcaklığında 24 saat boyunca katılaşmaya izin verin. E. doymuş bir kültürünün bir kaç damla E. coli OP50 bakteri Luria etsuyu (LB) gece boyunca yetiştirilmiştir. bakteriler 48 saat büyümeye ve 4 ° C'de plakalar depolamak.
- solucan pi oluşturmak içinck. Kısa bir Pasteur pipeti bir 0.01 "çapında platin tel monte bir benzen brülör ile bu ekstremite ısıtarak cam pipet ucuna platin teli bağlayın. kürek bir tür oluşturmak için tel ekstremite düzleştirin.
- 20 ° C'de OP50 ile 60 mm NGM plakalar üzerinde solucan gerginlik büyür.
NOT: Termosensitif alellerin kadar 25.5 ° C'de olmayan müsamahakâr sıcaklıklarda hayvanların büyütülmesi gerekebilir. Tabaklar protokolleri takip etmek için pek çok genç yetişkin ve hala bol miktarda yiyecek içermelidir. - Maskeleme bandı (Şekil 1A) iki kat kapsadığı iki boşluk slaytlar arasında bir mikroskop slayt yerleştirin.
- 30 sn boyunca mikrodalga içinde ısıtılarak 20 mi M9 tampon agaroz bir toz, 0.6 g çözülerek M9 tampon içinde% 3 agaroz çözeltisi (ağırlık / hacim) hazırlayın. Çözelti 5 dakika soğumasını bekleyin.
Not: agaroz çözelti mikrodalga erime sonra bir kaç gün için kullanılabilir. oAyrıca, numune alınır ve hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. - İki aralayıcı-slaytlar arasında yer alan bir cam slayt üzerine sıcak% 3 agaroz solüsyonu damla yerleştirin. kabarcıklar oluşturan kaçının.
- Şekil 1B gösterildiği ve hafifçe bastırın hızla başka bir slayt ile agaroz kapsamaktadır. Üst slayt agaroz damla düzleştirmek ve maskeleme bandı iki kat kalınlığı ile bir ped üretecektir.
- agaroz, oda sıcaklığında en az 1 dakika için ya da embriyolar pedi aktarılır için hazır olana kadar katılaşmasını izin verin.
- Bir solucan maşası kullanarak, M9 tampon 400 ul içeren bir mikro-santrifüj tüpüne NGM plaka 30 iyi beslenen genç yetişkinler için 20 aktarın.
- solucanlar, yaklaşık 5 dakika boyunca yerçekimi tarafından tortu ve bir mikropipet kullanarak süpernatant kaldırmak için izin verin. Bu adım nematod ile çekilen bakterilerin maksimum kaldırmayı amaçlamaktadır.
- Her tüpe M9 tampon 200 ul ekle.
- Pasteur pip kullanarakette, saat camı tüp (tampon ve nematodlar) içeriğini aktarmak.
- (Spermateka ve vulva arasında) orta gövde kısmında hayvanların kesmek için bir veya iki 25G 5/8 "iğne kullanın.
NOT: bisturi bıçağı, aynı zamanda iğne (ler) için bir alternatif olarak kullanılabilir. yüzme nematod bunu yapmak ve biraz pratik gerektirebilir. Fikir makas ya da çok iğne nasıl kullanıldığı bağlı bir bıçak olarak iğneler kullanmaktır. Hayvanlar açık kesilir sonra, çift cinsiyetli tamponu içine embriyo bırakın. - sıvı içinde dairesel bir girdabın nesil boyunca saat camının ortasına embriyolar Konsantre.
- bir mikropipet kullanarak saat camından M9 en çıkarmak. Embriyoların ile M9 yaklaşık 30 ul bırakın.
- Pad onu kaydırarak agaroz ped (Şekil 1B) kapsayan slayt çıkarın.
- (Tam bir lamel ile kapak edebilmek için bir traş makinesi bıçak takımını KesilmişŞekil 1C).
- Pasteur pipeti kullanarak, agaroz ped üzerine tüm embriyolar (ve solucan enkaz) aktarın.
- Grup 200 ul mikropipetler için kullanılan bir ucu ucuna yapıştırılmış bir kirpik kullanarak pedi merkezinde embriyolar.
- Yavaşça kabarcık oluşumunu önleme yastığı bir lamel yerleştirin ve kapağını kapatın.
NOT: Birkaç inşaat macunu kullanılabilir. Biz (genellikle suluboya resim için sakız maskeleme olarak kullanılır) sanat ve zanaat mağazalarında bulunan sakız çizim kullanın. Bu hidrofilik ve katılaştığı oldukça hızlı ve solucanlar toksik olmadığı için bu macunu kullanılmaktadır. Slaytlar ayrıca oje ya da valap (vazelin, Lanolin ve Parafin Balmumu karışımı) ile kapatılabilir. - Yaklaşık 15 dakika boyunca çizim sakız kuru izin verin.
- Aşağıdaki kültür ortamları ve malzeme hazırlayın:
- Erken Uzama Dört boyutlu Normarski DIC Mikroskobu kullanılarak kayıt
NOT: Bu adımın amacı, geç uzama başlangıcına virgül erken uzama kayıt için- Vücut duvarı kasları sözleşme başlattığınızda an olarak tanımlanır. Biz de zaman birden fazla embriyo kayıt hedefliyoruz. kayıt sekiz saat, genellikle senkronize olmayan embriyoların bir grup için erken uzama kaydetmek için gereklidir.- Bir mikroskop sahnede monte-slayt yerleştirin. mikroskop time-lapse mikroskopi ve Z-yığınlarının nesil (otomatik Z-platform) sağlayan 10X ve 60X hedefleri yanı sıra DIC lensler, prizma, kamera ve yakalama yazılımı ile donatılmış olduğundan emin olun.
Not: Sıcaklık mikroskopi oda 20 ile 23 ° C arasında sabit olduğundan emin olun. Bir ısıtma-soğutma odası ısıya mutantlar kullanılarak, özellikle mikroskop aşamasında gerekli olabilir. - 10X objektif kullanılarak ön morphogenesis aşamalarında embriyo bir grup tanımlayın.
- Bir kez 10X objektif kapalı slayt ve slayt petrol daldırma bir damla ekleyin, yer.
