Introduction
منذ ما يقرب من 50 عاما الديدان الخيطية انواع معينة ايليجانس ضعت نفسها كنموذج قوية لدراسة المسائل الهامة في عملية التنمية، بيولوجيا الأعصاب، والتطور، والتفاعلات المضيف الممرض، الخ. 1 إن قوة هذا النموذج في دراسة التطور تكمن في: دورة حياة قصيرة من 3 أيام؛ السهولة التي هذه الحيوانات يمكن تعديلها وراثيا. شفافيتها التي تمكن من مراقبة النزوح الخلية ومورفولوجيا في الحيوانات الحية وتطورها التي هي في معظمها خارج الرحم. مراحل تطور من الديدان الخيطية وتشمل مرحلة التطور الجنيني وأربع مراحل اليرقات (L1 إلى L4)، تليها مرحلة البلوغ. أثناء التطور الجنيني، ولفت البشرة التشكل اهتماما كبيرا لقدرته على تمكين فهم أفضل لكيفية الظهارية تهاجر الخلايا كمجموعة، كيف تعيد تنظيم تقاطعات وتعديل التشكل الفردي وكذلك تحديد المواقع النسبية في غضون ظهارة الوظيفية.ينقسم التشكل البشرة إلى أربع مراحل: إقحام الظهري التي تتمثل في إعادة تنظيم خلايا البشرة الظهرية، ويشار إلى اللحمة. الضميمة بطني، تتمثل في هجرة خلايا الطبقة الجلدية البطنية نحو خط الوسط البطني وبالتالي يغلف الجنين في أحادي الطبقة الخلايا الظهارية. المبكرة والمتأخرة استطالة تحويل الجنين على شكل حبة الفول إلى يرقات الدودي. بعد التشكل، فتحة الجنين وL1 اليرقات تبدأ التغذية باستخدام بكتيريا المتاحة في بيئتهم المباشرة.
وبالتالي استطالة الجنينية هي مرحلة متأخرة من التطور الجنيني. وهو يتألف من تمديد الجنين على طول محورها الطولي والحد من قطرها عرضية. وهذا ينطوي على تعديل الهائل في شكل خلايا الطبقة الجلدية. ينقسم استطالة إلى وقت مبكر، ومرحلة متأخرة. تبدأ المرحلة الأولى في مرحلة فاصلة وتنتهي عندما تبدأ عضلات الجسم الجدار التعاقد في مرحلة 1.75 أضعاف في ثILD من نوع (وزن) الأجنة - الموافق الأجنة التي هي 1.75 أضعاف في طول مقارنة الأجنة غير ممدود. هي التي تحرك العمليات Morphogenic التي تحدث في تلك المرحلة بشكل رئيسي من قبل انكماش حزم الخيطية الأكتين (FBS) الواقعة في القطب القمي من خلايا الطبقة الجلدية التي تدفع استطالة على طول محور انتيرو الخلفي للجنين 2. انكماش FBS هو سيطرة الفسفرة من سلاسل الميوسين الضوء من قبل ثلاثة تحركات LET-502 / ROCK، MRCK-1 وPAK-1 5. مرحلة متأخرة من استطالة، يبدأ عندما تصبح عضلات الجسم الجدار الوظيفية وتبدأ التعاقد. أنها تنطوي على mechanotransduction إشارات من عضلات الجسم الجدار إلى الخلايا الظهرية والطبقة الجلدية البطنية وينتهي عندما يفقس الحيوانات 3.
تتميز العيوب استطالة عموما نسبة الحيوانات الموت كما الأجنة (الفتك الجنينية، التطريز) وتلك القبض على تنميتها كما L1 اليرقات (اليرقات النمط الظاهري القبض، الوقفأ) ويكون أقصر بكثير من وزن. تحديد مرحلة الاعتقال التنموي يتطلب الملاحظة المجهرية للأجنة ميتة والقبض على يرقات 3-6.
وقد تبين مؤخرا أن العديد من الجينات، مثل Cdc42 / منظم راك والمستجيب بيكسل-1 وباك-1، مراقبة العمليات morphogenic خلال كلا المبكرة والمتأخرة استطالة 3،7. نحن كما أظهرت مؤخرا أن عمليات morphogenic تختلف على طول المحور انتيرو الخلفي من الأجنة أثناء استطالة في وقت مبكر 3 7. هذه النتائج دافعا لتطوير مقاييس جديدة تستهدف على وجه التحديد مراحل استطالة مبكرة أو متأخرة والمقاييس الأخرى تمكين توصيف مورفولوجية الأجنة على طول محور انتيرو الخلفي أثناء استطالة في وقت مبكر.
تتكون هذه الطرق المبتكرة في قياس طول الأجنة في بداية ونهاية استطالة المبكر، وكذلك عرض على انهوقد وضعت الإعلانات وذيول 7 بروتوكولين أيضا إلى قياس طول اليرقات حديثة الفقس، متزامنة في مرحلة L1 7.
قشر البيض من الأجنة حمايتهم من التعرض للمعاملة هيبوكلوريت قلوية بينما حلت اليرقات والبالغين والبكتيريا الموجودة في وسائل الإعلام الثقافة عن طريق العلاج. ثم يتم استخدام هذا العلاج لتنقية الأجنة من السكان غير متزامنة تحتوي على معظم البالغين تغذية جيدة-8. يستخدم تقييد الغذاء لمزامنة اليرقات حديثة الفقس. قياس طول هذه اليرقات ثم يتم استخدامها للكشف عن العيوب استطالة. ويفضل هذا القياس على قياس اليرقات القبض على لوحات ثقافة لأن اليرقات التي تفقس من غير كامل الأجنة ممدود يمكن استرداد إلى "الطول العادي" عند تغذية ولكن ستحافظ على انخفاض حجمها عندما ألقي القبض عليه في حالة عدم وجود الطعام.
هنا، نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية تمكن من قياس جنيهngth من التمطيط الأجنة وكذلك عرض الرأس والذيل باستخدام الوقت الفاصل بين مدينة دبي للإنترنت المجهري وتحليل الصور (بروتوكول 1). ونحن نقدم أيضا بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لقياس طول اليرقات متزامنة باستخدام تحليل الصور (بروتوكول 2) والانسياب الخلوي (بروتوكول 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توصيف العيوب الاستطالة في وقت مبكر في WT والمسخ الحيوانات
- تصاعد الأجنة لNormarski مدينة دبي للإنترنت المجهر
- إعداد وسائل الإعلام ثقافة التالية والمادية:
- M9 العازلة، ويحل 12.8 غرام / لتر نا 2 هبو 4 • 7H 2 O، 3 غرام / لتر KH 2 PO 4، 5 غرام / لتر كلوريد الصوديوم، 0.25 جم / لتر MgSO 4 • 7H 2 O في الماء المقطر والأوتوكلاف لتعقيم.
- لوحات NGM، حل 3 جرام / لتر كلوريد الصوديوم، و 16 جرام / لتر أجار، 2.5 جم / لتر bactopeptone في ده 2 O. الأوتوكلاف وإضافة 1 ملي MgSO 4، 1 ملم CaCl 2، 1 ملي العازلة الفوسفات و 5 ميكروغرام / مل الكولسترول. صب 6 مل من NGM في 60 ملم الأطباق. تسمح وسيلة ليصلب لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إضافة بضع قطرات من ثقافة مشبعة E. البكتيريا القولونية OP50 تزرع في مرق لوريا (LB). دع البكتيريا تنمو لمدة 48 ساعة وتخزين لوحات في 4 درجة مئوية.
