Introduction
Seit fast 50 Jahren gründeten die Nematode Caenorhabditis elegans sich als leistungsfähiges Modell wichtige Fragen in der Entwicklung, der Neurobiologie, evolution, Wirt-Pathogen - Interaktionen usw. 1 Die Stärke dieses Modells in der Studie der Entwicklung zu studieren , liegt in: seiner kurzen Lebenszyklus von 3 Tagen; die Leichtigkeit, mit der diese Tiere gentechnisch verändert werden; seine Transparenz, die die Beobachtung der Zell Verschiebung und Morphologie in lebenden Tieren und deren Entwicklung, die vor allem Extrauterin- ist ermöglicht. Die Entwicklungsstadien des Nematoden umfassen Embryonalentwicklung und vier Larvenstadien (L1 bis L4), gefolgt von Erwachsenenalter. Während der embryonalen Entwicklung, zog epidermal Morphogenese beträchtliche Aufmerksamkeit auf seine Fähigkeit, um ein besseres Verständnis davon, wie Epithelzellen wandern als Gruppe zu ermöglichen, wie sie ihre junctions reorganisieren und ändern ihre individuellen Morphologie sowie deren relative Positionierung innerhalb eines funktionellen Epithels.Epidermal Morphogenese ist in vier Stufen unterteilt: dorsale Einlagerungs bestehend in der Reorganisation der dorsalen epidermalen Zellen, als der Unterhaut bezeichnet; ventralen Gehäuse, in der Migration von ventralen hypodermal Zellen in Richtung der ventralen Mittellinie aus so den Embryo in einer epithelialen Zellschicht umhüllt; Früh- und Spät Dehnung Umwandlung der bohnenförmigen Embryos in vermiform Larven. Im Anschluss an die Morphogenese, Embryo Luke und L1-Larven beginnen mit den verfügbaren Bakterien in ihrer unmittelbaren Umgebung ernähren.
Embryonic Dehnung ist daher eine späte Phase der Embryonalentwicklung. Es besteht aus der Verlängerung des Embryos entlang seiner Längsachse und eine Verringerung seines Querdurchmesser. Dies bedeutet eine drastische Änderung der Form der hypodermalen Zellen. Dehnung ist unterteilt in eine frühe und eine späte Phase. Die frühe Phase beginnt mit dem Komma Bühne und endet , wenn die Körperwand Muskeln in w bei 1,75-facher Etappenvertragsild Typ (wt) Embryonen - entsprechend Embryonen , die 1,75-fache in der Länge im Vergleich zu nicht verlängert Embryonen. Morphogene Prozesse in diesem Stadium auftreten , werden in erster Linie durch die Kontraktion von fädigen Aktinbündel (FB) am apikalen Pol hypodermal Zellen angeordnet angetrieben, die ihre Dehnung entlang der anteroposterioren Achse des Embryos 2 fahren. Die Kontraktion der FBs ist die Kontrolle durch die Phosphorylierung von Myosin-Leichtketten durch drei Kinasen LET-502 / ROCK, MRCK-1 und PAK-1 5. Die Spätphase der Verlängerung beginnt, wenn die Körperwand Muskeln funktionsfähig werden und Contracting beginnen. Es geht um Mechanotransduktion Signalisierung von den Körperwandmuskulatur zu den dorsalen und ventralen hypodermal Zellen und endet , wenn die Tiere 3 schlüpfen.
Dehnungsfehler werden durch den Prozentsatz der Tiere als Embryonen (Embryonale Letalität; Emb) sterben im Allgemeinen gekennzeichnet und diejenigen zu verhaften ihre Entwicklung als L1-Larven (Larven Verhaftung Phänotyp; Lva) aufweist und deutlich kürzer als Gew. Bezeichnung des Stadium der Entwicklungsstopp erfordert mikroskopische Beobachtung von toten Embryonen und verhaftet Larvae 3-6.
