Introduction
Depuis près de 50 ans , les nématodes Caenorhabditis elegans est établi comme un modèle puissant pour étudier des questions importantes dans le développement, la neurobiologie, l' évolution, les interactions hôte-pathogène, etc. 1 La force de ce modèle dans l'étude du développement réside dans: son cycle de vie court de 3 jours; la facilité avec laquelle ces animaux peuvent être génétiquement modifiées; sa transparence qui permet l'observation du déplacement de la cellule et de la morphologie des animaux vivants et de son développement qui est la plupart du temps extra-utérine. Les stades de développement du nématode impliquent l'embryogenèse et quatre stades larvaires (L1 à L4), suivie par l'âge adulte. Au cours du développement embryonnaire, épidermique morphogenèse a attiré une attention considérable pour sa capacité à permettre une meilleure compréhension de la façon dont épithéliales cellules migrent en tant que groupe, comment ils réorganisent leurs jonctions et modifier leur morphologie individuelle, ainsi que leur positionnement relatif dans un épithélium fonctionnel.Epidermal morphogenèse est divisé en quatre étapes: intercalation dorsale consistant en la réorganisation des cellules épidermiques dorsale, appelée l'hypoderme; enceinte ventrale, consistant à la migration des cellules hypodermiques ventrale vers la ligne médiane ventrale enrobant ainsi l'embryon dans une monocouche de cellules épithéliales; début et fin de l'allongement transformer l'embryon en forme de haricot en larves vermiform. Après morphogenèse, embryon éclosent et les larves L1 commencent à se nourrir en utilisant des bactéries disponibles dans leur environnement immédiat.
allongement embryonnaire est donc une phase tardive du développement embryonnaire. Il est constitué de l'extension de l'embryon, le long de son axe longitudinal, et une réduction de son diamètre transversal. Cela implique une modification spectaculaire de la forme des cellules hypodermiques. Allongement est divisé en un début et une phase tardive. La première phase commence au stade de la virgule et se termine lorsque les muscles corps à parois commencent à contracter à l' étape 1.75 fois dans wild type ( en poids) des embryons - correspondant à des embryons qui sont 1,75 fois la longueur par rapport à des embryons non-allongée. Morphogenèse se produisant à ce stade sont principalement motivés par la contraction des faisceaux filamenteux d'actine (FB) situés au pôle apical des cellules hypodermiques qui conduisent leur allongement le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon 2. Contraction de FBs est le contrôle par phosphorylation des chaînes de myosine-lumière par trois kinases LET-502 / ROCK, MRCK-1 et PAK-1 5. La phase tardive de l'allongement, commence lorsque les muscles corps à parois deviennent fonctionnels et commencent à contracter. Elle implique la signalisation de transduction mécanique des muscles corps de paroi aux cellules dorsale et ventrale hypodermiques et se termine lorsque les animaux éclosent 3.
les défauts de Allongement sont généralement caractérisés par le pourcentage d'animaux qui meurent comme des embryons (létalité embryonnaire; Emb) et ceux d'arrêter leur développement en tant L1 larves (larvaire arrestation phénotype; Lva) et étant sensiblement plus courte que poids. Identification de la scène de l' arrestation de développement nécessite une observation microscopique des embryons morts et arrêté Larves 3-6.
Il a été récemment montré que plusieurs gènes, comme le régulateur / Cdc42 Rac et effecteur pix-1 et pak-1, contrôlent la morphogenèse au cours précoce et tardive allongement 3,7. Nous avons récemment montré que morphogenèse diffèrent selon l'axe antéro-postérieur de l'embryon lors de l' allongement précoce 3 7. Ces résultats ont motivé l'élaboration de nouvelles mesures ciblant spécifiquement les étapes d'allongement précoce ou tardive et d'autres mesures permettant la caractérisation de la morphologie des embryons le long de leur axe antéro-postérieur lors de l'allongement précoce.
Ces nouveaux procédés consistent à mesurer la longueur des embryons au début et à la fin de l'allongement précoce, ainsi que la largeur de leur ilannonces et les queues. 7 Deux protocoles ont également été développés pour mesurer la longueur des larves nouvellement écloses, synchronisé à l' étape L1 7.
Les coquilles des embryons de les protéger contre le traitement d'hypochlorite alcalin alors que les larves, les adultes et les bactéries présentes dans les milieux de culture sont dissous par le traitement. Ce traitement est ensuite utilisé pour purifier les embryons provenant d' une population non synchronisée contenant une majorité des adultes bien nourris 8. La restriction alimentaire est utilisé pour synchroniser les larves nouvellement écloses. Mesurer la longueur de ces larves est ensuite utilisé pour détecter des défauts d'allongement. Cette mesure est préférable à la mesure des larves arrêtés sur des plaques de culture parce que les larves qui éclosent de non-entièrement embryons allongés peut récupérer à "longueur normale" lors de l'alimentation, mais maintiendra leur taille réduite lors de son arrestation en l'absence de nourriture.
Ici, nous présentons des protocoles détaillés permettant la mesure du chierngth d'allonger les embryons ainsi que la largeur de la tête et la queue à l'aide de time-lapse DIC microscopie et l'analyse de l'image (Protocole 1). Nous fournissons également des protocoles détaillés pour mesurer la longueur des larves synchronisée par analyse d'image (protocole n ° 2) et Flow-cytométrie (protocole n ° 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Caractérisation des défauts Allongement précoce dans WT et mutantes Animaux
- Embryons de montage pour Normarski DIC Microscopie
- Préparer les médias et le matériel de culture suivants:
- M9 tampon, dissoudre 12,8 g / l de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O 3 g / KH 2 PO 4, L 5 g / L de NaCl, 0,25 g / l MgSO 4 • 7H 2 O dans de l' eau distillée et l' autoclave pour stériliser.
- Des plaques NGM, dissoudre 3 g / L de NaCl, 16 g / l d' agar, 2,5 g / l bactopeptone dans ddH 2 O. Autoclaver et ajoute 1 mM de MgSO 4, 1 mM CaCl2, 1 mM de tampon phosphate et de 5 ug / ml de cholestérol. Verser 6 ml de NGM par boîtes de 60 mm. Laisser le milieu se solidifier pendant 24 heures à température ambiante. Ajouter quelques gouttes d'une culture saturée de E. bactéries OP50 coli cultivées dans du bouillon de Luria (LB). Laissez les bactéries se développent pendant 48 heures et de stocker les plaques à 4 ° C.