- لتوليد بي دودةالمسيخ، جبل سلك البلاتين 0.01 "قطر على ماصة باستور قصيرة. ربط سلك البلاتين الى اقصى الماصة الزجاج عن طريق تسخين هذا الطرف مع ناسخ البنزين. تسطيح أقصى من السلك لتوليد نوع من مجرفة.
- تنمو سلالة دودة على 60 ملم لوحات NGM مع OP50 عند 20 درجة مئوية.
ملاحظة: قد تتطلب الأليلات للحرارة متزايدة الحيوانات في درجات حرارة غير متساهلة بسرعة تصل إلى 25.5 درجة مئوية. وينبغي أن تتضمن لوحات كثير من الشباب ولا يزال الكثير من المواد الغذائية من أجل متابعة البروتوكولات. - ضع شريحة المجهر بين شريحتين هل من خلال طبقتين من اخفاء الشريط (الشكل 1A) مغطاة.
- إعداد 3٪ الاغاروز حل (الوزن / الحجم) في المخزن M9 عن طريق إذابة 0.6 غرام من مسحوق الاغاروز في 20 مل العازلة M9 عن طريق تسخين في الميكروويف لمدة 30 ثانية. يسمح الحل ليبرد لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: الحل الاغاروز يمكن استخدامها لبضعة أيام بعد ذوبان في الميكروويف. هذاكما يمكن aliquoted وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة أسابيع. - وضع قطرة من الملفات الساخنة حل الاغاروز 3٪ على شريحة زجاجية تقع بين البلدين، الشرائح فاصل. تجنب تشكيل فقاعات.
- تغطية بسرعة الاغاروز مع شريحة أخرى كما هو مبين في الشكل 1B واضغط لأسفل بلطف. والشريحة العليا تتسطح انخفاض الاغاروز وتوليد وسادة مع سمك طبقتين من الشريط اللاصق.
- السماح للالاغاروز ليصلب لا يقل عن 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو حتى الأجنة جاهزة للنقل إلى لوحة.
- باستخدام معول دودة، ونقل 20-30 تغذية جيدة الشباب من NGM لوحة في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة التي تحتوي على 400 ميكرولتر من العازلة M9.
- السماح للديدان إلى الرواسب بفعل الجاذبية لحوالي 5 دقائق وإزالة طاف باستخدام micropipette. وتهدف هذه الخطوة إلى إزالة الحد الأقصى من البكتيريا التقطت مع الديدان الخيطية.
- إضافة 200 ميكرولتر من العازلة M9 إلى كل أنبوب.
- باستخدام نقطة باستورETTE، ونقل المحتوى من الأنبوب (العازلة والديدان الخيطية) إلى الزجاج ووتش.
- استخدام واحد أو اثنين 25G 5/8 "الإبر لقطع الحيوانات في القسم منتصف الجسم (بين المنوية والفرج).
ملاحظة: يمكن أيضا شفرة مشرط أن تستخدم كبديل للإبرة (ق). القيام بذلك على الديدان الخيطية السباحة وقد يتطلب بعض الممارسة. والفكرة هي أن استخدام الإبر كما مقص أو سكين اعتمادا كيفية استخدام العديد من الإبر. مرة واحدة يتم قطع الحيوانات مفتوحة، المخنثين الإفراج الأجنة التي في المخزن المؤقت. - التركيز الأجنة في وسط الزجاج ووتش من خلال جيل من دوامة دائرية داخل السائل.
- إزالة معظم M9 من الزجاج ووتش باستخدام micropipette. ترك ما يقرب من 30 ميكرولتر من M9 مع الأجنة.
- إزالة الشريحة التي تغطي وحة agarose (الشكل 1B) عن طريق تحريك تشغيله لوحة.
- قطع لوحة بشفرة حلاقة لكي تكون قادرة على تغطية تماما مع ساترة (الشكل 1C).
- باستخدام ماصة باستور، ونقل كل الأجنة (والحطام دودة) على لوحة الاغاروز.
- مجموعة من الأجنة في وسط لوحة باستخدام رمش لصقها في أقصى من طرف المستخدمة ل200 بال micropipettes ميكرولتر.
- وضع ببطء ساترة على لوحة تجنب تشكيل فقاعة وختم عليها.
ملاحظة: العديد من السدادات يمكن استخدامها. نحن نستخدم رسم اللثة وجدت في الفنون والحرف مخازن (عادة ما تستخدم اخفاء العلكة لوحة الرسوم المائية). ويستخدم هذا الصمغ لأنه ماء ويتصلب بسرعة معقولة وليست سامة للديدان. الشرائح ويمكن أيضا أن تكون مختومة مع طلاء الأظافر أو VALAP (خليط مصنوع من الفازلين، اللانولين والشمع Parafin). - السماح للرسم الجافة العلكة لنحو 15 دقيقة.
- إعداد وسائل الإعلام ثقافة التالية والمادية:
- تسجيل المبكر الاستطالة باستخدام رباعية الابعاد Normarski مدينة دبي للإنترنت المجهر
ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو لتسجيل استطالة في وقت مبكر من فاصلة لبداية أواخر استطالة- يعرف بأنه لحظة عندما تبدأ عضلات الجسم الجدار التعاقد. ونحن نهدف أيضا إلى تسجيل أكثر من جنين واحد في ذلك الوقت. مطلوبة ثماني ساعات من تسجيل عادة لتسجيل استطالة في وقت مبكر لمجموعة من الأجنة غير متزامنة.- ضع الشريحة التي شنت على مرحلة من مراحل المجهر. ضمان أن يتم تجهيز المجهر مع 10X 60X والأهداف وكذلك العدسات مدينة دبي للإنترنت، المنشور، الكاميرا والتقاط برامج تمكين المجهري الوقت الفاصل بين وجيل من Z-مداخن (الآلي Z منصة).
ملاحظة: تأكد من أن درجة حرارة ثابتة تتراوح بين 20 و 23 درجة مئوية في غرفة الفحص المجهري. قد تكون هناك حاجة لغرفة التبريد والتدفئة على المسرح المجهر، وخاصة عند استخدام المسوخ للحرارة. - تحديد مجموعة من الأجنة في مراحل ما قبل التشكل باستخدام الهدف 10X.
- يقع مرة واحدة، والانزلاق قبالة الهدف 10X وإضافة قطرة من الغمر النفط على الشريحة.
- باستخدام الهدف 60X، وتحديد الجزء العلوي والجزء السفلي من البريدmbryos لإعداد المعلمات التصوير Z-المكدس.
ملاحظة: لا تتردد في تعيين Z كومة أكبر من سمك الأجنة. تعيين المسافة بين طائرتين المجاورة 0.8 ميكرون. وهذا سيمكن لتغطية العمق الكلي للأجنة في 35-50 Z-الخطط.