Es wurde vor kurzem gezeigt , dass mehrere Gene, wie die Cdc42 / Rac Regler und Effektor pix-1 und pak-1, während morphogenic Prozesse steuern sowohl frühe als auch späte Dehnung 3,7. Wir zeigten auch vor kurzem , dass morphogenic Prozesse entlang der anteroposterioren Achse der Embryonen während der frühen Verlängerung 3 7 unterscheiden. Diese Erkenntnisse die Entwicklung neuer Metriken motiviert speziell frühe oder späte Verlängerung Stadien und anderen Metriken Targeting ermöglicht die Charakterisierung der Morphologie der Embryonen entlang ihrer anteroposterioren Achse während der frühen Dehnung.
Diese neuen Verfahren bestehen, um die Länge von Embryonen zu Beginn und am Ende des frühen Dehnung sowie die Breite der bei der Messung erAnzeigen und Schwänzen. 7 Zwei Protokolle wurden auch die Länge der frisch geschlüpften Larven zu messen entwickelt, synchronisiert auf L1 Stufe 7.
Die Eischalen der Embryonen schützen sie gegen alkalischen Hypochlorit-Behandlung während Larven, Erwachsene und Bakterien in den Kulturmedien durch die Behandlung gelöst sind. Diese Behandlung wird dann verwendet , Embryonen zu reinigen , aus einem nicht-synchronisierten Population eine Mehrheit von gut ernährt Erwachsene 8 enthält. Lebensmittel Einschränkung verwendet frisch geschlüpften Larven zu synchronisieren. Messen der Länge dieser Larven wird dann verwendet, Verlängerung Defekte zu detektieren. Diese Messung wird über die Messung der verhafteten Larven auf Kulturplatten bevorzugt, da Larven, die aus nicht vollständig länglichen Embryonen schlüpfen können "normale Länge" erholen, wenn Fütterung aber ihre reduzierte Größe beibehalten, wenn in Abwesenheit von Lebensmitteln festgenommen.
Hier präsentieren wir detaillierte Protokolle ermöglichen die Messung der lenge von Embryonen sowie die Breite des Kopfes und der Schwanz mit Zeitraffer-DIC-Mikroskopie und Bildanalyse (Protokoll 1) verlängert wird. Wir bieten auch detaillierte Protokolle über die Länge der synchronisierten Larven mittels Bildanalyse (Protokoll 2) und Durchflusszytometrie (Protokoll 3) zu messen.
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Protocol
1. Charakterisierung der frühen Mängel Dehnung in WT und Mutant Tiere
- Montage Embryonen für Normarski DIC - Mikroskopie
- Bereiten Sie die folgenden Kulturmedien und Material:
- M9 - Puffer, lösen sich 12,8 g / L Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L NaCl, 0,25 g / L MgSO 4 • 7H 2 O in destilliertem Wasser und Autoklaven zu sterilisieren.
- NGM - Platten, lösen sich 3 g / L NaCl, 16 g / L Agar, 2,5 g / l Bactopepton in ddH 2 O. Autoklaviert und fügen 1 mM MgSO 4, 1 mM CaCl 2, 1 mM Phosphatpuffer und 5 ug / ml Cholesterin. Gießen 6 ml NGM pro 60 mm-Schalen. Das Medium für 24 Stunden bei Raumtemperatur zu verfestigen. Fügen Sie ein paar Tropfen einer gesättigten Kultur von E. coli OP50 Bakterien in Luria - Brühe (LB) gezüchtet. Lassen die Bakterien für 48 Stunden wachsen und zu speichern, die Platten bei 4 ° C.
- Zur Erzeugung der Wurm pick, montieren Sie einen 0,01 "Durchmesser Platindraht auf einer kurzen Pasteurpipette. Befestigen Sie den Platindraht an das Ende des Glaspipette durch dieses Ende mit einem Benzol Brenner erhitzt wird. Glätten Sie das Ende des Drahtes eine Art Schaufel zu erzeugen.
- Wachsen die Wurmstamm auf 60 mm NGM-Platten mit OP50 bei 20 ° C.