- Pour générer le pi verck, monter un fil de platine 0,01 "de diamètre sur une pipette Pasteur courte. Fixer le fil de platine à l'extrémité de la pipette de verre en chauffant cette extrémité avec un brûleur de benzène. Aplatir l'extrémité du fil pour générer une sorte de pelle.
- Cultivez la souche ver sur 60 mm plaques NGM avec OP50 à 20 ° C.
NOTE: allèles thermosensibles peuvent exiger de plus en plus les animaux à des températures non permissives jusqu'à 25,5 ° C. Les plaques doivent contenir beaucoup de jeunes adultes et encore beaucoup de nourriture afin de poursuivre les protocoles. - Placez une lame de microscope entre deux lames d'espacement couvertes par deux couches de ruban de masquage (figure 1A).
- Préparer une solution d'agarose à 3% (poids / volume) dans du tampon M9 en dissolvant 0,6 g de poudre d'agarose dans 20 ml de tampon M9 par chauffage au micro-ondes pendant 30 secondes. Laisser la solution refroidir pendant 5 min.
NOTE: La solution d'agarose peut être utilisé pendant quelques jours après la fusion dans un four micro-ondes. Ilpeut également être aliquotés et conservés à 4 ° C pendant une semaine. - Déposer une goutte de solution d'agarose à 3% à chaud sur la lame de verre située entre les deux diapositives d'espacement. Eviter la formation de bulles.
- Couvrir rapidement l'agarose avec une autre diapositive comme le montre la figure 1B et appuyez doucement. La lame supérieure va aplatir la goutte d'agarose et générer un tampon avec l'épaisseur de deux couches de ruban adhésif.
- Permettre à l'agarose se solidifie pendant au moins 1 minute à la température ambiante ou jusqu'à ce que les embryons sont prêts à être transférés dans le tampon.
- Avec une pointe à vis sans fin, transférer 20 à 30 jeunes adultes bien nourris de la NGM-plaque dans un tube de micro-centrifugeuse contenant 400 pi de tampon M9.
- Autoriser les vers dans les sédiments par gravité pendant environ 5 minutes et retirer le surnageant à l'aide d'une micropipette. Cette étape vise à éliminer le maximum de bactéries cueillies avec les nématodes.
- Ajouter 200 pi de tampon M9 à chaque tube.
- L'utilisation d'un pip Pasteurette, transférer le contenu du tube (tampon et nématodes) à un verre de montre.
- Utilisez un ou deux 25G 5/8 "aiguilles pour couper les animaux à la section du milieu du corps (entre la spermathèque et la vulve).
REMARQUE: une lame de scalpel peut également être utilisé comme une alternative à l'aiguille (s). Pour ce faire, sur les nématodes de natation et peut nécessiter une certaine pratique. L'idée est d'utiliser des aiguilles comme des ciseaux ou un couteau selon le nombre d'aiguilles sont utilisées. Une fois que les animaux sont coupés ouverte, hermaphrodites libèrent leurs embryons dans le tampon. - Concentrer les embryons au centre de la glace de la montre par la génération d'un tourbillon circulaire au sein du liquide.
- Retirer la plupart des M9 du verre de montre à l'aide d'une micropipette. Laissez environ 30 pi de M9 avec les embryons.
- Retirer la lame recouvrant le coussin agarose (figure 1B) en le faisant glisser le pad.
- Couper le tampon avec une lame de rasoir afin d'être en mesure de couvrir complètement avec une lamelle (La figure 1C).
- En utilisant une pipette Pasteur, transférer tous les embryons (et les débris de ver) sur le tampon d'agarose.
- Groupe les embryons au centre du pavé en utilisant un cil collé à l'extrémité d'une pointe utilisée pour 200 micropipettes ul.
- Lentement placer une lamelle sur le pad en évitant la formation de bulles et de le sceller.
NOTE: Plusieurs scellants peuvent être utilisés. Nous utilisons la gomme trouvés dans l'art et les magasins d'artisanat (généralement utilisé comme masquage de la gomme pour la peinture aquarelle) dessin. Cette gomme est utilisée parce qu'elle est hydrophile et se solidifie suffisamment rapide et ne sont pas toxiques pour les vers. Les diapositives peuvent également être scellé avec du vernis à ongles ou valap (mélange composé de vaseline, de lanoline et la cire de paraffine). - Laisser le dessin sec de gomme pendant environ 15 min.
- Préparer les médias et le matériel de culture suivants:
- Enregistrement précoce Allongement utilisant quatre dimensions Normarski DIC Microscopie
NOTE: L'objectif de cette étape est d'enregistrer un allongement début de la virgule au début de la fin de l'allongement- Défini comme le moment où les muscles corps à paroi commencent traitance. Nous visons également à enregistrer plus d'un embryon à l'époque. Huit heures d'enregistrement sont généralement nécessaires pour enregistrer un allongement tôt pour un groupe d'embryons non synchronisés.- Placez le-coulisseau monté sur la scène d'un microscope. Assurez-vous que le microscope est équipé de 10X et 60X objectifs, ainsi que des lentilles DIC, prisme, appareil photo et le logiciel de capture permettant la microscopie time-lapse et génération de Z-piles (automatisé Z-plateforme).
REMARQUE: veiller à ce que la température est constante entre 20 et 23 ° C dans la salle de microscopie. Une chambre de chauffage et de refroidissement peut être nécessaire sur la platine du microscope, en particulier lors de l'utilisation des mutants thermosensibles. - Identifier un groupe d'embryons à des stades pré-morphogenèse en utilisant l'objectif 10X.
- Une fois localisé, glisser l'objectif 10X et ajouter une goutte d'huile à immersion sur la diapositive.
- Utilisation de l'objectif 60X, identifier le haut et le bas de l'embryos pour configurer les paramètres d'imagerie Z-stack.
REMARQUE: Ne pas hésiter à définir le Z-pile supérieure à l'épaisseur des embryons. Régler la distance entre deux plans adjacents de 0,8 um. Cela permettra de couvrir la profondeur totale des embryons en 35 à 50 Z-plans.