- 60X objektif kullanılarak, üst ve e alt belirlemekkurulum mbryos Z-yığın görüntüleme parametreleri.
NOT: embriyoların kalınlığından daha büyük Z-yığını ayarlamak için tereddüt etmeyin. 0.8 mikron olarak iki komşu düzlemleri arasındaki mesafeyi ayarlayın. Bu 35 50 Z-planlarında embriyoların toplam derinliği kapsayacak şekilde sağlayacaktır.
Not: Mikroskop otomatik bir XY platformu içeriyorsa, pedin farklı yerlerde bulunan embriyolar aynı kaydedilebilir. Bunu yapmak için, kayıt xy denemenin seyri sırasında analiz etmek isteyen pad üzerinde her yerin koordinatlarını. Kayıt parametresini ayarlarken xy seçin ve belirtildiği gibi protokol kalanını takip ettiğinizden emin olun. kayıt sırasında embriyonun ince Z kesit mutlaka bu protokolde ayrıntılı ölçümler için gerekli değildir. Maksimum çözünürlükte ağırlık ve mutant hayvanlar embriyonik gelişim kaydedilmesi ancak ek analizler desteklemek mümkün kayıtların bir kütüphane oluşturmak için iyi bir uygulamadır. - Set8 saat süren iki satın almalar arasında 2 dk ara ile time-lapse kadar.
NOT: pozlama süresi mikroskop için belirlenen ışık yoğunluğuna bağlı olacaktır. Erken uzama sırasında hücre hareketi çok yavaş; pozlama zamanı saniye veya daha az başına yaklaşık bir kare olabilir. Embriyolar erken morphogenesis aşamalarında (dorsal ardalanması, ventral muhafaza) iseniz, erken uzama 1 saat içinde kaydedilir. Emin olun ışık deklanşör her edinimi arasındaki kapalıdır. - edinimi çalıştırın ve kaydedin.
- Bir mikroskop sahnede monte-slayt yerleştirin. mikroskop time-lapse mikroskopi ve Z-yığınlarının nesil (otomatik Z-platform) sağlayan 10X ve 60X hedefleri yanı sıra DIC lensler, prizma, kamera ve yakalama yazılımı ile donatılmış olduğundan emin olun.
- Görüntü Analizi kullanılarak Erken Uzama Kusur Ölçümü
- Açık Fiji-ImageJ yazılım ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- Menüde / Set Ölçümleri analiz seçeneğini Perimeter seçin. Her bir embriyo için, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, embriyo yutak odaklanmak Z ölçek çubuğu ayarlayın. Bu embriyonun merkezinde odaklanmak sağlayacaktır. Embriyonun uzunluğunu ölçmek için, erken uzama başlangıcında ilgi embriyo olması için zaman ölçek çubuğu ayarlamak (virgül sahne; Şekil 2A). zaman ( "Zaman başlangıcı") dikkat edin.
- segmentli satırı aracını seçin. Embriyo (Şekil 2A) orta hat aşağıdaki kuyruğunun ucuna kadar embriyonun ağız ucundan bir segmente çizgi çizin. menü sekmesi, / Ölçü Analiz çizilen çizginin uzunluğunu ( "Uzunluk başlangıcı") elde kullanma.
- (Kaslar sözleşme başlattığınızda an) erken uzama sonunda aynı embriyo için bu ölçümü tekrarlayın. ( "Zaman-end") zaman unutmayın ve embriyo (Şekil 2B) yukarıda ayrıntılı olarak ( "Uzunluk-end") uzunluğunu ölçmek.
- Bu, aşağıdaki gibi aşama sırasında erken uzama ve uzunluk artışı (L) süresi (D) hesaplayın:
D = "Zaman-end" - "Zaman başlangıç"
& #160; L = "Uzunluk-end" - "Uzunluk-başlangıç" - Baş genişliğini ölçmek için, faiz (1.2 kat aşamada ya da erken uzama sonu) aşamasında bir embriyo için zaman ölçeği çubuğunu ayarlayın. düz çizgi aracını seçin. Başın enine (dorso-ventral eksen) orta hat çizin. Bu bölüm, embriyo (Şekil 2C) en kalın bir parçasıdır. Menü / Analiz ölçün kullanarak, kafa genişliğine karşılık gelen hattın uzunluğu elde.
- (Şekil 2C bağırsak vana ve kuyruk ucu arasında Orta-line) ve kuyruk genişliği elde etmek için bunu ölçmek Aynı zamanda noktada, kuyruk enine orta hat çizerek bu adımı tekrarlayın.
NOT: Farklı fenotipleri arasında aynı aşamada embriyolar karşılaştırmak için bu ölçümü kullanın. Bu ölçüm tekrarlanabilirliği sağlamak için, kolayca bir hayvandan kabul edilebilir hayvanın kuyruk orta çizgisi etrafında bulunan bir yer bulmak için emin olunnother. - kuyruk genişliği oranı başını hesaplamak için, kuyruk genişliği ile baş genişliği bölün.
Geç Uzama Kusur 2. Karakterizasyonu Görüntü Analizi
- Alkali Hipoklorit Tedavi kullanarak L1 Larva senkronizasyonu
- Birçok gebe yetişkin ihtiva eden bir sigara aç 60 mm levha kaynaktan, M9 1 ml tampon Pasteur pipeti kullanarak plakasından nematodları yıkayarak bir mikro santrifüj tüpü içinde tüm solucanları toplar.
- Sediment nematodlar oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.500 xg'de ve solucan pelet bozmadan bir mikropipet kullanarak süpernatant kaldırmak.
- Her bir tüp (0.4 M, hipoklorit, 0.5 M NaOH) hipoklorit çözeltisi 1 ml ilave edilir ve 3 dakika boyunca sallayın.
NOT: Alkali hipoklorit çözeltisi taze hazırlanmış olmalıdır ve bu çözelti içinde embriyo hafifçe ajite edilmelidir, ancak sürekli EMBR yetişkinler çözülmesini ve oksijenasyonu optimize etmekYÖS. 3 dakika ajitasyon sonra, çoğu yetişkin solüsyon içine yumurtalarını bırakmak gerekir. - pelet bozmadan bir mikropipet kullanarak süpernatant kaldırmak hızla oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.500 xg'de Spin ve.