ملاحظة: إذا احتوى المجهر منصة س ص الآلي والأجنة التي تقع في مواقع مختلفة من لوحة يمكن أن يتم تسجيلها في وقت واحد. للقيام بذلك، وينسق سجل س ص من كل مكان على منصة كنت ترغب في تحليل أثناء التجربة. تأكد من تحديد س ص عند تعيين المعلمة تسجيل ومتابعة ما تبقى من البروتوكول كما هو محدد. ليس مطلوبا رقيقة Z-باجتزاء الجنين أثناء تسجيل بالضرورة عن القياسات المفصلة في هذا البروتوكول. تسجيل التطور الجنيني من الحيوانات WT ومتحولة مع الحد الأقصى للقرار هو إلا ممارسة جيدة من أجل بناء مكتبة التسجيلات قادرة على دعم تحليلات إضافية. - مجموعةحتى الوقت الفاصل مع 2 فترات دقيقة بين عمليتي استحواذ دائم 8 ساعة.
ملاحظة: وقت التعرض سوف تعتمد على شدة الضوء المحدد لالمجهر. حركة الخلية خلال استطالة الأولى بطيئة جدا. التعرض لمرة ويمكن أن يكون إطار ما يقرب من واحد في الثانية أو أقل. إذا كانت الأجنة في مراحل التشكل المبكر (إقحام ظهري، الضميمة بطني)، ستسجل استطالة في وقت مبكر في 1 ساعة. إغلاق التأكد من مصراع ضوء بين كل الاستحواذ. - تشغيل اقتناء وحفظه.
- ضع الشريحة التي شنت على مرحلة من مراحل المجهر. ضمان أن يتم تجهيز المجهر مع 10X 60X والأهداف وكذلك العدسات مدينة دبي للإنترنت، المنشور، الكاميرا والتقاط برامج تمكين المجهري الوقت الفاصل بين وجيل من Z-مداخن (الآلي Z منصة).
- قياس العيوب الاستطالة في وقت مبكر باستخدام تحليل الصور
- البرمجيات مفتوحة فيجي يماغيج ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- في القائمة حدد تحليل / تعيين القياسات، تحديد محيط. لكل جنين، وضبط شريط Z النطاق للتركيز على البلعوم الجنين كما هو مبين في الشكل 2A. وهذا يضمن أن تركز على مركز للجنين. لقياس طول الجنين، وضبط حجم شريط الوقت ليكون الجنين من الفائدة في بداية استطالة الأولى (مرحلة فاصلة، الشكل 2A). لاحظ الوقت ( "تايم-بداية").
- اختيار أداة خط مجزأة. رسم خط مجزأة من غيض من فم الجنين حتى طرف ذيله التالية خط الوسط للجنين (الشكل 2A). باستخدام علامة التبويب القائمة تحليل / قياس، يجب الحصول على طول الخط الذي رسمته ( "طول بداية").
- كرر هذا القياس لنفس الجنين في نهاية استطالة في وقت مبكر (لحظة عندما تبدأ العضلات التعاقد). لاحظ الوقت ( "تايم نهاية") وقياس طول الجنين ( "طول نهاية") على النحو المفصل أعلاه (الشكل 2B).
- حساب مدة (د) من استطالة في وقت مبكر، وزيادة طول (L) خلال هذه المرحلة على النحو التالي:
D = "تايم نهاية" - "تايم-البداية"
& #160؛ L = "طول نهاية" - "طول-البداية" - لقياس عرض الرأس، وضبط شريط النطاق الزمني ليكون الجنين في مرحلة الفائدة (المرحلة 1،2 أضعاف أو نهاية استطالة في وقت مبكر). اختيار أداة خط مستقيم. رسم خط الوسط مستعرضة (محور ظهراني بطني) من الرأس. هذا القسم هو سمكا جزء من الجنين (الشكل 2C). باستخدام القائمة تحليل / قياس والحصول على طول الخط المقابل لعرض الرأس.
- في نقطة زمنية واحدة، كرر هذه الخطوة عن طريق رسم خط الوسط مستعرضة من الذيل (منتصف الخط الفاصل بين صمام الأمعاء وطرف الذيل، الشكل 2C) وقياسه للحصول على عرض الذيل.
ملاحظة: استخدام هذا القياس للمقارنة الأجنة في نفس المرحلة في الظواهر المختلفة. لضمان استنساخ هذا القياس، للتأكد من العثور على موقع تقع حول خط منتصف ذيل الحيوان الذي يمكن بسهولة المعترف بها من حيوان واحد لليست هي. - لحساب رئيس لنسبة العرض الذيل، وتقسيم عرض رئيس من عرض الذيل.
2. توصيف العيوب في وقت متأخر استطالة عن طريق تحليل الصور
- تزامن L1 اليرقات باستخدام القلوية هيبوكلوريت العلاج
- من لوحة ملم غير المتعطشة 60 التي تحتوي على الكثير من البالغين حامل، وجمع كل الديدان في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة عن طريق غسل النيماتودا قبالة اللوحة مع 1 مل من العازلة M9 باستخدام ماصة باستور.
- الديدان الخيطية الرواسب في 3500 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف باستخدام micropipette من دون إزعاج بيليه دودة.
- إضافة 1 مل من محلول هيبوكلوريت إلى كل أنبوب (0.4 M هيبوكلوريت، 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم) ويهز لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: محلول هيبوكلوريت القلوية يجب الطازجة، وينبغي تحريكها الأجنة في هذا الحل بلطف ولكن بشكل مستمر لتحسين حل البالغين والأوكسجين من EMBRيوس. بعد 3 دقائق الإثارة، ويجب أن معظم البالغين إطلاق سراح بيضها في الحل. - تدور في 3500 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وبسرعة إزالة طاف باستخدام micropipette من دون إزعاج بيليه.
- غسل أربع مرات مع 1 مل من العازلة M9 تليها الطرد المركزي في 3500 x ج لمدة 3 دقائق.
- بعد غسل الرابع، وإزالة طاف و resuspend البيض في 700 ميكرولتر من العازلة M9 دون pipetting صعودا البيض (مثل البيض ستلتزم البلاستيك من طرف).
- الشريط أنبوب على شاكر المداري 3 ملم وضعها في حاضنة عند درجة حرارة النمو المناسبة ويهز في 600 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها.
- قياس طول المتزامنة يرقات
- اعتقلت أجهزة الطرد المركزي L1 اليرقات في 3500 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف. Resuspend واليرقات في 100 ميكرولتر من العازلة M9 ونقلها على لوحة agarose باستخدام ماصة باستير (منصات الأغاروس يجب إعدادد كما هو موضح في القسم 1.1.2 إلى 1.1.8). وضع ساترة على لوحة.
ملاحظة: لوحة ليست في حاجة إلى أن تكون مختومة مع صمغ لهذه التجربة أن ينطوي على اكتساب قصيرة. - استخدام الهدف والنقيض من المرحلة 10X إضاءة لقياس طول اليرقات إذا تم استخدام كاميرا عالية الدقة. زيادة شدة الضوء لتكون قادرة على التقاط الصور في أجزاء قليلة من الثانية والحصول بالتالي على صورة واضحة لليرقات (الشكل 2D).
ملاحظة: في حين يتم تخفيض trashes السباحة من اليرقات لوحة الاغاروز، فهي لا تزال تتحرك. ولذلك، تسجيل سريع ضروري للحصول على صورة واضحة. - فتح فيجي يماغيج وكرر الخطوة 1.3.1. لقياس طول اليرقات، واختيار أداة خط مجزأة. رسم خط مجزأة من طرف رئيس يصل إلى طرف الذيل التالية خط الوسط من اليرقات (الشكل 2D، اللوحة اليمنى).