NOTE: Si le microscope contient une plate-forme xy automatisé, les embryons situés à différents endroits du pad peuvent être enregistrées simultanément. Pour ce faire, fiche coordonnées xy de chaque emplacement sur le pad que vous souhaitez analyser au cours de l'expérience. Assurez-vous de sélectionner le xy lors du réglage du paramètre d'enregistrement et suivez le reste du protocole comme indiqué. Thin Z-tronçonnage de l'embryon lors de l'enregistrement ne doit pas nécessairement pour les mesures décrites dans le présent protocole. Enregistrement du développement embryonnaire des animaux wt et mutantes avec la résolution maximale est cependant une bonne pratique afin de construire une bibliothèque d'enregistrements capables de supporter des analyses supplémentaires. - Ensemblele time-lapse avec des intervalles de 2 min entre deux acquisitions durant 8 heures.
NOTE: Le temps d'exposition dépendra de l'intensité lumineuse fixée pour le microscope. Le mouvement des cellules lors de l'allongement précoce est très lent; l'exposition-temps pourrait être d'environ une image par seconde ou moins. Si les embryons sont à des étapes de morphogenèse précoce (dorsale d'intercalation, enceinte ventrale), l'allongement précoce serait enregistré à 1 h. Assurez-vous que l'obturateur de lumière est fermé entre chaque acquisition. - Exécutez l'acquisition et l'enregistrer.
- Placez le-coulisseau monté sur la scène d'un microscope. Assurez-vous que le microscope est équipé de 10X et 60X objectifs, ainsi que des lentilles DIC, prisme, appareil photo et le logiciel de capture permettant la microscopie time-lapse et génération de Z-piles (automatisé Z-plateforme).
- Mesure des défauts Allongement précoces à l' aide de l' analyse d'image
- Logiciel Fiji-ImageJ ouverte ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- Dans le menu, sélectionnez Analyser / Set Mesures, sélectionnez Perimeter. Pour chaque embryon, d' ajuster la barre Z-échelle pour se concentrer sur le pharynx de l'embryon , comme représenté sur la figure 2A. Cela garantira que vous vous concentrez sur le centre de l'embryon. Pour mesurer la longueur de l'embryon, ajuster la barre d'échelle de temps pour avoir l'embryon d'intérêt au début du début d' allongement (stade de la virgule; Figure 2A). Notez l'heure ( «Time-début").
- Choisissez l'outil de ligne segmenté. Tracez une ligne segmentée de la pointe de la bouche de l'embryon jusqu'à la pointe de sa queue suivant la ligne médiane de l'embryon (figure 2A). Utilisation de l'onglet de menu Analyser / Mesure, obtenir la longueur de la ligne tracée ( "Longueur début").
- Répétez cette mesure pour le même embryon, à la fin de l'allongement précoce (moment où les muscles commencent à contracter). Notez le temps ( "Time-end") et de mesurer la longueur de l'embryon ( "Longueur-end") tel que décrit ci - dessus (figure 2B).
- Calculer la durée (D) de l'allongement précoce et l'augmentation de la longueur (L) au cours de cette étape comme suit:
D = "Time-end" - "Time-début"
& #160; L = "Longueur-end" - "Longueur-début" - Pour mesurer la largeur de la tête, ajustez la barre d'échelle de temps pour avoir un embryon au stade de l'intérêt (stade 1,2 fois ou à la fin de l'allongement précoce). Choisissez l'outil en ligne droite. Dessiner la ligne médiane transversale (axe dorso-ventral) de la tête. Cette section est la partie la plus épaisse de l'embryon (figure 2C). Utilisation du menu Analyser / Mesurer, obtenir la longueur de la ligne correspondant à la largeur de la tête.
- Au même point de temps, répétez cette étape en traçant la ligne médiane transversale de la queue ( à mi-ligne entre la vanne intestinale et la pointe de la queue; la figure 2C) et de le mesurer pour obtenir la largeur de la queue.
REMARQUE: Utilisez cette mesure pour comparer les embryons au même stade dans les différents phénotypes. Pour assurer la reproductibilité de cette mesure, assurez-vous de trouver un emplacement situé autour de la ligne médiane de la queue de l'animal qui peut facilement être reconnu d'un animal à unnother. - Pour calculer la tête à la queue rapport de largeur, diviser la largeur de la tête par la largeur de la queue.
2. Caractérisation des défauts de Allongement tardif Utilisation de l'analyse d'image
- Synchronisation de L1 Larves en utilisant Alkaline traitement hypochlorite
- A partir d'une plaque non affamé mm 60 contenant de nombreux adultes gravides, de recueillir tous les vers dans un tube de micro-centrifugeuse en lavant les nématodes de la plaque avec 1 ml de tampon M9 à l'aide d'une pipette Pasteur.
- nématodes de sédiments à 3500 xg pendant 3 min à température ambiante et retirer le surnageant à l'aide d'une micropipette sans perturber le culot à vis sans fin.
- Ajouter 1 ml de solution d'hypochlorite à chaque tube (0,4 M hypochlorite, NaOH 0,5 M) et agiter pendant 3 min.
REMARQUE: une solution d'hypochlorite alcaline doit être fraîchement préparée et les embryons dans cette solution doit être agitée doucement mais de manière continue pour optimiser la dissolution des adultes et l'oxygénation de l'embryos. Après 3 min agitation, la plupart des adultes devraient libérer leurs œufs dans la solution. - Spin à 3500 xg pendant 3 min à température ambiante et rapidement éliminer le surnageant à l'aide d'une micropipette sans perturber le culot.
- Laver quatre fois avec 1 ml de tampon M9 suivie d'une centrifugation à 3500 g pendant 3 min.
- Après le quatrième lavage, retirer le surnageant et resuspendre oeufs dans 700 pi de tampon M9 sans pipetage les œufs (comme les oeufs colleraient à la matière plastique de la pointe).
- Tape le tube sur un agitateur orbital 3 mm placé dans un incubateur à la température de croissance approprié et agiter à 600 tours par minute pendant la nuit.
- Mesure de la longueur de Synchronized Larves
- Centrifugeuse arrêté larves L1 à 3500 xg pendant 3 min à température ambiante et retirer le surnageant. Remettre en suspension les larves dans 100 ul de tampon M9 et de les transférer sur un tampon d'agarose à l'aide d'une pipette Pasteur (tampons d'agarose à préparer doivent êtred tel que décrit à la section 1.1.2 à 1.1.8). Placez une lamelle sur le pavé.
REMARQUE: Le tampon n'a pas besoin d'être scellé avec de la gomme pour cette expérience qui implique l'acquisition courte. - Utilisez un objectif et le contraste de phase illumination 10X pour mesurer la longueur des larves si un appareil photo haute résolution est utilisé. Augmentez l'intensité de la lumière pour être en mesure de capturer des images en quelques millisecondes et par conséquent obtenir une image claire des larves (figure 2D).