- 3 dakika boyunca 3500 x g'de santrifüjleme ile, ardından M9 1 ml tampon ile dört kez yıkayın.
- Dördüncü yıkamadan sonra, yumurta (yumurta ucu plastik sopa gibi) yukarı pipetleme olmadan M9 tampon 700 ul supernatant ve tekrar süspansiyon yumurta kaldırmak.
- uygun büyüme sıcaklıkta bir kuluçka makinesi içine yerleştirilmiş bir 3 mm orbital çalkalayıcı üzerinde tüp bant ve bir gece boyunca 600 rpm'de çalkalanır.
- Senkronize Larva uzunluğu ölçümü
- Santrifüj oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.500 xg'de L1 larvaları tutuklandı ve süpernatant kaldırmak. M9 tampon 100 ul larvaları süspanse edin ve bir Pasteur pipeti kullanılarak bir agaroz ped üzerine transfer (agaroz yastıkları hazırlanması olmalıdırd olarak 1.1.8 için bölüm 1.1.2 de açıklanmıştır). pad üzerinde bir lamel yerleştirin.
NOT: pad kısa satın içerir Bu deney için sakız ile mühürlenmiş olması gerekmez. - yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanılması durumunda larva uzunluğunu ölçmek için bir 10X objektif ve faz kontrast aydınlatma kullanın. Larvaları (Şekil 2B) net bir resim birkaç milisaniye içinde görüntüleri yakalayabilir ve dolayısıyla elde edebilmek için ışığın yoğunluğunu arttırın.
NOT: larva yüzme trashes agaroz pad azalır olsa da, yine hareket ediyor. Bu nedenle, hızlı kayıt net bir görüntü elde etmek esastır. - Fiji-ImageJ açın ve adım 1.3.1 tekrarlayın. larva uzunluğunu ölçmek için, segmentli satırı aracını seçin. Larvaları (Şekil 2B, sağ panel) orta hat aşağıdaki kuyruk ucuna baş yukarı ucundan bir segmente çizgi çizin.
- uzunluğunu elde / Ölçü analiz menüsünü kullanarakmikrometre larva uzunluğuna tekabül çizilmiş çizgi.
- Santrifüj oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.500 xg'de L1 larvaları tutuklandı ve süpernatant kaldırmak. M9 tampon 100 ul larvaları süspanse edin ve bir Pasteur pipeti kullanılarak bir agaroz ped üzerine transfer (agaroz yastıkları hazırlanması olmalıdırd olarak 1.1.8 için bölüm 1.1.2 de açıklanmıştır). pad üzerinde bir lamel yerleştirin.
Akım Sitometri Kullanımı Geç Uzama Kusur 3. Karakterizasyonu
- Larva senkronize
- besili genç yetişkinlerin 100 tam mm'lik plakalardan bölüm 2.1'de anlatıldığı gibi alkali hipoklorit tedavisi kullanan embriyolar arındırmak ve embriyo kapak ve 20 ya da 25,5 ° C'de 24 saat için 16 için M9 tampon L1 tutuklama gerginlik bağlı olarak izin analiz edilmiştir.
NOT: suş başına iyi beslenen yetişkin biri tam bir tabak aşağıda açıklanan analiz için yeterli değildir.
- besili genç yetişkinlerin 100 tam mm'lik plakalardan bölüm 2.1'de anlatıldığı gibi alkali hipoklorit tedavisi kullanan embriyolar arındırmak ve embriyo kapak ve 20 ya da 25,5 ° C'de 24 saat için 16 için M9 tampon L1 tutuklama gerginlik bağlı olarak izin analiz edilmiştir.
- Sonsuz Sıralayıcısı kalibrasyonu
Not: Burada kullanılan sitometrisi sitometresi (bundan sonra sonsuz sıralayıcı olarak anılacaktır) geniş bir tanecik akışıdır. solucan sıralayıcı bir nesli dedektör önünde bulunan bir 670 nm kırmızı diyot lazer içerir. Solucan sıralayıcı da floresan uyarma için bir multi-line argon lazer içerir. standard aletleri üç photomultiplier tüpleri yelpazenin, yeşil, sarı ve kırmızı bölgelerde floresan emisyonlarını tespit etmek için kullanılan (PMT) floresan dedektörleri var. Burada anlatılan protokolde, TOF larva boyutunu ölçmek için kullanılacak, kırmızı kanalı Propidyum iyodür (PI) ile boyanmış olan ölü kurt tanımlamak için kullanılacaktır. GP (Genel Amaçlı) Yüksek Floresan Kontrol Parçacıklar Cihazı kalibre etmek için kullanılan ve bizim deneyde bir iç kontrol olarak, yeşil, sarı ve kırmızı yüksek floresan görüntüler. Onlar yeşil kanal tespit yüksek emisyon ile analiz numunede tek nesneler olacak ve daha sonra bu özelliğine göre tespit edilecektir.
NOT: Yaşayan hayvanlar Yeşil ve Kırmızı kanalda yanı sıra TOF üzerinde floresan yokluğuna dayanarak tespit edilir. larvaların bağırsaktan autofluorescent emisyon L1 aşamada saptanabilir değildir.- Lazer bloğu, bilgisayar, kompresör bir açınsolucan sıralayıcı enstrüman d. Cihazın kullanım kılavuzunda belirtildiği gibi açılan solucan sıralayıcı yazılımı START düğmesine basın.
- argon lazer kontrol pop-up penceresini gözlemleyin. RUN modunu seçin ve lazer güçler 10 ± 1 mW ulaşır ulaşmaz bekleyin. Lazer kontrol penceresinde YAPILDI seçin.
- kılıf ve sırasıyla 5.10 ± 0.02 ve 5.51 ± 0.01 örnek baskıları ayarlayın. Basınç en az 15 dakika süreyle dengelenmesi ve BASINÇ Tamam onay kutusunu tıklatarak izin verin.
NOT: debisi kılıf ve örnek baskılara bağlıdır. - Numune kabı ve analiz odası arasında akış kanalı tübüllerinde mevcut tüm kabarcıklar ortadan kaldırmak için emin olun. Bunu yapmak için, kazanmak tıklayın ve (satın alma penceresinde görüldüğü gibi) hiçbir kabarcık edinilen kadar yavaşça tübül fiske.