HINWEIS: Wärmeempfindliche Allele erfordern kann bei bis zu 25,5 ° C, die Tiere bei nicht-permissiven Temperaturen wachsen. Die Platten sollten viele junge Erwachsene enthalten und immer noch genügend Nahrung, um die Protokolle zu verfolgen. - Platzieren Sie einen Objektträger zwischen zwei Distanzrutschen bedeckt durch zwei Lagen Abdeckband (1A).
- in 20 ml M9-Puffer durch Erhitzen in der Mikrowelle während 30 sec Bereiten einer 3% igen Agarose-Lösung (Gewicht / Volumen) in M9-Puffer von 0,6 g Agarose-Pulver aufzulösen. Lassen Sie die Lösung für 5 Minuten abkühlen lassen.
HINWEIS: Die Agarose-Lösung kann für einige Tage verwendet werden, nachdem in einem Mikrowellen schmelzen. Eskann auch bei 4 ° C über Wochen aliquotiert und gelagert werden. - Geben Sie einen Tropfen heißen 3% igen Lösung auf dem Glasträger zwischen den beiden Distanzrutschen. Vermeiden Sie Blasen bilden.
- Schnell decken die Agarose mit einer anderen Folie als sanft in 1B und drücken nach unten gezeigt. Die obere Folie wird die Agarose Tropfen flach und ein Kissen mit der Dicke von zwei Schichten aus Kreppband erzeugen.
- Erlauben die Agarose für mindestens 1 min bei Raumtemperatur zu verfestigen, oder bis die Embryonen sind bereit, auf die Unterlage übertragen werden.
- Mit Hilfe eines Schnecken Pick, Transfer 20 bis 30 gut gefüttert jungen Erwachsenen aus der NGM-Platte in einen Mikrozentrifugenröhrchen mit 400 ul M9-Puffer.
- Erlauben die Würmer etwa 5 min durch die Schwerkraft zu sedimentieren und der Überstand unter Verwendung einer Mikropipette entfernt werden. Dieser Schritt zielt darauf ab, die maximale Anzahl von Bakterien mit den Nematoden gepflückt zu entfernen.
- Mit 200 & mgr; l M9-Puffer zu jedem Röhrchen.
- Mit Hilfe einer Pasteur pipette, übertragen den Inhalt des Röhrchens (buffer und Nematoden) auf einem Uhrglas.
- Verwenden Sie eine oder zwei 25G 5/8 "Nadeln, die Tiere zu schneiden in der Mitte Körperabschnitt (zwischen dem Spermatheka und der Vulva).
ANMERKUNG: Eine Skalpellklinge kann auch als Alternative zur Nadel (n) verwendet werden. Tun Sie dies auf Schwimmen Nematoden und kann einige Übung erfordern. Die Idee ist, Nadeln wie Schere oder als Messer zu verwenden, je nachdem, wie viele Nadeln verwendet werden. Sobald die Tiere aufgeschnitten werden, lassen Hermaphroditen ihre Embryonen in den Puffer. - Konzentrat Embryonen in der Mitte der Uhr Glas durch Erzeugung eines kreisförmigen Wirbel in der Flüssigkeit.
- Entfernen Sie die meisten der M9 aus dem Uhrglas mit einer Mikropipette. Lassen Sie etwa 30 ul M9 mit den Embryonen.
- Entfernen Sie die Folie für den Agarose - Pad (1B) , indem Sie sie das Pad gleiten.
- Schneiden Sie das Pad mit einer Rasierklinge, um der Lage sein, vollständig zu bedecken mit einem Deckglas (1C).
- Mit Hilfe einer Pasteurpipette übertragen alle Embryonen (und Wurm Schutt) auf die Agarose-Pad.
- Gruppe die Embryonen in der Mitte des Pads mit der Wimper am Ende einer Spitze für 200 & mgr; l Mikropipetten verwendet geklebt werden.
- Platzieren Sie langsam ein Deckglas auf dem Pad zu vermeiden Blasenbildung und abdichten.