REMARQUE: Alors que les poubelles de nage des larves sont réduites par le tampon d'agarose, ils sont toujours en mouvement. Par conséquent, l'enregistrement rapide est essentielle pour obtenir une image claire. - Ouvrez Fidji-ImageJ et répétez l'étape 1.3.1. Pour mesurer la longueur des larves, choisissez l'outil de ligne segmenté. Tracez une ligne segmentée de la pointe de la tête jusqu'à la pointe de la queue qui suit la ligne médiane des larves (figure 2D, panneau de droite).
- Utilisation du menu Analyse / Mesure, obtenir la longueur de laligne tracée correspondant à la longueur des larves au micromètre.
- Centrifugeuse arrêté larves L1 à 3500 xg pendant 3 min à température ambiante et retirer le surnageant. Remettre en suspension les larves dans 100 ul de tampon M9 et de les transférer sur un tampon d'agarose à l'aide d'une pipette Pasteur (tampons d'agarose à préparer doivent êtred tel que décrit à la section 1.1.2 à 1.1.8). Placez une lamelle sur le pavé.
3. Caractérisation des défauts de Allongement tardif par cytométrie en flux
- Synchroniser larves
- Purifier embryons en utilisant le traitement à l'hypochlorite alcaline comme décrit dans la section 2.1 de plein plaques de 100 mm de jeunes adultes bien nourris et laissez la trappe de l'embryon et l'arrestation L1 dans un tampon M9 pendant 16 à 24 heures à 20 ou 25,5 ° C en fonction de la souche analyser.
NOTE: Une assiette pleine d'adultes bien nourris par souche est suffisante pour l'analyse décrite ci-dessous.
- Purifier embryons en utilisant le traitement à l'hypochlorite alcaline comme décrit dans la section 2.1 de plein plaques de 100 mm de jeunes adultes bien nourris et laissez la trappe de l'embryon et l'arrestation L1 dans un tampon M9 pendant 16 à 24 heures à 20 ou 25,5 ° C en fonction de la souche analyser.
- Calibrage de la Sorter Worm
NOTE: La cytométrie de flux utilisé ici est un flux de particules grande cytomètre (ci-après dénommé le trieur à vis sans fin). Le trieur à vis sans fin comprend une nm laser à diode rouge 670, qui est situé en face d'un détecteur d'extinction. Le trieur de ver contient aussi un laser argon multi-ligne pour l'excitation fluorescente. Les sles instruments de tandard ont trois tubes photomultiplicateurs détecteurs (FPM) de fluorescence utilisés pour détecter les émissions de fluorescence dans les régions vertes, jaunes et rouges du spectre. Dans le protocole décrit ici, TOF sera utilisée pour mesurer la taille des larves, le canal rouge sera utilisé pour identifier des vers morts qui seront colorées avec l'iodure de propidium (PI). GP (General Purpose) Haute Fluorescence Particules de contrôle utilisé pour étalonner l'instrument et comme contrôle interne dans notre expérience affichage haute fluorescence en vert, jaune et rouge. Ils seront les seuls objets dans l'échantillon analysé avec une grande émission détectée dans le canal vert et seront ensuite identifiés sur la base de cette caractéristique.
NOTE: Vivre les animaux sont identifiés sur la base de l'absence de fluorescence dans le canal Vert et Rouge, ainsi que sur la TOF. émission autofluorescents de l'intestin des larves est pas détectable au stade L1.- Allumez le bloc laser, l'ordinateur, l'un compresseurd l'instrument ver trieuse. Appuyez sur la touche START sur le logiciel trieur de ver ouvert comme indiqué dans le manuel d'instruction de l'instrument.
- Observez la fenêtre pop-up de commande de laser à argon. Sélectionnez le mode RUN et attendez que les puissances laser atteignent 10 ± 1 mW. Sélectionnez FAIT sur la fenêtre de contrôle de laser.
- Fixer la gaine et l'échantillon a des pressions allant jusqu'à 5,10 ± 0,02 et 5,51 ± 0,01, respectivement. Laisser la pression à équilibrer pendant au moins 15 min, puis cliquez sur la case à cocher OK PRESSION.
NOTE: Le débit dépend de la gaine et les pressions échantillons. - Assurez-vous d'éliminer toutes les bulles présentes dans les tubules de canaux d'écoulement entre la coupe de l'échantillon et la chambre d'analyse. Pour ce faire, cliquez sur ACQUIRE et secouez doucement le tubule jusqu'à ce qu'aucune bulle sont acquises (comme on le voit dans la fenêtre d'acquisition).
- Configuration de tous les paramètres de mesure et de détection de la manière suivante fluorescent et TOF:
- Définissez les échelles pour TOF, Ext, Vert, Jaune et Rouge256. gain de Set comme décrit dans le tableau 1. Control Set PMT à 700 pour le vert et jaune et à 900 pour Red.
REMARQUE: Les deux filtres d'excitation sont disponibles (488 nm et 514 nm) et peut être utilisé pour exciter soit la protéine fluorescente verte (GFP) ou la protéine fluorescente jaune (YFP) ou tout fluorochromes excités à ces longueurs d'onde avec le laser à argon multiligne. Des filtres appropriés doivent être insérés dans la chambre de l'équipement de filtre. Nous avons utilisé le filtre 488 nm pour l'expérience suivante.
- Définissez les échelles pour TOF, Ext, Vert, Jaune et Rouge256. gain de Set comme décrit dans le tableau 1. Control Set PMT à 700 pour le vert et jaune et à 900 pour Red.
- Pour étalonner le trieur à vis sans fin, sélectionnez "particules de commande Exécuter" dans le menu de l'outil. Mettre 20 ml de 1x GP (But général) Particules de contrôle de haute fluorescence dans la tasse (ces particules sont des particules fluorescentes de taille précise, vendus par le fabricant de cytométrie de calibrer leur instrument).
- Cliquez sur le bouton ACQUIRE pour commencer la gaine et l'écoulement de l'échantillon.
REMARQUE: Attendez une moyenne liée à la distribution contrôle des particules de 21 ± 6 et acoefficient de variation autour de cette moyenne (CV) ≤11. Si le CV est> 11 et la moyenne est> 27 essayer de nettoyer les tubules en cliquant plusieurs fois sur le bouton propre ou en effleurant le canal d'écoulement.