- Floresan ve TOF ölçüm ve tespiti aşağıdaki şekilde tüm parametrelerin Kurulum:
- TOF, dışsallık, Yeşil, Sarı ve Kırmızı için ölçekler ayarlayınYeşil ve Sarı ve Kırmızı için 900 700 1. Set PMT Kontrol Tablo açıklandığı gibi 256 ayarlayın kazanç.
Not: iki uyarım filtreler (488 nm ve 514 nm) mevcut olup, yeşil flüoresan protein (GFP) veya sarı floresan protein (YFP) veya çoklu argon lazer ile bu dalga boylarında uyarılan bir fluorochromes ya uyarmak için kullanılabilir. Uygun filtreler ekipman filtre odası içinde yerleştirilmiş olması gerekmektedir. Biz şu deney için 488 nm filtresi kullanılmıştır.
- TOF, dışsallık, Yeşil, Sarı ve Kırmızı için ölçekler ayarlayınYeşil ve Sarı ve Kırmızı için 900 700 1. Set PMT Kontrol Tablo açıklandığı gibi 256 ayarlayın kazanç.
- solucan sıralayıcı kalibre etmek için, araç menüsündeki "run kontrol parçacıkları" seçeneğini seçin. fincan 1x GP (Genel Amaçlı) Yüksek floresan hücrelerden oluşan Kontrol Parçacıklar 20 ml (bu parçacıkların Cihazı kalibre etmek için sitometrisi üreticiler tarafından satılan hassas boyut floresan parçacıkların vardır) koyun.
- kılıf ve örnek akışını başlatmak için Al düğmesini tıklayın.
NOT: 21 ± 6 ve ac kontrol parçacık dağılımına ilişkin bir ortalama bekliyoruzbu, ortalama (CV) ≤11 yaklaşık varyasyon oefficient. CV> 11 ve ortalama temiz butonuna birkaç kez tıklayarak ya da akış kanalı iterek tübülleri temizlemek için> 27 deneyin ise.
- Hayvan TOF kazanılması
NOT: Bir nesne lazer kaynağı ve söndürme dedektörü arasındaki akış hücresi geçtiğinde ışık dağıtır. ışık için gereken zaman nesnenin eksenel uzunluğunu ölçmek için kullanılan uçan cisim (uçuş süresi, TOF) tarafından dağınık olması. nesnenin (sönme, EXT) tarafından maskeli ışığın derecesi onun donukluk / optik yoğunluk bir ölçüsü olarak kullanılır.- Senkronize vahşi tip 10 ul koyun (ağırlık) L1 saat camı ve bir mikroskop kullanılarak ölü yumurta yüzdesi tahmin ediyoruz.
Not: ağırlıkça yüksek Emb (daha yüksek% 20) görüntülendiği Senkronize L1 daha fazla analiz için kullanılmamalıdır. - Aktarım mikrosantrifüj dan L1 senkronize (approximately 15 ml konik tüp L1 içeren M9 700 ul). 10 ug / ml (seyreltme 1 mg / ml stok solüsyonundan 1/100 TH) bir nihai konsantrasyonda propidyum iyodür (PI) ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
NOT: Ölü yumurta ve larva PI kullanılarak boyandı ve kırmızı kanalını kullanarak yüksek floresan nesneler olarak tespit edilecektir. - lekeli nüfusu sulandırmak için M9 tampon 10 ml ekleyin. seyreltilmiş nüfusun 5 ml alın ve M9 15 ml ekleyerek onları dört kez sulandırmak. Numune kabının bu seyreltme yerleştirin.
- tıklayarak kazanmak numune akışını çalıştırın ve akış hızını gözlemlemek.
NOT: Doğru ölçüm sahip olmak için, akış hızı / sn 15 ila 25 nesneleri kalmalıdır. - Gerekirse, istenen akış hızını ulaşmak için fincan hayvanların miktarını ayarlayın.
NOT: debisi irade 3.2.3 ve larvalar i konsantrasyonuna belirtildiği gibi sabit bir basınç (kılıf ve örnek) bağlıdırn fincan. Akış hızı daha yüksek 25 nesneler ise / sn fincan bazı tampon ekleyin. daha düşük 15'den nesne / sn fincan (adım 3.3.3 itibaren) konsantre L1 ekleyin ise. - Nesnenin uygun konsantrasyon ulaşıldığında, fincan hacmini değerlendirmek ve Yüksek Floresan GP Kontrol Parçacıklar 4x çözeltisi içinde bu hacmin 1/4 inci ekleyin.
- yolluk ve sıralama parametre ayarlayın. Bunu yapmak için, menüde 'Ayırıcı' tıklayın ve 'TOF vs' seçeneğini ve 'Yeşil'. menüsünden 'Sıralama' tıklayın ve 'TOF vs' ve 'Kırmızı' seçeneğini seçin. Şekil 3A gösterildiği gibi Yolluk ve sıralama grafik sonra görünecektir.
NOT: Bu (Yeşil ve Kırmızı olarak emisyon) kontrol parçacıkların görselleştirme sağlayacak, PI ve kabarcıklar ile boyanan ölü hayvanlar (emisyon Yeşil Kırmızı değil) ve yaşam hayvanlar (Yeşil, ne de kırmızı ne kanallarda herhangi bir emisyon) (Şekil 3A ). - ACQ tıklayarak denemeyi çalıştırmakUire.
NOT: yaklaşık 10.000 nesneleri, yani yaklaşık 8.000 hayvan, larva arasındaki küçük boyut farklılıkları tanımlamak, analiz etmek için. Denemeyi durdurun ve STORE tıklayarak txt formatında veri ihracat.
- Senkronize vahşi tip 10 ul koyun (ağırlık) L1 saat camı ve bir mikroskop kullanılarak ölü yumurta yüzdesi tahmin ediyoruz.
- Senkronize Populasyonlarında Yaşayan Hayvanların Bağıl Büyüklüğü Ölçümü
- Büyük veri tablolarını yönetmek mümkün bir yazılımı kullanarak .txt dosyasını açın.