HINWEIS: Mehrere Versiegelungen verwendet werden kann. Wir verwenden Zeichnung Gummi in Kunst und Handwerk-Läden zu finden (in der Regel als Maskierung Gummi für aquarelle Malerei verwendet wird). Dieser Gummi wird verwendet, da es hydrophil ist und erstarrt relativ schnell und ist für die Würmer nicht toxisch. Dias können auch mit Nagellack oder VALAP (Mischung aus Vaseline, Lanolin und Parafin-Wachs) abgedichtet werden. - Lassen Sie die Zeichnung Gummi trocken für ca. 15 min.
- Bereiten Sie die folgenden Kulturmedien und Material:
- Aufnahme Frühe Elongation Vierdimensionale Normarski DIC - Mikroskopie
HINWEIS: Das Ziel dieses Schrittes ist frühen Elongation von Komma Anfang Ende Dehnung aufzunehmen- Definiert als der Moment, wenn die Körperwand Muskeln Contracting beginnen. Wir wollen auch mehr als ein Embryo in der Zeit aufzuzeichnen. Acht Stunden Aufnahme sind in der Regel erforderlich, um frühe Verlängerung für eine Gruppe von nicht synchronisierten Embryonen aufzuzeichnen.- Setzen Sie den montierten Schlitten auf der Bühne eines Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop mit 10X und 60X Ziele sowie DIC Linsen ausgestattet ist, Prisma, Kamera und Capture-Software ermöglicht Zeitraffer-Mikroskopie und die Erzeugung von Z-Stapel (automatisierte Z-Plattform).
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Temperatur zwischen 20 und 23 ° C in der Mikroskopie Raum konstant ist. Eine Heiz-Kühlkammer kann auf dem Mikroskoptisch erforderlich sein, insbesondere wenn thermo Mutanten verwendet. - Identifizieren einer Gruppe von Embryonen im Pre-Morphogenese Stufen der 10X-Objektiv verwendet wird.
- Sobald sich, schieben Sie die 10X-Objektiv und fügen Sie auf der Folie einen Tropfen Öl Tauchen.
- Mit dem 60X Ziel, identifizieren Sie die oben und unten von embryos zur Einrichtung der Z-Stapel Bildparameter.
HINWEIS: Zögern Sie nicht, den Z-Stack größer als die Dicke der Embryonen zu setzen. Die Entfernung zwischen zwei benachbarten Ebenen von 0,8 & mgr; m. Dies ermöglicht es in 35 bis 50 Z-Pläne, die Gesamttiefe der Embryonen zu decken.
HINWEIS: Wenn das Mikroskop ein automatisiertes XY-Plattform enthält, an verschiedenen Stellen des Polsters angeordnet Embryonen gleichzeitig aufgenommen werden können. Dazu koordiniert Datensatz xy jeder Standort auf dem Pad, das Sie wollen im Laufe des Experiments zu analysieren. Achten Sie auf die xy zu wählen, wenn die Aufnahmeparameter einstellen und den Rest des Protokolls folgen, wie angegeben. Thin Z-Sektionieren des Embryos während der Aufzeichnung wird für die Messungen in diesem Protokoll detailliert nicht unbedingt erforderlich. Aufnahme der embryonalen Entwicklung von wt und mutanten Tiere mit der maximalen Auflösung ist jedoch eine gute Praxis , um eine Bibliothek von Aufnahmen können zusätzliche Analysen zu bauen unterstützen. - Setup der Zeitraffer mit 2-Minuten-Intervallen zwischen zwei Akquisitionen nachhaltig 8 Stunden.
HINWEIS: Die Belichtungszeit von der Lichtintensität für das Mikroskop gesetzt abhängen. Zellbewegung während der frühen Dehnung ist sehr langsam; Belichtungszeit könnte etwa ein Bild pro Sekunde oder weniger sein. Wenn die Embryonen in einem frühen Morphogenese Stufen (dorsale Einlagerungs, ventralen Gehäuse) sind, würde eine frühzeitige Verlängerung innerhalb 1 Stunde aufgezeichnet werden. Stellen Sie sicher, Lichtblende ist zwischen jedem Erwerb geschlossen. - Führen Sie den Erwerb und speichern.