- باستخدام القائمة تحليل / قياس، يجب الحصول على طولالخط الذي رسمته المقابلة لطول اليرقات في ميكرون.
- اعتقلت أجهزة الطرد المركزي L1 اليرقات في 3500 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف. Resuspend واليرقات في 100 ميكرولتر من العازلة M9 ونقلها على لوحة agarose باستخدام ماصة باستير (منصات الأغاروس يجب إعدادد كما هو موضح في القسم 1.1.2 إلى 1.1.8). وضع ساترة على لوحة.
3. توصيف العيوب في وقت متأخر استطالة عن طريق التدفق الخلوي
- مزامنة يرقات
- تنقية أجنة باستخدام العلاج هيبوكلوريت قلوية كما هو موضح في القسم 2.1 من كامل 100 ملم لوحات من الشباب تغذية جيدة وترك فتحة جنين واعتقال L1 في المخزن M9 من 16 إلى 24 ساعة في 20 أو 25.5 درجة مئوية تبعا لسلالة تحليل.
ملاحظة: واحد لوحة كاملة من البالغين تغذية جيدة في سلالة كافية للتحليل هو موضح أدناه.
- تنقية أجنة باستخدام العلاج هيبوكلوريت قلوية كما هو موضح في القسم 2.1 من كامل 100 ملم لوحات من الشباب تغذية جيدة وترك فتحة جنين واعتقال L1 في المخزن M9 من 16 إلى 24 ساعة في 20 أو 25.5 درجة مئوية تبعا لسلالة تحليل.
- معايرة فارز دودة
ملاحظة: قياس التدفق الخلوي المستخدمة هنا هي تدفق الجسيمات كبير الكريات (يشار إليها فيما فارز دودة). يتضمن فارز الدودة 670 نانومتر ليزر ديود الأحمر، الذي يقع أمام كاشف الانقراض. يحتوي على فارز دودة أيضا متعدد الخطوط الأرجون ليزر لإثارة الفلورسنت. لياليأدوات tandard لها ثلاثة أنابيب مضخم للكشف عن (PMT) مضان تستخدم للكشف عن انبعاث مضان في المناطق الخضراء، والصفراء، والحمراء من الطيف. في بروتوكول الموصوفة هنا، وسوف تستخدم TOF لقياس حجم اليرقات، وسيتم استخدام القناة الحمراء لتحديد الديدان الميتة التي سيتم ملطخة التأيد Propidium (PI). GP (الغرض العام) عالية الإسفار مراقبة الجزيئات المستخدمة لمعايرة أجهزة القياس وباعتبارها الرقابة الداخلية في تجربتنا عرض مضان عالية باللون الأخضر والأصفر والأحمر. وسوف تكون الكائنات الوحيدة في عينة تم تحليلها مع الانبعاثات العالية في الكشف عن قناة الخضراء وسيجري بعد ذلك حددت بناء على هذه الصفة.
يتم تحديد الحيوانات الحية على أساس غياب مضان في قناة الأخضر والأحمر وكذلك على TOF: ملاحظة. الانبعاثات Autofluorescent من القناة الهضمية لليرقات هو لا يمكن كشفها في مرحلة L1.- التبديل على كتلة ليزر، والكمبيوتر، وضاغطد الصك دودة فارز. اضغط على زر ستارت على برنامج فارز دودة فتح كما هو مبين في دليل التعليمات الصك.
- مراقبة نافذة منبثقة السيطرة الأرجون ليزر. تحديد وضع تشغيل والانتظار كما تصل القوى الليزر 10 ± 1 ميغاواط. اختر حررت في إطار التحكم الليزر.
- تعيين غمد والضغوط عينة إلى 5.10 ± 0.02 و 5.51 ± 0.01 على التوالي. السماح للضغط لكي تتوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل ثم انقر فوق خانة الاختيار موافق الضغط.
ملاحظة: معدل تدفق يعتمد على غمد والضغوط العينة. - للتأكد من القضاء على جميع الفقاعات الموجودة في الأنابيب قناة تدفق بين كوب عينة وغرفة تحليل. للقيام بذلك، انقر فوق الحصول على ونفض الغبار بلطف أنبوب صغير حتى يتم الحصول على أي فقاعة (كما رأينا في نافذة الاستحواذ).
- إعداد جميع المعلمات لقياس الفلورسنت وTOF والكشف على النحو التالي:
- تعيين جداول لTOF، تحويلة، الأخضر، الأصفر والأحمر256. ربح مجموعة كما هو موضح في الجدول رقم 1. تعيين التحكم PMT في 700 لالاخضر والاصفر وإلى 900 الأحمر.
ملاحظة: تتوفر (488 نانومتر و 514 نانومتر) اثنين من المرشحات الإثارة، ويمكن استخدامها لإثارة إما البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أو البروتين الفلوري أصفر (YFP) أو أي fluorochromes متحمس في هذه الموجات مع ليزر الأرجون متعدد الأسطر. لا بد من إدراجها في غرفة مرشح للمعدات الفلاتر المناسبة. استخدمنا تصفية 488 نانومتر للتجربة التالية.
- تعيين جداول لTOF، تحويلة، الأخضر، الأصفر والأحمر256. ربح مجموعة كما هو موضح في الجدول رقم 1. تعيين التحكم PMT في 700 لالاخضر والاصفر وإلى 900 الأحمر.
- لمعايرة فارز دودة، حدد "الجسيمات تحكم تشغيل" في القائمة أداة. وضع 20 مل من 1X GP (الغرض العام) الجسيمات في السيطرة على ارتفاع الإسفار في الكأس (هذه الجسيمات هي جسيمات الفلورسنت من حجم الدقيق، المباعة من قبل الشركة المصنعة الخلوي لمعايرة صك).
- انقر على زر اكتساب للبدء في غمد وتدفق العينة.
ملاحظة: توقع وسيلة المتعلقة بتوزيع مراقبة الجسيمات من 21 ± 6 و ميلانoefficient الاختلاف حول هذا المتوسط (CV) ≤11. إذا كانت السيرة الذاتية هي> 11 وسيلة هي> 27 محاولة لتنظيف الأنابيب من خلال النقر عدة مرات على الزر نظيفة أو عبها قناة التدفق.
- الحصول على TOF الحيوان
ملاحظة: ضوء ينثر عندما يمر كائن في الخلية التدفق بين مصدر الليزر وكشف الانقراض. الوقت الذي يستغرقه الضوء لتكون مبعثرة من قبل جسم طائر (وقت الرحلة، TOF) يستخدم لقياس طول محوري للكائن. يتم استخدام درجة الضوء من قبل ملثمين الكائن (الانقراض، EXT) كمقياس لالتعتيم / كثافته البصرية.- ضع 10 ميكرولتر من متزامنة البرية من نوع (وزن) L1 في الزجاج ووتش وتقدير النسبة المئوية للبيض الميتة باستخدام مجهر تشريح.