- Acquisition de TOF animale
REMARQUE: la lumière diffuse quand un objet passe dans la cellule d'écoulement entre la source laser et le détecteur d'extinction. Le temps qu'il faut pour que la lumière soit diffusée par l'objet de vol (heure de vol, TOF) est utilisé pour mesurer la longueur axiale de l'objet. La mesure de la lumière masquée par l'objet (extinction, EXT) est utilisée comme mesure de l'opacité / ou de densité optique.- Placer 10 ul de type sauvage synchronisé ( en poids) L1 dans un verre de montre et estimer le pourcentage de morts-oeufs en utilisant un microscope à dissection.
NOTE: Synchronisé L1 affichage haute Emb (supérieure à 20%) en poids ne doit pas être utilisé pour une analyse plus approfondie. - Transfert synchronisé L1 de la microcentrifugeuse (anviron 700 pi de M9 contenant L1) à un tube conique de 15 ml. Ajouter l'iodure de propidium (PI) à une concentration finale de 10 pg / ml (dilution 1/100 e d'un / ml de solution mère à 1 mg) et incuber pendant 30 min à température ambiante.
NOTE: Les œufs morts et les larves seront colorées en utilisant PI et détectés comme des objets très fluorescentes utilisant le canal rouge. - Ajouter 10 ml de tampon M9 pour diluer les populations colorées. Prendre 5 ml de populations dilués et les diluer quatre fois par l'addition de 15 ml d'M9. Placez cette dilution dans l'échantillon tasse.
- Exécutez le flux d'échantillon en cliquant ACQUIRE et observer le débit.
NOTE: Afin d'avoir une mesure précise, le débit doit rester entre 15 et 25 objets / sec. - Si nécessaire, ajuster la quantité d'animaux dans la coupe pour atteindre le débit souhaité.
REMARQUE: La volonté de débit dépend de la pression et de l'échantillon (gaine) qui sont constantes, comme indiqué dans 3.2.3 et la concentration des larves in la tasse. Si le débit est supérieur à 25 objets / sec ajouter un peu de mémoire tampon dans la tasse. Si elle est inférieure à 15 objets / sec ajouter L1 concentré (étape 3.3.3) dans la tasse. - Une fois la concentration appropriée de l' objet est atteint, d' évaluer le volume dans la tasse et ajoutez 1/4 ème de ce volume en solution haute Fluorescent GP de contrôle des particules 4x.
- Réglez le paramètre de déclenchement et le tri. Pour ce faire, cliquez sur «Gating» dans le menu et sélectionnez 'TOF vs.' et «vert». Cliquez sur 'Tri' dans le menu et sélectionnez 'TOF vs.' et 'Red'. Gating et graphiques de tri apparaissent alors comme le montre la figure 3A.
NOTE: Cela permettra la visualisation des particules de contrôle (émission en vert et rouge), animaux morts colorés par PI et des bulles (émission en rouge et non vert) et les animaux vivants (pas d' émission dans les canaux ni vert , ni rouge) (figure 3A ). - Exécutez l'expérience en cliquant sur ACQUIRE.
NOTE: Pour identifier les petites différences de taille entre les larves, d'analyser près de 10.000 objets, donc environ 8000 animaux. Arrêtez l'expérience et d'exporter les données sous format .txt en cliquant sur STORE.
- Placer 10 ul de type sauvage synchronisé ( en poids) L1 dans un verre de montre et estimer le pourcentage de morts-oeufs en utilisant un microscope à dissection.
- Mesure de la taille relative de la vie Animaux en synchronisé Populations
- Ouvrez le fichier .txt à l'aide d'un logiciel capable de gérer de grandes tables de données.
- A partir des objets analysés extraire les valeurs TOF associées aux particules de contrôle qui sont caractérisés par l'émission dans le canal vert supérieur à 100 unités arbitraires (cette valeur est fonction des paramètres définis dans la section 3.2.5). Créer une nouvelle colonne et l'appeler «particules de contrôle». Créer une colonne contenant tous les autres objets, à l'exception des particules de contrôle appelé «échantillon». NOTE: l'émission de fluorescence de nouveaux besoins en matière de lots de particules à vérifier avant de commencer les acquisitions. Cela va régler le seuil fluorescent permettant l'identification departicules de contrôle sur CN1.
- Pour chaque souche analysée identifier la partie de l'expérience dans laquelle la vitesse d'écoulement a été modifié (en raison de la présence d'un bouchon d'œufs par exemple). Faire cela:
- Tracer la TOF des «particules de contrôle» pour chaque échantillon en tant que facteur de temps (figure 3B).
- Tracer la courbe de tendance linéaire à l'aide de l'outil de ligne de tendance et d'afficher l'équation sur le graphique.
NOTE: Le TOF de particules de contrôle doit être constante au fil du temps (ligne horizontale, figure 3B). Compte tenu de l'équation de la courbe de tendance linéaire tracée sur les données y = ax + b, veiller à ce que la valeur «a» est plus faible que 10 -4. Toutes les mesures effectuées dans les tranches de temps présentant une rupture dans l'alignement de contrôle des particules doivent être éliminées de l'analyse.
- Retirez les embryons morts et des bulles (émission supérieure à 15 dans le rouge), ainsi que de petits débris et de grandes prises d'œufs (TOF inférieure à 10 et de hauteer à 70 respectivement) de la mesure "de l'échantillon.
- Tracer la distribution "particules de contrôle» pour chaque souche analysée. Comme on le voit sur la figure 3C ces distributions devraient recouvrir presque parfaitement. Ceci assure que les mesures TOF obtenus pour différentes souches peuvent être comparés. REMARQUE: la normalisation des éléments de l'échantillon sur TOF particules de contrôle peuvent être utilisées si les répartitions des particules de contrôle dans un échantillon ne se superposent pas avec celle d'échantillons témoins. TOF Normalized sont calculés comme suit:
- Normaliser TOF pour le génotype G = (échantillon TOF G) / ( «contrôle particule 'TOF moyenne G) x (moyenne' contrôle des particules 'TOF pour poids) où poids est l'échantillon témoin.
- Tracer la distribution Larves TOF pour chaque souche , y compris l' échantillon de contrôle, dans notre cas , en poids des animaux (Figure 3D). Mesurer la moyenne et l'erreur standard de la moyenne (SEM) pour chaque population (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Head-, caudales et Chef / Ratio de queue-largeur sont Metrics robustes.