- analiz nesneler 100 keyfi birimler daha yüksek yeşil kanal emisyon ile karakterizedir kontrol partikülleri ile ilişkili TOF değerleri ayıklamak dan (bu değer bölüm 3.2.5 ayarlanan parametrelere bağlıdır). yeni bir sütun oluşturun ve 'kontrol partikülleri' diyoruz. 'Örnek' olarak adlandırılan kontrol parçacıklar hariç tüm diğer nesneleri içeren bir sütun oluşturun. NOT: Yeni parçacık toplu ihtiyaçlarının floresans emisyon satın almalar başlamadan önce teyit edilmesi gerekmektedir. Bu belirlenmesini sağlayan floresan eşik koyacaktırL1S üzerinde kontrol parçacıklar.
- Her analiz için, suşu akış oranı (nedeniyle, örneğin yumurta tıpası varlığı) değiştirilmiş Deney kısmı tanımlar. Böyle yaparak:
- Bir zaman faktörü (Şekil 3B) ve her bir örnek için kontrol eden partiküllerin TOF çizilir.
- çizgisi aracını kullanarak doğrusal eğilim çizgisi çizin ve grafik denklemi görüntüler.
Not: Kontrol parçacıkların TOF zaman içinde sabit olmalıdır (yatay çizgi, Şekil 3B). Veri y = ax + b çizilen doğrusal eğilim çizgisi denklemini göz önüne alındığında, 'a' değeri ne kadar düşükse o 10 -4 olduğundan emin olun. Kontrol parçacığın uyum içinde bir kopma görüntülendiği zaman bölümlerinde yapılan tüm ölçümler analiz çıkarılmalıdır.
- daha düşük 10 ve yüksek TOF ölü embriyolar ve kabarcıklar (kırmızı emisyon daha yüksek 15) yanı sıra küçük enkaz ve büyük yumurta tapaları (Kaldırer) sırasıyla 70 den 'örnek' ölçümden.
- analiz her bir suş için 'kontrol partiküllerin dağılımını çizilir. Şekil 3C görüldüğü gibi bu dağıtımlar neredeyse mükemmel bindirmek gerekir. Bu, farklı cinsleri için elde edilen TOF ölçümleri karşılaştırılabilir sağlar. NOT: Bir numunedeki kontrol parçacıklarının dağılımları kontrol numunelerinin bununla bindirme yoksa kontrol parçacıkları kullanılabilir üzerinde TOF örnek elemanlarının normalleştirme. takip normalize TOF hesaplanır:
- Ağırlık kontrol numunesi olan genotip G = (G örnek TOF) / (G ortalama 'kontrol parçacık' TOF) x (ortalama 'kontrol parçacık' ağırlıkça için TOF) için TOF normalleştirmek.
- Hayvanlar ağırlıkça bizim durumumuzda (Şekil 3D) 'de, kontrol numunesi dahil olmak üzere her bir suş için Larva TOF dağıtım çizilir. (Her nüfus için ortalama ve ortalama (SEM) standart hatası ölçün
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baş, bagaj ve Baş / Kuyruk genişliği Oranı Sağlam Metrik vardır.
Burada anlatılan protokoller başarılı düzenleyiciler ve Rho GTPases pix-1 efektör işlevini, pak-1 karakterize ve let-502 erken uzama 7 sırasında kullanılmıştır. Bir guanin-değişim faktörü pix-1 ve sırasıyla pak-1 kod (GEF) ve RHO'daki-1 7 için bir efektör için Rac / Cdc42 GTPases için özel ve let-502 kodlar bir efektör. Bu çalışmada, PIX-1 ve PAK-1 ilk uzama 7 esnasında epidermal morfojenezi kontrol gösterildi. metrik olarak bu çalışma kullanılan baş ve kuyruk genişliği ölçümü, ilk kez ön emb bulunan bu hipodermal hücrelerini göstermektedirryo kendi posterior 7 bulunan daha farklı morfojenik programlarını takip. Bu ölçümlerin tekrarlanabilirliği ve sağlamlığı kurmak için, baş genişliği 1.2 kat aşamada bağımsız 12 yabani tip (wt) embriyolar üzerinde beş kez ölçüldü. Bir grup için ölçümlerin düşündüren; ölçüm beş farklı gruplar arasında varyansları karşılaştırıldı sonra ölçümlerin arasında anlamlı farklılık (Şekil 4A F testi p değeri> 0.5) ortaya (R istatistik paketi kullanılarak) Brown-Forsythe testi kullanılarak değerlendirildi embriyoların tekrarlanabilir. Bu ölçümler ile bağlantılı tekrarlanabilirlik ve parti etkilerinin değerlendirilmesi üç farklı gün (n = 12 embriyo) üzerinde yapılan 4D-DIC görüntüleme 1.2 kat aşamada ağırlık embriyoların baş genişliğinin ölçümü yoluyla yapıldı. Bu üç ölçüm gruplar arasında, varyans önemli ölçüde farklı değildi ve anlamlı toplu etkisi baş w darbeye bulundulikli ölçüm sonuçları (F-testi p-değeri> 0.5; Şekil 4B).
Benzer sonuçlar kuyruk genişlik ölçümleri ve erken uzama farklı aşamalarında yapılan ölçümler için elde edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu veriler erken uzama kusurları karakterize etmek için sağlam metrik olarak baş-genişliği, kuyruk genişliği ve baş / kuyruk genişliği oranını kurdu.
Baş ve Kuyruk Genişlik yanı sıra Embriyolar Uzunluğu Ölçme Embriyo ve Antero-posterior ekseni boyunca Erken Uzama Kontrol Genler Karakterizasyonu için izin verir.