ملاحظة: تزامن L1 عرض عالية التطريز (أعلى من 20٪) في وزن لا ينبغي أن تستخدم لمزيد من التحليل. - نقل مزامنة L1 من microcentrifuge ل(أpproximately 700 ميكرولتر من M9 التي تحتوي على L1) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة يوديد propidium (PI) بتركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل (1/100 تخفيف عشر من 1 ملغ / مل حل الأسهم)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: سيتم ملطخة البيض الميت واليرقات باستخدام PI والكشف عن ككائنات الفلورسنت بشدة استخدام القناة الحمراء. - إضافة 10 مل من العازلة M9 لتمييع السكان الملون. خذ 5 مل من السكان تضعف وتضعف منهم أربع مرات من خلال إضافة 15 مل من M9. وضع هذا التخفيف في كأس العينة.
- تشغيل تدفق عينة من الحصول على النقر ومراقبة معدل التدفق.
ملاحظة: من أجل الحصول على قياس دقيق، ينبغي أن يكون معدل تدفق البقاء بين 15 و 25 الأشياء / ثانية. - إذا لزم الأمر، وضبط كمية من الحيوانات في الكأس لتصل إلى معدل التدفق المطلوب.
ملاحظة: إن إرادة معدل التدفق يعتمد على الضغوط (غمد والعينة) التي هي ثابت كما هو مبين في 3.2.3 وعلى تركيز ط يرقاتن الكأس. إذا كان معدل تدفق أعلى من 25 الأشياء / ثانية إضافة بعض عازلة في الكأس. إذا كان أقل من 15 الأشياء / ثانية إضافة L1 المركزة (من الخطوة 3.3.3) في الكأس. - مرة واحدة يتم الوصول إلى التركيز المناسب من وجوه، وتقييم حجم في كوب وإضافة 1/4 عشر من هذا الحجم في حل العليا نيون GP مراقبة الجسيمات 4X.
- ضبط النابضة والفرز المعلمة. للقيام بذلك، انقر فوق "المحاصرة" في القائمة واختر 'TOF مقابل " و'الأخضر'. انقر على "الفرز" في القائمة واختر 'TOF مقابل "و" الأحمر ". والمحاصرة والرسومات والفرز ثم تظهر كما هو مبين في الشكل 3A.
ملاحظة: سيسمح هذا التصور من الجزيئات التحكم (الانبعاثات في الأخضر والأحمر)، والحيوانات الميتة ملطخة PI وفقاعات (الانبعاثات في الأحمر وليس الأخضر) والحيوانات الحية (أي انبعاث في قنوات لا أخضر ولا أحمر) (الشكل 3A ). - تشغيل التجربة بالنقر ACQUIRE.
ملاحظة: لتحديد حجم الخلافات الصغيرة بين اليرقات وتحليل حوالي 10،000 الأشياء، لذلك ما يقرب من 8000 من الحيوانات. إيقاف التجربة وتصدير البيانات كما بتنسيق txt عن طريق النقر على مخزن.
- ضع 10 ميكرولتر من متزامنة البرية من نوع (وزن) L1 في الزجاج ووتش وتقدير النسبة المئوية للبيض الميتة باستخدام مجهر تشريح.
- قياس الحجم النسبي للحيوانات الحية في المتزامنة السكان
- فتح ملف txt باستخدام البرمجيات قادرة على إدارة جداول البيانات الكبيرة.
- من الكائنات تحليلها واستخراج القيم TOF يرتبط مع جزيئات السيطرة التي تتميز الانبعاثات في القناة الخضراء أعلى من 100 وحدات التعسفي (هذه القيمة تعتمد على المعايير المحددة في القسم 3.2.5). إنشاء عمود جديد والذي يطلق عليه "جسيمات السيطرة". إنشاء عمود يحتوي على جميع الكائنات الأخرى باستثناء الجسيمات السيطرة يسمى "عينة". ملاحظة: انبعاث مضان من احتياجات الجسيمات دفعة جديدة ليتم التحقق منها قبل البدء في عمليات الاستحواذ. هذا وسوف يحدد عتبة الفلورسنت تمكن من تحديدالجسيمات السيطرة على L1s.
- لكل سلالة تحليل تحديد جزء من التجربة حيث تم تغيير معدل التدفق (بسبب وجود المكونات البيض على سبيل المثال). للقيام بذلك:
- رسم TOF من "الجسيمات السيطرة" لكل عينة كعامل من الزمن (الشكل 3B).
- رسم خط الاتجاه الخطي باستخدام أداة خط الترند وعرض المعادلة على الرسم البياني.
ملاحظة: إن TOF الجسيمات السيطرة يجب أن تكون ثابتة على مر الزمن (خط أفقي، الشكل 3B). النظر في معادلة خط الاتجاه الخطي المرسومة على ذ البيانات = الفأس + ب، تأكد من أن "أ" القيمة هي أقل أن 10 -4. يجب إزالة جميع القياسات التي أجريت في أقسام وقت عرض تمزق في المواءمة بين الجسيمات التحكم من التحليل.
- إزالة الأجنة الميتة وفقاعات (انبعاث أعلى من 15 في المنطقة الحمراء)، وكذلك الحطام صغيرة والمقابس بيضة كبيرة (TOF أقل من 10 وعاليةإيه من 70 على التوالي) من قياس "عينة".
- رسم التوزيع "الجسيمات السيطرة" لكل سلالة تحليلها. كما رأينا في الشكل 3C هذه التوزيعات يجب أن تراكب تماما تقريبا. وهذا يضمن أن القياسات التي تم الحصول عليها TOF لسلالات مختلفة يمكن مقارنتها. ملاحظة: التطبيع من عناصر عينة TOF على جزيئات السيطرة يمكن أن تستخدم إذا كان توزيع الجسيمات تحكم في عينة لا تراكب مع أن عينات المقارنة. يتم احتساب TOF تطبيع النحو التالي:
- تطبيع TOF عن التركيب الوراثي G = (عينة TOF لG) / (متوسط "مراقبة الجسيمات TOF لG) س (المتوسط" الجسيمات السيطرة "TOF للوزن) حيث بالوزن هي العينة الضابطة.
- رسم توزيع يرقات TOF لكل سلالة منها العينة الضابطة، في حالتنا وزن الحيوانات (الشكل 3D). قياس المتوسط والخطأ المعياري للمتوسط (SEM) لكل السكان (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هولست Tail- ورئيس / الذيل عرض نسبة هي القياسات قوية.
وقد تم استخدام البروتوكولات المذكورة هنا بنجاح لتوصيف وظيفة من المنظمين والمؤثرات رو GTPases بيكسل-1، باك-1 والسماح-502 أثناء استطالة وقت مبكر 7. بيكسل-1 والباكستانية (1) رمز على التوالي لعامل جوانين الصرف (GEF) والمستجيب محددة لراك / Cdc42 GTPases والسماح-502 رموز لالمستجيب لرو 1 7. في هذه الدراسة، عرضت بيكسل-1 وباك-1 للسيطرة على البشرة التشكل خلال استطالة وقت مبكر 7. هذه الدراسة تستخدم الرأس والذيل عرض قياس كما المقاييس تظهر لأول مرة، أن خلايا الطبقة الجلدية التي تقع في الإدارة الانتخابية الأماميريو متابعة برامج morphogenic مختلفة عن تلك الموجودة في الخلفية لها 7. لإنشاء استنساخ ومتانة هذه المقاييس، وقد تم قياس عرض رئيس مستقل خمس مرات في 12 من النوع البري (بالوزن) الأجنة في مرحلة 1.2 أضعاف. وتمت مقارنة الفروق بين المجموعات المختلفة خمسة القياس ثم تقييمها باستخدام اختبار براون فورسيذي (باستخدام الحزمة الإحصائية R) يكشف عن عدم وجود اختلافات كبيرة بين القياسات (F- اختبار قيمة P-> 0.5، الشكل 4A) مما يدل على أن القياسات لمجموعة من الأجنة استنساخه. وقد تم تقييم استنساخ دفعة والآثار المرتبطة بهذه القياسات من خلال قياس عرض رئيس الأجنة بالوزن في المرحلة 1.2 أضعاف من التصوير 4D مدينة دبي للإنترنت عمله على ثلاثة أيام مختلفة (ن = 12 الأجنة). عبر هذه الجماعات القياس الثلاثة، كان التباين لا تختلف كثيرا وتم العثور على أي آثار دفعة كبيرة للتأثير على الرأس ثالنتائج idth قياس (F-اختبار ص -value> 0.5، الشكل 4B).