Les protocoles décrits ici ont été utilisés avec succès pour caractériser la fonction des régulateurs et des effecteurs de Rho GTPases pix-1, pak-1 et laissez-502 lors de l' allongement précoce 7. Pix-1 et pak-1 du code respectivement pour un facteur guanine-échange (FEM) et un effecteur spécifique pour Rac / Cdc42 GTPases et laissez-502 codes pour un effecteur pour RHO-1 7. Dans cette étude, ont été montrées pix-1 et PAK-1 pour contrôler l' épiderme lors de l' allongement de la morphogenèse précoce 7. Cette étude a utilisé la tête et la largeur de la queue mesure que les mesures démontrent pour la première fois, que les cellules hypodermiques situées dans la emb antérieureryo suivre différents programmes morphogénétiques que celles situées dans son postérieur 7. Pour établir la reproductibilité et la robustesse de ces mesures, la largeur de la tête a été mesurée indépendamment cinq fois sur 12 de type sauvage (wt) embryons au stade de 1,2 fois. Les écarts entre les cinq groupes différents de mesure ont été comparés ensuite évalués en utilisant le test de Brown-Forsythe ( en utilisant R package statistique) révélant aucune différence significative entre les mesures (F- test de valeur p-> 0,5; la figure 4A) , suggérant que les mesures pour un groupe d'embryons sont reproductibles. L' évaluation des effets de reproductibilité et de lots associés à ces mesures a été réalisée grâce à la mesure de la largeur de la tête d'embryons au stade wt 1,2 fois de l' imagerie 4D-DIC fait sur trois jours différents (n = 12 embryons). À travers ces trois groupes de mesure, la variance n'a pas été significativement différent et pas d'effets de lots importants ont été trouvés à l'impact de la tête-wRésultats IDþ de mesure (F-test de valeur p> 0,5; Figure 4B).
Des résultats similaires ont été obtenus pour la mesure de la largeur de la queue et des mesures effectuées à différents stades d'allongement précoce (données non présentées). Ces données établies tête de largeur, la queue de largeur et de la tête / queue rapport largeur que les mesures robustes pour caractériser début des défauts d'allongement.
Tête de mesure et la queue Largeur ainsi que Longueur du Embryons Permet pour la caractérisation des gènes contrôlant Allongement précoce le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon.
Mesure de la longueur des embryons, ainsi que la largeur de la tête et de la queue a été réalisée sur des embryons mutants portant wt et nulle ou thermosensibles forte perte d'allèles de gènes contrôlant la fonction pour l' allongement précoce: pix-1 (gk416);pak-1 (ok448) et laissez-502 (sb118ts) 7. Nous avons mesuré la tête / queue (H / T) rapport largeur des embryons wt et mutantes au début (stade 1,2 fois) et à la fin de l'allongement précoce à des températures non permissives (figure 4C gauche et panneau de droite , respectivement). Si , au début de l' allongement au début il n'y avait pas Change- ou H réduit / T a été observée dans pix-1, PAK-1 et let-502 mutants par rapport aux animaux wt (stade 1,2 fois, de la figure 2C, le panneau de gauche ), à la fin de l' allongement précoce les trois mutants ont montré un rapport H / T significativement plus élevée que les embryons wt (t -test p -values <0,006; Figure 4C; panneau de droite). Cela démontre que pix-1, PAK-1 et let-502 embryons mutants affichent une morphologie antéro-postérieur anormale à la fin de l' allongement précoce. Une analyse plus approfondie comparant la largeur de la tête et la queue largeur between stade 1,2 fois et la fin de l' allongement précoce, en utilisant les mêmes paramètres de mesure ont révélé que la largeur de la tête est moins réduite dans pix-1, pak-1 et laissez-502 mutants tandis que la largeur de la queue réduit nettement moins dans les mutants let-502 seulement 7. Cette étude a révélé que les laissez-502 contrôles morphogenèse de même le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon, tandis que les processus morphogénétiques pix-1 et pak-1 contrôle qui se produisent principalement à la partie antérieure de l'embryon 7. La différence de longueur entre les embryons à l'extrémité par rapport au début du début de l' allongement (figure 4D) a également été mesurée. Nous avons constaté que l' allongement précoce a été significativement réduite chez les pix-1, PAK-1 et let-502 mutants par rapport au poids suggérant que la modification de la morphogenèse antérieure chez les mutants PIX-1 et PAK-1 seule est suffisante pour réduire de façon significative le elongation de l'embryon.
Protocole 2 et 3 ont été utilisés pour évaluer la longueur des larves arrêtées dans les milieux wt et mutantes. La longueur de ces larves a été évaluée à l' aide à la fois l' analyse d'image (protocole n ° 2) 7 et cytométrie de flux (protocole n ° 3; données non publiées). Les mesures de longueur de larves en utilisant l' image des résultats d'analyse en mesures absolues de la longueur des animaux en micromètres d'une manière robuste et hautement reproductible (figure 5A). Cette analyse a révélé que l' affichage des larves mutant synchronisé réduit significativement la longueur par rapport au poids (figure 5A) 7. La mesure de ces larves en utilisant le protocole à base de cytométrie en flux (Protocole 3) a donné des résultats comparables (figure 5B). Toutefois, il convient de noter que le grand nombre de larves mesurée en utilisant cette dernière approche a augmenté de manière significative la robustesse statistique de comparaison du génotype (t - essai p -values <10 -24). Sur la base de ces résultats, l'approche par cytométrie de flux peut être un meilleur choix sur l'analyse d'images afin de caractériser les animaux mutants présentant des défauts d'allongement très subtiles.