Embriyoların uzunluğu, hem de baş ve kuyruk genişliğinin ölçümü taşıyan wt ve mutant embriyo üzerinde yapıldı erken uzama kontrol eden gen fonksiyonu allel kaybı güçlü null veya ısıya: pix-1 (gk416);(ok448)-1 pak ve let-502 (sb118ts) 7. Bu kafa / kuyruk (H / T) başlangıçta wt ve mutant embriyoların genişlik oranı (1.2-kat aşamada) ölçüldü ve non-permisif sıcaklıklarda erken uzama sonunda (Şekil 4C sol ve sağ panel) mevcuttur. Erken uzama başında hiçbir tarafındaki değiştirme ya da daha düşük bir H varken / T oranı pak-1, PIX-1 gözlendi ve let-502 mutantlar wt hayvanlarda (1.2 kat aşamada, Şekil 2C, sol panele kıyasla Şekil 4C;; sağ panel)), erken uzama sonunda her üç mutant ağırlık embriyolar önemli ölçüde daha yüksek H / T oranı (t-testi p-değerleri <0.006 gösterdi. Bu pix-1, pak-1 ve let-502 mutant embriyoların erken uzama sonunda anormal ön-arka morfolojisi görüntüler ortaya koymuştur. Daha fazla analiz kafa genişliği karşılaştırma ve kuyruk betwee genişliği1.2 kat sahne ve aynı ölçüm parametreleri kullanarak erken uzama sonu n kafa genişliği daha az, PIX-1 pak-1 azaltılmış ve let-502 mutantlar kuyruk genişliği let-502 mutantlar önemli ölçüde daha az azaltır olduğunu ortaya sadece 7. Pix-1 ve pak-1 kontrol morfojenik süreçler embriyo 7 ön kısmında ağırlıklı olarak meydana gelen ise bu, embriyonun anteroposterior ekseni boyunca benzer olduğunu let-502 kontrol morfojenik süreçleri ortaya çıkardı. Erken uzama (Şekil 4D) başlangıcında karşı ucunda embriyoları arasındaki uzunluk farkı da ölçülmüştür. Bu tek başına önemli ölçüde elongatio azaltmaya yetecek karşılaştırıldığında erken uzama anlamlı pix-1 ve PAK-1 mutant ön morfojenezinin değişikliğin öne ağırlıkça PAK-1, PIX-1 azaltılmış ve izin-502 mutantlan olarak bulunduembriyonun n.
Protokol 2 ve 3 wt ve mutant arka tutuklandı larva uzunluğunu belirlemek için kullanıldı. (; Yayınlanmamış veri Protokolü 3), bu larvaların uzunluğu hem görüntü analizi (Protokol 2) 7 ve akış sitometri kullanılarak değerlendirildi. Sağlam ve yüksek tekrarlanabilir bir şekilde (Şekil 5A) içinde mikrometre içinde hayvanların uzunluğunun mutlak ölçümlerde görüntü analiz sonuçlarını kullanarak larva uzunluğunun ölçülmesi. Bu analiz, ağırlıkça (Şekil 5A) ile karşılaştırıldığında senkronize mutant larva görüntüleme önemli ölçüde uzunluğu azalttığını ortaya 7. Akış sitometri tabanlı bir protokol (Protokol 3) ile, bu larvaların ölçümü benzer sonuçlar (Şekil 5B) vermiştir. Bununla birlikte, ikinci bir yaklaşım kullanılarak ölçülmüştür larva sayıda önemli ölçüde genotip karşılaştırması (t istatistiksel sağlamlığını artış olduğuna dikkat edilmelidir - Test p-değerleri <10 -24). Bu bulgulara dayanarak, akım sitometri yaklaşım çok ince uzama kusurları göstererek mutant hayvanlar karakterize etmek amacıyla görüntü analizi üzerinde daha iyi bir seçim olabilir.
Agaroz Pad 1. Hazırlık Şekil. Bant. B maskeleme iki kat kapsadığı iki boşluk-slaytlar arasına yerleştirilen A, Mikroskop slayt, agaroz ped iki boşluk-slaytlar tarafından desteklenen başka bir slayt ile kaplıdır. C, ile kestikten sonra son şeklini ve agaroz pad boyutu bir jilet lamel sığdırmak için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
g2.jpg "/>
. Şekil 2. Erken ve Geç Uzama Defektlerde Ölçüm A - B, virgül aşaması (A) bir embriyo uzunluğu ve erken uzama (B) sonunda ölçülmesi. Embriyoların ölçmek için kullanılan kırmızı çizgi, (solda) 1.2 kat aşamada ve erken uzama (sağda) sonunda embriyolar ölçülür ImageJ. C, Baş ve kuyruk genişliği segmentli satırı aracını kullanarak çekildi. Oklar ölçülen alanların lokalizasyonu temsil (Martin ve ark modifiye., 2014). Ölçü bar:. 20 um D, larva uzunluğu senkronize L1-larvaları için ölçülür. Sağ panel yakalanan görüntü (sol) büyütülmüş bir görünüşüdür. kırmızı çizgi ImageJ segmentli satırı aracını kullanarak çekildi. Larva uzunluğunu ölçmek için kullanılır. Ölçek çubuğu:. 100 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Akış sitometri. A, Ayırıcı ve Green ve kontrol parçacıkların Kırmızı emisyonu gösteren COPAS Biosort sıralama penceresini kullanarak Senkronize Larva uzunluğu Şekil 3. Ölçme, (ölü ve Time-Of-Flight göre yaşayan hayvanlar, TOF kabarcıklar ). B, Örnek deney için farklı zaman noktalarında kontrol parçacıklarının TOF. Zamana karşı TOF doğrusal fonksiyonu eğim kontrolü parçacıklarının TOF deney boyunca zaman içinde sabit olduğunu gösteren, yaklaşık 10 -5 olan.: C, dağılımların maksimal değerinin bir yüzdesi olarak ifade edilen, kontrol partikül TOFs dağılımı. Sigara normalize ve normalize kontrol parçacık dağılımları için temsil edilir pak-1 (ok448). Diğer dağıtımlar normalize değildir. D yaşam için TOFs dağıtımıHayvanlar dağılımların maksimal değerinin bir yüzdesi olarak ifade edilmiştir. TOFs belirtildiği gibi pak-1 (ok448) hariç, kontrol parçacıkları üzerinde normalize değildir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Pix-1, Pak-1 ve Let-502 Mutantlar Günümüze Erken Uzama Kusur. A - B, baş Tekrarlanabilirlik ve sağlamlığı değerlendirme ölçümleri genişliği A, 1.2 kat aşamada (n = 12 embriyolar) de ağırlık embriyolar için kafa genişliği beş bağımsız ölçümleri.. Ortalamalar ve standart sapmalar (hata çubukları) gösterilir. ölçümler arasında anlamlı olmayan (ns) farklar