وتم الحصول على نتائج مماثلة لقياس عرض الذيل ولقياسات القيام به في مراحل مختلفة من استطالة في وقت مبكر (لا تظهر البيانات). أنشأت هذه البيانات الرأس العرض، الذيل العرض ورئيس / نسبة العرض الذيل كما مقاييس قوية لتوصيف العيوب استطالة في وقت مبكر.
قياس الرأس والذيل العرض وكذلك طول الجنين يسمح لتوصيف الجينات المسؤولة عن الاستطالة في وقت مبكر على طول محور انتيرو-الخلفي من الأجنة.
وقد تم قياس طول الأجنة، فضلا عن عرض الرأس والذيل على الأجنة WT ومتحولة تحمل خالية أو للحرارة قوية الخسارة من الأليلات وظيفة لالجينات المسؤولة عن استطالة في وقت مبكر: بيكس-1 (gk416)؛PAK-1 (ok448) والسماح-502 (sb118ts) 7. قمنا بقياس رأس / ذيل (H / T) نسبة العرض للأجنة WT ومتحولة في بداية (المرحلة 1.2 أضعاف)، وفي نهاية استطالة في وقت مبكر في درجات حرارة غير متساهلة (الشكل 4C اليسار واللوحة اليمنى على التوالي). وفي بداية استطالة في وقت مبكر لم يكن هناك change- أو انخفاض H / وحظ نسبة تي في بيكس-1، باك-1 والسماح-502 المسوخ بالمقارنة مع الحيوانات WT (المرحلة 1.2 أضعاف، الشكل 2C، اللوحة اليسرى )، في نهاية استطالة في وقت مبكر وأظهرت جميع المسوخ ثلاثة لأعلى بكثير H / T نسبة من الأجنة وزن (ر -test ص -values <0.006، الشكل 4C، اللوحة اليمنى). أثبت هذا أن بيكسل-1، باك-1 والسماح-502 الأجنة متحولة عرض غير طبيعي التشكل انتيرو الخلفي في نهاية استطالة في وقت مبكر. مزيد من التحليل مقارنة عرض الرأس والذيل العرض بين هذا وذاككشفت ن المرحلة 1.2 أضعاف، ونهاية استطالة في وقت مبكر، وذلك باستخدام معايير القياس نفسها أن عرض رئيس وأقل تخفيض في بيكس-1، باك-1 والمسوخ 502 السماح في حين عرض ذيل يقلل أقل بكثير في المسوخ هوادة 502 فقط 7. هذا وكشف أن تدع-502 ضوابط عمليات morphogenic بالمثل على طول المحور انتيرو الخلفي للجنين، في حين بيكسل-1 وباك-1 مراقبة العمليات morphogenic تحدث أساسا في الجزء الأمامي من الجنين 7. وقد تم قياس أيضا الفرق بين طول الأجنة في نهاية مقابل بداية من استطالة في وقت مبكر (الشكل 4D). لقد وجدنا أن تم تخفيض استطالة في وقت مبكر إلى حد كبير في بيكس-1، باك-1 والسماح-502 المسوخ مقارنة بالوزن مما يوحي بأن تغيير في التشكل الأمامي في بيكس-1 وباك-1 المسوخ وحدها غير كافية لخفض كبير في elongatioن الجنين.
استخدمت بروتوكول 2 و 3 لتقييم طول اليرقات اعتقل في الخلفيات WT ومتحولة. تم تقييم طول هذه اليرقات باستخدام كل من تحليل الصور (بروتوكول 2) (7) والتدفق الخلوي (بروتوكول 3؛ بيانات غير منشورة). قياسات طول اليرقات استخدام نتائج تحليل الصور في القياسات المطلقة من طول الحيوانات في ميكرومتر في قوة وتكرار للغاية بطريقة (الشكل 5A). وكشف هذا التحليل أن تزامن العرض يرقات متحولة إلى خفض كبير طول مقارنة بالوزن (الشكل 5A) 7. أعطى قياس هذه اليرقات باستخدام بروتوكول التدفق الخلوي إلى (بروتوكول 3) نتائج مماثلة (الشكل 5B). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن عدد كبير من اليرقات قياسها باستخدام النهج الأخير زيادة كبيرة في قوة الإحصائية المقارنة الوراثي (ر - -values اختبار ص <10 -24). وبناء على هذه النتائج، قد يكون نهج التدفق الخلوي الخيار الأفضل خلال تحليل الصور من أجل تميز الحيوانات متحولة عرض العيوب استطالة دقيق جدا.