Figure 1. Préparation d'un Pad Agarose. A, slide Microscope placé entre deux entretoises-lames recouvertes de deux couches de ruban de masquage. B, Le tampon d'agarose est recouverte d' une autre lame supportée par les deux diapositives espaceurs. C, La forme finale et la taille du tampon d' agarose après la coupe avec une lame de rasoir pour adapter la lamelle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
g2.jpg "/>
. Figure 2. Mesure de début et de défauts de Allongement tardives A - B, la mesure de la longueur d'un embryon au stade de la virgule (A) et à la fin de l' allongement précoce (B). La ligne rouge, utilisé pour mesurer les embryons a été établi en utilisant l'outil de ligne segmentée de ImageJ. C, la tête et la largeur de la queue sont mesurées dans des embryons au stade de 1,2 fois ( à gauche) et à la fin de l' allongement précoce ( à droite). Les flèches représentent la localisation des zones de mesure (modifié par Martin et al., 2014). Barre d' échelle:. 20 pm D, Longueur des larves est mesurée pour L1-larves synchronisée. Panneau de droite est une vue agrandie de l'image capturée (à gauche). La ligne rouge a été établi en utilisant l'outil de ImageJ ligne segmenté. Il est utilisé pour mesurer la longueur de la chenille. Barre d' échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Mesure de la longueur du Synchronized Larves utilisant Flow-cytométrie. A, Gating et de tri fenêtre de COPAS Biosort montrant vert et l' émission rouge de particules de contrôle, des bulles, morts et des animaux vivants par rapport à leur temps de vol (TOF ). B, TOF des particules de contrôle à des moments différents pour une expérience représentative. La pente de la fonction linéaire de TOF en fonction du temps est d' environ 10 -5, ce qui indique que TOF de particules de contrôle est constante au fil du temps tout au long de l'expérience. C, Distribution des TOFs de particules de contrôle exprimés en pourcentage de la valeur maximale des distributions. Distributions de contrôle des particules non-normalisées et normalisées sont représentées pour le pak-1 (ok448). D' autres distributions ne sont pas normalisées. D, distribution de TOFs pour la vieles animaux exprimés en pourcentage de la valeur maximale des distributions. TOFs ne sont pas normalisées sur les particules de contrôle , sauf pour pak-1 (ok448) comme indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Pix-1, Pak-1 et Let-502 Mutants actuels Défauts Early Allongement. A - B, Reproductibilité et robustesse évaluation de la tête Largeur de mesures A, cinq mesures indépendantes de la largeur de la tête pour les embryons au stade wt 1,2 fois (n = 12 embryons).. Moyens et les écarts types (barres d'erreur) sont indiqués. importants (ns) différences entre les mesures non ont été calculées en utilisant le test de Brown-Forsythe nous (ing R package statistique) (F-test de valeur p> 0,5). B, Head mesure de la largeur pour les embryons wt à trois jours différents (n = 12 embryons). Les moyens et les écarts-types sont indiqués ainsi; il n'y avait pas de différence significative de la variance entre les mesures (ns; Brown-Forsythe test F valeur p-> 0,5) C, Distributions de tête / queue rapport de largeur à l' étape de 1,2 fois (panneau de gauche), à la fin du début. allongement (panneau de droite) en poids, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) et laissez-502 (sb118ts) mutants à 23 - 24 ° C. Notez que les mères de laisser-502ts embryons utilisés pour cette étude ont été cultivées à 25,5 ° C. D, distribution de l'allongement en poids, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) et laissez-502 (sb118ts) mutants entre stade virgule et le début de la fin de l'allongement. La boîte-parcelles représentent la min, max, 25 e, 50 e (médiane) et 75e percentiles des populations. * T -test valeur p <0,05, ** t -test p -value <0,006 (modifié par Martin et al., 2014). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) et L et-502 (sb118ts) Larves Present Longueur Défauts. A, Longueur des larves mesurée en poids, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) et laissez-502 (sb118ts) animaux mesurée par analyse d'image (protocole n ° 2). B, relative longueur de larves mesurée à l' aide de flux cytomètre ( Protocole 3). Les chiffres entre parenthèses correspondent au nombre d'animaux utilisés à des eLes mesures de e. Moyens de longueurs et erreur standard de la moyenne (SEM; barres d'erreur) sont représentés. T de Student -test valeurs p sont indiquées (p). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole décrit les nouveaux paramètres pour caractériser début et fin des phases d'allongement embryonnaire.
Dans la section 1, l'étape critique est la présence potentielle de bactéries sur le pad. Les embryons sont hermétiquement enfermés entre le patin et la lamelle lors de l'acquisition d'image. La lame d'étanchéité est nécessaire pour éviter la dessication des animaux lors de l'acquisition d'une durée de plus de deux heures. À notre connaissance, aucun des scellants utilisés pour monter des tampons d'agarose entre lame et lamelle sont perméables à l'air. Par conséquent, quand une grande quantité de bactéries (ou embryons) est présent sur le pavé, ils peuvent être privés d'oxygène après quelques heures menant à leur mort prématurée. Avoir des embryons triples - correspondant à des embryons qui sont 3 fois en longueur par rapport à des embryons non allongés - enregistrés ainsi que les embryons d'intérêt sera un bon indicateur des conditions hypoxiques potentiels, puisque ces embryons seront cesser de se déplacer dans Their coquilles d'oeuf, en l'absence d'oxygène. Aucune mesure morphologiques doivent être effectuées sur des conditions hypoxiques ou sur des embryons morts.
Une autre étape critique lors de l'utilisation d'imagerie time-lapse est la température à laquelle le développement de l'embryon se produit. Des mutants thermosensibles sont actuellement utilisés en C. elegans. L'effet biologique du changement de température peut être immédiate ou retardée en fonction de la demi-vie de la protéine et de la nature de la mutation de sa porte. Par conséquent, la température à laquelle l'embryon est exposé doit être constante au fil du temps et doit être contrôlée par une ventilation appropriée de la salle de microscopie ou une chambre de chauffage-refroidissement sur la platine du microscope.
Section 2 dépend de la synchronisation des larves en utilisant un traitement hypochlorite alcalin. Dans certaines circonstances, ce traitement peut conduire à une létalité embryonnaire (Emb). Emb supérieure à 20% de la population en poids suggère une toxicité élevée pendant traitement hypochloritement qui peuvent avoir un impact négatif morphogenèse. L1 synchronisé affichage haute Emb en arrière - plan en poids ne doit pas être utilisé pour une analyse plus approfondie. Cette restriction vaut également le protocole 3.
Nous ne recommandons pas l'utilisation de médicaments anesthésiques pour immobiliser les larves. Levamisol en particulier, immobilisant le nématode par l'induction de la tétanie musculaire qui tend à se rétrécir les larves d'introduire un biais expérimental. Si le temps d'exposition ne sont pas assez rapides en raison des limitations du microscope, il est recommandé de réduire la motilité des larves en augmentant la concentration de l'agarose dans le tampon et réduisant la quantité de liquide entre le patin et la lamelle. Il faut prendre soin toutefois de ne pas dessécher les larves, car la dessication va réduire leur taille.