Brown-Forsythe testi kullanılarak hesaplandı (biziing R istatistik paketi) (F-testi p değeri> 0.5). B, üç farklı günde (n = 12 embriyolar wt embriyolar Baş genişliği ölçümü). Ortalamalar ve standart sapmalar da belirtilmiştir; Ölçümler arasında Varyans anlamlı bir fark yoktu (ns; Brown-Forsythe F-testi p değeri> 0.5) C, kafa / kuyruk genişlik oranı dağılımı erken sonunda 1.2 kat aşamada (sol panel), en. ağırlıkça uzama (sağ panel), pIX-1 (gk416), Pak-1 (ok448) ve 23 ° C'de izin-502 (sb118ts) mutantlar - 24 ° C. Arasındaki bu çalışma için kullanılan let-502ts embriyoların anne 25.5 ° C. D, ağırlık olarak uzama, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) Dağıtım büyütüldü unutmayın ve let-502 (sb118ts) mutantlar virgül sahne ve geç uzama başlangıç. Kutu araziler min, max, 25 inci, 50 inci (ortanca) ve 75 temsilnüfusun inci yüzdelik. * T-testi p-değeri <0.05, ** t-testi p-değeri <0.006 (Martin ve ark modifiye., 2014). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) ve L et-502 (sb118ts) Larva Mevcut Uzunluk Kusurları. Ağırlıkça ölçülen larvaların A, Uzunluk, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) ve let-502 (sb118ts) hayvanlar görüntü analizi (Protokol 2). B, akış Sitometreyi kullanılarak ölçülen Bağıl larva uzunluğu (kullanılarak ölçülen protokol 3). Parantez içindeki sayılar th için kullanılan hayvanların sayısına tekabüle ölçümleri. uzunlukları ve ortalama standart hata araçları (SEM; hata çubukları) temsil edilir. P değerleri -test Student t. (P) gösterilir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol erken karakterize etmek roman ölçümleri ve embriyonik uzama geç evreleri açıklar.
1. bölümde, kritik bir adım pad üzerinde bakteri potansiyel varlığıdır. Embriyolar hermetik pad ve görüntü alımı sırasında lamel arasında içine alınır. slayt Sızdırmazlık iki saatten fazla süren edinimi sırasında hayvanların kuruma önlemek için gereklidir. Bildiğimiz kadarıyla, slayt ve lamel arasındaki agaroz pedleri monte etmek için kullanılan sızdırmazlık hiçbiri hava geçirgen bulunmaktadır. bakteriler (ya da embriyo) büyük bir ped üzerinde mevcut olduğunda Sonuç olarak, kendi erken ölüme yol açan, bir kaç saat sonra, oksijen yoksun olabilir. üç kat embriyoların sahip - olmayan uzatılmış embriyoların karşılaştırıldığında uzunluğu 3 kat olan embriyolar tekabül - Potansiyel hipoksik koşullar iyi bir göstergesi olacaktır ilgi embriyoları ile birlikte kaydedilen bu embriyolar thei hareket durur berioksijen yokluğunda R yumurta kabukları. Hiçbir morfolojik ölçümler hipoksik koşullar ya da ölü embriyolar üzerinde yapılmalıdır.
time-lapse görüntüleme kullanarak başka kritik bir adım embriyo gelişimi oluştuğu sıcaklıktır. Isı duyarlı mutantlar şu C'de kullanılan elegans. Sıcaklık kayması biyolojik etkisi hızlı olabilir veya proteinin yarılanma ömrü ve onun taşıyan mutasyon doğasına bağlı olarak ertelenebilir. Dolayısıyla, embriyo maruz kaldığı sıcaklık zaman içerisinde sabit olmalı ve mikroskop sahnede mikroskopi oda ya da ısıtma-soğutma bölmesinin uygun bir havalandırma ile kontrol edilmelidir.
Bölüm 2 alkali hipoklorit tedavisi ile larvalar senkronizasyonu bağlıdır. Belirli koşullar altında, bu tedavi embriyonik öldürücülüğü (Emb) yol açabilir. Ağırlık popülasyonda% 20'nin üzerinde Emb hipoklorit tedavi sırasında yüksek bir toksisite göstermektedirolumsuz morfolojilerinden etkileyebilir ment. Ağırlık arka yüksek Emb görüntülendiği Senkronize L1 daha fazla analiz için kullanılmamalıdır. Bu kısıtlama, protokol 3 için de geçerlidir.
Biz larva hareketsiz anestezik ilaçların kullanımını tavsiye etmiyoruz. Levamisol özellikle deneysel önyargı tanıtan larvaları küçültmek eğilimindedir kas tetani indüksiyonu yoluyla nematod hareketsiz. maruz kalma süresi mikroskop sınırlamaları nedeniyle yeterince hızlı değildir, biz pedde agaroz konsantrasyonu artar ve yastık ve kapak arasında sıvı miktarını azaltarak larva motilitesini azaltan önerilir. Bakım kurutma boyutlarını azaltır, çünkü larva kurutulması için değil, ancak alınmalıdır.
3. bölümde, larvaların uzunluğu ölçümleri analiz numuneleri arasındaki akış oranlarının karşılaştırılması kullanılır. Bunu yapmak için, kontrol parçacıklarının dağılımı iştigal olması gerekirkırmızı. Bu değerler normalize olması gerekmez eğer tam bindirme dağılımları ise, TOF (time-of-flight) örnekleri karşılık gelen elde edilen değerler, mukayese edilebilir. (3.4.5.1 ayrıntıları verildiği gibi) PAK-1 (ok448) (Şekil 3C ve Şekil 5B) için gösterildiği gibi, kontrol parçacıkları-TOF fazla numune TOF normalizasyonu başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. Ağırlıkça vs Pak-1 (ok448) göreceli uzunluğu ve normalizasyonsuz en az 3 bağımsız deneyde benzer olduğu tespit edildi (veriler gösterilmemiştir). küçük boy farklılıkları ile larva karşılaştırarak özellikle Ancak, biz onsuz elde edilenlerle normalleşme elde edilen sonuçların teyit tavsiye ederiz. Akış sitometri kullanılarak larva uzunluğu ölçümleri, larva yerine görüntü analizi gibi mikrometre mutlak uzunluğu ağırlıkça, bu durumda, bir kontrol numunesine uzunluğu göreli sağladığı not edilmelidir. Bu, bağımsız deneyden gelen ölçümler olamaz imaağırlıkça üzerinde boyut oranını hesaplama sürece kombine edilebilir.