الشكل 1. إعداد لوحة agarose. A، شريحة المجهر وضعت بين اثنين من الشرائح فاصل من قبل اثنين من طبقات من الشريط اللاصق. ب تغطيتها، ويغطي وسادة الاغاروز مع شريحة أخرى مدعومة من قبل اثنين من-الشرائح فاصل. C، والشكل النهائي وحجم وحة agarose بعد قطع مع شفرة حلاقة لتناسب ساترة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
g2.jpg "/>
. الشكل 2. قياس العيوب الاستطالة في وقت متأخر في وقت مبكر و A - B، قياس طول الجنين في مرحلة فاصلة (A) وفي نهاية استطالة في وقت مبكر (B). وجه خط أحمر، وتستخدم لقياس الأجنة باستخدام أداة سطر مجزأة من يماغيج جيم، رئيس وعرض ذيل تقاس في الأجنة في مرحلة 1.2 أضعاف (يسار) وفي نهاية استطالة في وقت مبكر (يمين). وتمثل الأسهم توطين المناطق قياس (معدلة من مارتن وآخرون، 2014). مقياس شريط: 20 ميكرومتر D، يتم قياس طول اليرقات لتزامن L1 اليرقات. لوحة اليمنى موسع للرأي من الصورة التي تم التقاطها (يسار). ولفت الخط الأحمر باستخدام أداة سطر مجزأة من يماغيج. فهو يستخدم لقياس طول اليرقة. شريط مقياس: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الصورة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 3. قياس للطول المتزامنة اليرقات باستخدام التدفق الخلوي، ألف، المحاصرة والفرز نافذة COPAS Biosort تبين الأخضر والأحمر الانبعاثات من الجسيمات السيطرة، فقاعات، القتلى والحيوانات التي تعيش فيما يتعلق بهم الوقت من الطيران (TOF ) باء، TOF الجسيمات التحكم في نقاط زمنية مختلفة لتجربة تمثيلية. المنحدر من دالة خطية من TOF مقابل الساعة حوالي 10 -5، مشيرا إلى أن TOF الجسيمات السيطرة هو ثابت على مر الزمن في كافة مراحل التجربة. C، توزيع TOFs الجسيمات السيطرة كنسبة مئوية من قيمة القصوى من التوزيعات. وتتمثل توزيعات مراقبة الجسيمات غير طبيعية وتطبيع للباك 1 (ok448). التوزيعات الأخرى ليست طبيعية. D، وتوزيع TOFs للعيشأعربت الحيوانات كنسبة مئوية من القيمة القصوى من عمليات التوزيع. TOFs ليست طبيعية على جزيئات تحكم باستثناء باك 1 (ok448) كما هو مبين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. بيكس-1، باك-1 والمسوخ دعونا-502 الحالية العيوب في وقت مبكر الاستطالة. أ - ب، القدرة على التكاثر ومتانة تقييم رئيس العرض القياسات A، خمسة قياسات مستقلة عن عرض رئيس لأجنة بالوزن في المرحلة 1.2 أضعاف (ن = 12 الأجنة). يشار إلى المتوسطات الحسابية والانحرافات المعيارية (أشرطة الخطأ). حسبت غير (م) فروق ذات دلالة إحصائية بين القياسات باستخدام اختبار براون فورسيذي (لناجي آر الحزمة الإحصائية) (F-اختبار القيمة الاحتمالية> 0.5). B، رئيس قياس عرض للأجنة WT في ثلاثة أيام مختلفة (ن = 12 الأجنة). يشار إلى المتوسطات الحسابية والانحرافات المعيارية، وكذلك؛ لم يكن هناك اختلاف كبير في التباين عبر القياسات (NS؛ براون فورسيذي F-اختبار قيمة P-> 0.5) C، توزيع نسبة عرض رئيس / الذيل في المرحلة 1.2 أضعاف (من اليسار لوحة)، في نهاية وقت مبكر. استطالة (اللوحة اليمنى) في وزن، دعونا-502 (sb118ts) المسوخ في 23 بيكسل-1 (gk416)، باك 1 (ok448) و- 24 درجة مئوية. لاحظ أن الأمهات من الأجنة السماح-502ts المستخدمة في هذه الدراسة كانت تزرع في 25.5 درجة مئوية. D، توزيع استطالة في وزن، بيكس-1 (gk416)، باك 1 (ok448) والسماح-502 (sb118ts) المسوخ بين مرحلة فاصلة وبداية من أواخر استطالة. تمثل المؤامرات مربع دقيقة، كحد أقصى، الموافق 25، 50 ث (الوسيط) و 75النسب المئوية الخامسة من السكان. * ر -test ص -value <0.05، ** ر -test ص -value <0.006 (معدلة من مارتن وآخرون، 2014). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. بيكس-1 (gk416)، باك 1 (ok448) ولام آخرون-502 (sb118ts) يرقات الحاضر طول العيوب. A، طول اليرقات تقاس بالوزن، بيكس-1 (gk416)، باك 1 (ok448) والسماح-502 (sb118ts) الحيوانات تقاس باستخدام تحليل الصور (بروتوكول 2). B، النسبي طول اليرقات تقاس باستخدام تدفق عداد الكريات ( بروتوكول 3). الأرقام بين قوسين تتوافق مع عدد الحيوانات المستخدمة في الالقياسات الإلكترونية. ومثله؛ (أشرطة الخطأ SEM) وسائل أطوال والخطأ المعياري للمتوسط. يشار إلى ر الطالب -test القيم P- (ع). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول مقاييس جديدة للتميز في وقت مبكر ومراحل متأخرة من استطالة الجنينية.
في الباب 1، الخطوة الحاسمة هي احتمال وجود البكتيريا على لوحة. وأرفقت الأجنة بإحكام بين لوحة وساترة خلال الحصول على الصور. ختم الشريحة هو مطلوب لتجنب جفاف الحيوانات خلال الاستحواذ الذي يستمر أكثر من ساعتين. على حد علمنا، فإن أيا من الأختام المستخدمة لتركيب منصات الأغاروس بين الشرائح وساترة ونفاذية الهواء. ونتيجة لذلك، عندما كمية كبيرة من البكتيريا (أو الأجنة) موجود على لوحة، فإنها قد يحرم من الأكسجين بعد بضع ساعات مما أدى إلى وفاتهم المبكرة. وجود أجنة ثلاثة أضعاف - الموافق الأجنة التي هي 3 أضعاف في طول مقارنة الأجنة غير ممدود - سجلت جنبا إلى جنب مع الأجنة من الفائدة سيكون مؤشرا جيدا لظروف نقص الأوكسجين المحتملة، منذ تلك الأجنة سوف يتوقف عن الحركة في theiقشر البيض (ص) في غياب الأكسجين. وينبغي أن يتم لا القياسات المورفولوجية في ظروف نقص الأوكسجين أو على الأجنة الميتة.
خطوة أخرى حاسمة عند استخدام الوقت الفاصل بين التصوير هي درجة الحرارة التي يحدث تطور الجنين. تستخدم المسوخ للحرارة حاليا في C. ايليجانس. تأثير البيولوجي للتحول درجة الحرارة قد يكون فوريا أو يتأخر تبعا لعمر النصف من البروتين وطبيعة الطفرة التي يحملها. ونتيجة لذلك، يجب أن تكون درجة الحرارة التي يتعرض لها الجنين مستمر مع مرور الوقت، وينبغي أن يسيطر عليها التهوية المناسبة للغرفة الفحص المجهري أو غرفة التبريد والتدفئة على المسرح المجهر.
القسم 2 يعتمد على تزامن اليرقات باستخدام العلاج هيبوكلوريت قلوية. في ظل ظروف معينة، وهذا العلاج قد يؤدي إلى الفتك الجنينية (التطريز). التطريز أكثر من 20٪ في عدد السكان وزن يدل على وجود سمية مرتفعة خلال علاج هيبوكلوريتمنة التي قد تؤثر سلبا على التشكل. L1 متزامنة عرض عالية التطريز في الخلفية WT لا ينبغي أن تستخدم لمزيد من التحليل. ينطبق هذا التقييد أيضا إلى بروتوكول 3.
نحن لا نوصي باستخدام أدوية التخدير لشل حركة اليرقات. ليفاميسول على وجه الخصوص، يشل الديدان الخيطية من خلال تحريض تكزز العضلات التي تتجه الى تقليص اليرقات عرضة للتحيز التجريبية. إذا كان الوقت التعرض ليست سريعة بما فيه الكفاية نتيجة القيود المفروضة على المجهر، ونحن نوصي الحد من الحركة من اليرقات عن طريق زيادة تركيز الاغاروز في لوحة والحد من كمية السائل بين لوحة وساترة. ينبغي توخي الحذر مع ذلك، لا يجفف اليرقات، منذ جفاف سوف يقلل حجمها.