Dans la section 3, la mesure de la longueur des larves utilisé comparaison des débits entre les échantillons analysés. Pour ce faire, la répartition des particules de contrôle doit être comparouge. Si les distributions entièrement superposition, la TOF (temps de vol) valeurs obtenues pour les échantillons correspondant peut être comparé, sinon, ces valeurs doivent être normalisées. La normalisation de l' échantillon-TOF sur les particules-TOF contrôle (comme détaillé dans 3.4.5.1) a été utilisé avec succès comme indiqué pour le pak-1 (ok448) (figure 3C et la figure 5B). La longueur relative de la PAK-1 (ok448) en fonction de poids a été jugée similaire dans au moins 3 expériences indépendantes avec ou sans normalisation (données non présentées). Cependant, nous recommandons, ce qui confirme les résultats obtenus avec la normalisation avec ceux obtenus sans elle, surtout lorsque l'on compare les larves avec des petites différences de taille. Il convient de noter que la mesure de la longueur des larves en utilisant la cytométrie de flux fournit une longueur par rapport à un échantillon témoin, dans ce cas, en poids des larves au lieu d'une longueur absolue en micromètres que pour l' analyse de l' image. Cela implique que des mesures à partir des expériences indépendantes ne peuvent pasêtre combiné à moins calcul rapport de taille plus en poids.
Le tampon utilisé pour la dilution dans la coupelle d'échantillon aura un impact sur le débit. Nous avons observé que le tampon de gaine recommandé par le fabricant contient un détergent qui augmente la quantité de bulles générées lors de l'acquisition. En utilisant un tampon M9, qui ne contient pas de détergent, réduit de manière significative la formation de bulles, mais était moins efficace pour éviter le bouchage des oeufs dans les tubules de la trieuse, ce qui affecte le débit d'échantillons d'écoulement. le branchement de l'œuf est facilement détectée lors de l'acquisition par une diminution marquée du TOF observable des particules de contrôle pendant quelques secondes, suivie d'une élévation TOF- également pendant quelques secondes. bouchage des œufs peut également conduire à l'obstruction du canal et l'arrêt complet de l'écoulement de particules (moins de 5 objets par seconde). Si cela se produit, cliquez sur le bouton CLEAN jusqu'à ce que le débit est rétabli. Toutes les mesures qui se produisent au cours de ces événementss devraient être exclus de l'analyse des données. tampon de la gaine peut être recommandée pour des expériences impliquant des souches caractérisées par des taux élevés d'oeufs morts.
La pression de l'échantillon et de la gaine (fixé à l'étape 3.2.3), peut changer (légèrement) au fil du temps et doit être réglé manuellement pendant toute l'expérience afin d'assurer un débit très constant. Réduction ou augmentation du faible taux seront observables lors de l' analyse des résultats et de tracer les TOFs de particules de contrôle au fil du temps (figure 3C). La réduction du débit se traduira par l'augmentation des moyennes de particules TOFs au fil du temps, tandis qu'une augmentation du débit se traduira par l'inverse. La modification du débit aura un impact négatif sur la sensibilité de la méthode pour la détection de petites différences de taille entre les populations de larves.
Méthodes visant à identifier les gènes qui contrôlent l'allongement et nécessitant time-lapse enregistrement de microscopie sont généralement élevésly temps et fastidieux quand phénotypage plusieurs génotypes. L'approche fondée sur les flux cytomètre, tout en exigeant des équipements non disponibles à tous les laboratoires, est moins de temps et par conséquent plus efficace lorsque plusieurs souches doivent être caractérisés. Cette méthode est également statistiquement plus robuste par rapport à des mesures en utilisant l' analyse d'image (évaluée par test t de l'étudiant en comparant les distributions mutantes et poids TOF; Figure 5A et B). Cette méthode peut alors être très approprié pour les souches exprimant des défauts d'allongement à faible expressivité / pénétrance.
Plusieurs méthodes utilisant la cytométrie de flux ont été développés dans le passé pour mesurer la capacité des nématodes 9-12. Ces méthodes utilisent des animaux distribués dans une des plaques à 96 puits et le module Reflex du ver trieuse. Le module Reflex permet une analyse directe de la population de nématodes distribuée dans les plaques à 96 puits. Par conséquent, ces procédés sont capables de caractéRize des centaines de conditions par jour et constituent une manière robuste pour mesurer l'aptitude d'une population non-synchronisée. Ils sont cependant pas bien adaptés pour identifier les petites différences de taille entre L1 synchronisée. La mesure de petites différences entre les larves L1 nécessite la mesure à travers un grand nombre d'animaux, ce qui est incompatible avec l'utilisation de plaques à 96 puits et du module réflexe qui peut caractériser de manière efficace les objets 100 au maximum par puits. Le procédé décrit ici a été conçu à cet effet, au détriment du débit, ce qui est considérablement réduite. Il permet la caractérisation de 3 à 4 conditions à l'heure une fois que l'instrument est étalonné, ce qui est une nette amélioration par rapport à l'aide d'analyse d'image dans le protocole 2.
Mesure du rapport entre la tête et la queue largeur est la première méthode a été développée pour caractériser morphogenèse se produisant de façon inégale le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon 7. Quandappliquée à des gènes indiqués pour contrôler l'allongement précoce, ces méthodes permettront de clarifier la répartition spatiale des voies de contrôle morphogenèse à ce stade de signalisation. Mesure de la longueur des larves arrêtée en utilisant soit l'analyse de l'image ou par cytométrie de flux en combinaison avec la mesure de la longueur des embryons à la fin de l'allongement précoce permettra l'identification des gènes contrôlant soit un allongement précoce ou tardive, ou les deux avec une grande sensibilité et de précision. Ces procédures peuvent alors contribuer de manière significative à la compréhension future de la réglementation spatiale et temporelle des voies contrôlant l' allongement embryonnaire dans C. signalisation elegans. En outre, ces approches peuvent également être adaptées pour étudier les voies contrôlant la longueur du corps de signalisation tels que l'insuline et le TGF-bêta voies 13, 14 et l' exposition chronique à des contaminants environnementaux 15, 16. Ces mesures peuvent être effectuées à différents stades larvaires ou adultes using variations mineures de protocoles 2 et les différences de taille 3. Mesurer en L1 est plus difficile avec le trieur à vis sans fin que les grands objets tels que L3, L4 larves ou adultes. Protocole 3 peut alors facilement être adapté pour faire ces mesures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