Örnek kap içinde seyreltme için kullanılan tampon akış oranı üzerinde bir etkiye sahip olacaktır. Biz üretici tarafından önerilen kılıf tampon alımı sırasında oluşan kabarcıkların miktarını artırır deterjanı içerdiği görülmektedir. deterjan içermeyen, M9 tampon kullanarak, önemli ölçüde kabarcık oluşumunu azaltmakla birlikte, numune akış oranına etki sıralayıcı, tübülleri yumurta tıkanması kaçınmak daha az etkili oldu. Yumurta tıkanması kolayca birkaç saniye de yüksek bir TOF- ardından bir kaç saniye için kontrol parçacıkların gözlemlenebilir TOF belirgin bir azalma ile satın alma sırasında tespit edilir. Yumurta takmayı da kanalın tıkanması ve parçacık akışı (saniyede az olduğu 5 nesneler) tam tutuklama yol açabilir. Bu meydana gelirse debi geri gelene kadar, TEMİZ butonuna tıklayınız. Bu olay sırasında meydana gelen her türlü ölçümlersn veri analize dahil edilmelidir. Kılıf tampon ölü yumurtaların yüksek oranlarda ile karakterize suşları içeren deneyler için tavsiye edilebilir.
(Aşama 3.2.3 ayarlanır) bir numune ve kılıf basıncı, zamanla (biraz) değişebilir ve çok sabit bir akış hızı sağlamak için deney boyunca elle ayarlanması gerekmektedir. Sonuçları analiz etme ve zaman (Şekil 3C) üzerinde kontrol parçacıkların TOFs komplo yaparken azaltılması veya düşük oranda artış gözlemlenebilir olacak. akış hızı artışı karşısında neden olurken akış hızının azaltılması, zaman içinde parçacıkların ortalama TOFs artmasına neden olur. akış hızının değiştirilmesi olumsuz larva popülasyonları arasındaki küçük boyut farklılıkları tespit yönteminin duyarlılığını etkileyecektir.
uzama kontrol genleri tanımlamak için amaçlayan ve zaman atlamalı mikroskopi kayıt gerektiren yöntemleri genellikle yüksekBirkaç genotipleri fenotipleme zaman ly zaman alıcı ve sıkıcı. tüm laboratuvarlar için geçerli değildir ekipman gerektiren iken akış sitometresinde-temelli yaklaşım, daha az zaman alıcı ve birkaç suşları karakterize gerektiğinde dolayısıyla daha verimli. (Mutant ve ağırlık TOF dağılımları karşılaştıran öğrencinin t-testi ile değerlendirildi; Şekil 5A ve B) Bu yöntem görüntü analizi kullanılarak ölçümlere göre de daha istatistiksel sağlamdır. Bu yöntem, daha sonra düşük ekspressivite / penetre uzama kusurları ifade suşlar için oldukça uygun olabilir.
Akış sitometri kullanılarak çeşitli yöntemler nematod 9-12 kondisyonunuzu ölçmek için geçmişte geliştirilmiştir. Bu yöntemler, 96 çukurlu bir levha ve sonsuz sıralayıcı 'Refleks modülünde tevzi hayvanların kullanımı. Refleks modülü 96 oyuklu plakalar içinde tevzi nematod nüfusun doğrudan analiz edilmesini sağlar. Sonuç olarak, bu yöntemler, karakterize, mümkünbir senkronize olmayan nüfusun uygunluğu ölçmek için sağlam bir şekilde günde koşulları yüzlerce rize ve oluşturmaktadır. Onlar, ancak iyi senkronize L1 arasındaki küçük boyut farklılıkları tanımlamak için uygun değildir. L1 larvalarının arasındaki küçük farklar ölçümü 96 oyuklu plakalar ve verimli bir şekilde göz başına en fazla 100 nesne karakterize edilebilir Refleks modülünün kullanımı ile uyumlu olmayan bir hayvan çok sayıda boyunca ölçümünü gerektirir. Burada tarif edilen yöntem, önemli ölçüde azalır throughput pahasına, bu amaç için tasarlanmıştır. Bu protokolde 2 görüntü analizi kullanılarak üzerinde belirgin bir iyileşme olduğunu alet kalibre saatte bir 3 ila 4 koşulların karakterizasyonu, sağlar.
Baş ve kuyruk genişliği oranı ölçümü embriyo 7 anteroposterior ekseni boyunca dengesiz meydana morfojenik süreçleri karakterize etmek geliştirilen ilk yöntemdir. Ne zamanErken uzama kontrol etmek için gösterilen genlere uygulandığı, bu yöntemler bu aşamada morfolojilerinden kontrol sinyal yollarının mekansal dağılımını açıklığa kavuşacaktır. Görüntü analizi ya da erken uzama sonunda embriyo uzunluğunun ölçülmesi ile kombinasyon halinde akış sitometrisi kullanılarak tutuklandı larva uzunluğunun ölçümü yüksek hassasiyet ve kesinlik ile erken veya geç uzama veya her ikisi de kontrol eden genlerin tanımlanmasını sağlayacaktır. Bu prosedürler sonra C. embriyonik uzama kontrol sinyal yollarının zamansal ve mekansal düzenlemenin gelecek anlaşılmasına önemli katkıda bulunabilir elegans. Ayrıca, bu yaklaşımlar aynı zamanda insülin ve TGF-beta gibi vücut uzunluğu kontrol sinyal yolları incelemek için adapte edilebilir çevresel kirleticiler 15, 16 13, 14 ve kronik maruziyet yolları. Bu ölçümler usin farklı larva aşamasında veya yetişkin yapılabilirL1 Protokoller 2 ve 3. Ölçme büyüklüğü farklılıkları g küçük varyasyonlar gibi L3, L4 larva veya yetişkin gibi büyük nesneleri daha solucan sıralayıcı ile daha zordur. Protokol 3 daha sonra kolayca bu ölçümleri yapmak için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