في الباب 3، قياس طول اليرقات تستخدم المقارنة بين معدلات التدفق بين العينات التي تم تحليلها. للقيام بذلك، وتوزيع الجسيمات تحكم يحتاج إلى أن تكون المقارنةأحمر. إذا توزيعات تراكب تماما، وTOF (الوقت من الطيران) القيم التي تم الحصول عليها لعينات المقابلة يمكن مقارنة، إن لم يكن، لا بد من تطبيع هذه القيم. (كما هو مفصل في 3.4.5.1) وقد استخدم تطبيع عينة TOF السيطرة الجسيمات TOF بنجاح كما هو مبين لباك-1 (ok448) (الشكل 3C والشكل 5B). تم العثور على طول النسبي للباك 1 (ok448) مقابل وزن لتكون مشابهة في لا يقل عن 3 تجارب مستقلة مع أو بدون تطبيع (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، فإننا نوصي، مما يؤكد النتائج التي تم الحصول عليها مع التطبيع مع تلك التي تم الحصول عليها دون ذلك، خصوصا عند مقارنة اليرقات مع وجود اختلافات صغيرة الحجم. وتجدر الإشارة إلى أن قياس طول اليرقات باستخدام التدفق الخلوي يوفر طول قريب على عينة السيطرة، في هذه الحالة، وزن اليرقات بدلا من طول المطلق في ميكرومتر بالنسبة للتحليل الصور. وهذا يعني أن القياسات من تجارب مستقلة لا يمكنيمكن الجمع بين ما لم حساب نسبة حجم على بالوزن.
سوف العازلة المستخدمة للتخفيف في كوب عينة يكون لها تأثير على معدل التدفق. لاحظنا أن عازلة غمد الموصى به من قبل الشركة المصنعة يحتوي المنظفات التي تزيد من كمية فقاعات ولدت خلال الاستحواذ. باستخدام عازلة M9، التي لا تحتوي على مواد التنظيف، وانخفاض كبير في تشكيل فقاعات ولكن كان أقل كفاءة في تجنب انسداد البيض في الأنابيب من فارز، مما يؤثر على معدل تدفق العينات. تم الكشف عن يسد البيض بسهولة خلال اكتساب انخفاض ملحوظ في TOF يمكن ملاحظتها من الجسيمات السيطرة لبضع ثوان يليه TOF- مرتفعة أيضا لبضع ثوان. قد يؤدي يسد البيض أيضا إلى عرقلة القناة واعتقال كاملة من تدفق الجسيمات (أقل من 5 الأجسام في الثانية الواحدة). إذا كان هذا ينبغي أن يحدث، انقر على زر نظيف حتى يتم استعادة معدل التدفق. أي القياسات التي تحدث خلال هذه الحدثالصورة ينبغي استبعادها من تحليل البيانات. قد يوصى العازلة غمد عن التجارب التي تنطوي على سلالات تتميز بنسب عالية من البيض ميتة.
الضغط عينة وغمد (وضعت في الخطوة 3.2.3)، قد تتغير (قليلا) مع مرور الوقت، وينبغي تعديلها يدويا في كافة مراحل التجربة من أجل ضمان معدل تدفق ثابت للغاية. وخفض أو زيادة في معدل منخفض يكون ملاحظتها عند تحليل النتائج والتآمر على TOFs الجسيمات السيطرة على الوقت (الشكل 3C). والحد من معدل تدفق يؤدي إلى زيادة متوسط TOFs الجسيمات مع مرور الوقت، في حين أن الزيادة في معدل تدفق سيؤدي إلى عكس ذلك. سوف تغير من معدل تدفق تؤثر سلبا على حساسية هذه الطريقة في الكشف عن حجم الخلافات الصغيرة بين السكان من اليرقات.
الطرق التي تهدف إلى تحديد الجينات المسؤولة عن استطالة وتتطلب الوقت الفاصل بين تسجيل المجهر مرتفعة بصفة عامةلاي تستغرق وقتا طويلا ومملا عندما phenotyping عدة المورثات. النهج القائم على تدفق عداد الكريات، في حين تتطلب معدات غير متوافرة لجميع المختبرات، وأقل استهلاكا للوقت، وبالتالي أكثر كفاءة عندما تحتاج إلى وصفها عدة سلالات. هذا الأسلوب هو أيضا أكثر قوة إحصائية مقارنة القياسات باستخدام تحليل الصور (المقررة من قبل اختبار تي الطالب مقارنة التوزيعات متحولة ووزن TOF، الشكل 5A وباء). هذه الطريقة قد تكون ثم مناسبة للغاية لسلالات معربا عن عيوب استطالة مع انخفاض تعبيرية / انتفاذ.
وقد وضعت العديد من الطرق باستخدام التدفق الخلوي في الماضي لقياس اللياقة البدنية من الديدان الخيطية 9-12. هذه الأساليب تستخدم الحيوانات الاستغناء في لوحات 96-جيدا وحدة رد الفعل من فارز دودة ". وحدة رد الفعل تمكن التحليل المباشر للسكان الخيطية الاستغناء في لوحات 96-جيدا. ونتيجة لذلك، وهذه الأساليب هي قادرة على شخصيترايز المئات من الظروف يوميا وتشكل بطريقة قوية حيث لقياس اللياقة البدنية للسكان غير متزامنة. ولكن، لا تناسب بشكل جيد لتحديد حجم الخلافات الصغيرة بين L1 متزامنة. قياس الفروق الصغيرة بين L1 اليرقات يتطلب قياس عبر عدد كبير من الحيوانات، وهو ما يتنافى مع استخدام لوحات 96-جيدا ومن حدة رد الفعل التي قد تميز 100 الأشياء بكفاءة على الأكثر لكل بئر. تم تصميم الأسلوب هو موضح هنا لهذا الغرض على حساب الإنتاجية، التي خفضت بشكل ملحوظ. فإنه يمكن توصيف 3-4 الأوضاع في ساعة مرة واحدة يتم معايرة الصك، وهو تحسن ملحوظ على استخدام تحليل الصور في بروتوكول 2.
قياس نسبة الرأس والذيل والعرض هو الطريقة الأولى التي وضعت لتميز العمليات morphogenic تحدث بشكل غير متساو على طول المحور انتيرو الخلفي للجنين 7. متىتطبق على الجينات يظهر للسيطرة على استطالة في وقت مبكر، وهذه الأساليب توضح التوزيع المكاني للمسارات إشارات السيطرة على التشكل في تلك المرحلة. سوف قياس طول اليرقات اعتقال باستخدام تحليل الصور أو التدفق الخلوي في تركيبة مع قياس طول الجنين في نهاية استطالة في وقت مبكر يمكن تحديد الجينات المسؤولة إما استطالة مبكرة أو متأخرة أو كليهما مع حساسية عالية ودقة. ثم يمكن أن تسهم هذه الإجراءات إلى حد كبير في فهم المستقبل من التنظيم المكاني والزماني لمسارات الإشارات السيطرة على استطالة الجنينية في C. ايليجانس. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تتكيف هذه المداخل لدراسة مسارات الإشارات السيطرة على طول الجسم مثل الأنسولين وعامل النمو التحويلي بيتا مسارات 13 و 14 و المزمن التعرض للملوثات البيئية 15 و 16. ويمكن القيام بهذه القياسات في مراحل اليرقات المختلفة أو في البالغين النقيبز اختلافات طفيفة من بروتوكولات 2 وحجم الخلافات 3. قياس في L1 هي اكثر صعوبة مع فارز دودة من الأجسام الكبيرة مثل L3، L4 اليرقات أو البالغين. بروتوكول 3 ويمكن بعد ذلك بسهولة أن تتكيف للقيام بهذه القياسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