- Setzen Sie den montierten Schlitten auf der Bühne eines Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop mit 10X und 60X Ziele sowie DIC Linsen ausgestattet ist, Prisma, Kamera und Capture-Software ermöglicht Zeitraffer-Mikroskopie und die Erzeugung von Z-Stapel (automatisierte Z-Plattform).
- Die Messung der Frühe Elongation Defekte Bildanalyse
- Offene Fidschi-ImageJ Software ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- Analyse / Set Messungen im Menü wählen, wählen Sie Perimeter. Für jeden Embryo, stellen Sie die Z-scale bar auf den Pharynx des Embryos zu konzentrieren , wie in 2A gezeigt. Dadurch wird sichergestellt, dass Sie auf die Mitte des Embryos zu konzentrieren. Um die Länge des Embryos zu messen, stellen Sie die Bar Zeitskala den Embryo von Interesse zu Beginn der frühen Dehnung zu haben (comma Stufe; 2A). Beachten Sie die Zeit ( "Time-Anfang").
- Wählen Sie das segmentierte Zeilenwerkzeug. Zeichnen Sie eine segmentierte Linie von der Spitze der Mündung des Embryos bis zur Schwanzspitze nach der Mittellinie des Embryos (2A). Mit Hilfe der Menüreiter die Länge der gezogenen Linie ( "Länge Anfang") analysieren / Messen, erhalten.
- Wiederholen Sie diese Messung für den gleichen Embryo am Ende der frühen Dehnung (Moment, wenn Muskeln Contracting beginnen). Beachten Sie die Zeit ( "Time-end") und messen die Länge des Embryos ( "Length-end") wie oben (2B) beschrieben.
- Berechnen der Dauer (D) der frühen Dehnung und der Längenzunahme (L) in dieser Phase, wie folgt:
D = "Time-end" - "Time-Anfang"
& #160; L = "Length-end" - "Length-Anfang" - Um die Kopfbreite messen, einstellen bar die Zeitskala in der Phase von Interesse um einen Embryo zu haben (1,2-fache der Bühne oder am Ende der frühen Dehnung). Wählen Sie den geradlinigen Werkzeug. Zeichnen Sie die transversale (dorsoventrale Achse) Mittellinie des Kopfes. Dieser Abschnitt ist der dickste Teil des Embryos (Abbildung 2C). Mit der Menü Analysieren / Messen, erhalten die Länge der Linie der Breite Kopf entspricht.
- Zur gleichen Zeitpunkt, wiederholen Sie diesen Schritt für die transversale Mittellinie des Schwanzes Zeichnung (Mid-Linie zwischen dem Darm-Ventil und der Spitze des Schwanzes; 2C) und messen sie den Schwanz Breite zu erhalten.
HINWEIS: Um diese Messung verwenden Embryonen in verschiedenen Phänotypen auf der gleichen Stufe zu vergleichen. rund um die Mittellinie des Schwanzes des Tieres angeordnet, um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu gewährleisten, stellen Sie sicher, einen Ort zu finden, die leicht von einem Tier auf ein erkannt werden könnennother. - Um den Kopf bis zum Schwanz Breite-Verhältnis berechnen, teilen Sie die Kopfbreite durch den Schweif Breite.
2. Charakterisierung der Spätdehnung Defekte Bildanalyse
- Die Synchronisation von L1 - Larven mit Alkaline Hypochlorit - Behandlung
- viele trächtige Erwachsene enthält, sammeln Sie alle Würmer in einem Mikrozentrifugenröhrchen aus einem nicht verhungert 60 mm Platte durch die Nematoden von der Platte Waschen mit 1 ml M9-Puffer mit einer Pasteurpipette.
- Sediments Nematoden bei 3.500 × g für 3 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette ohne den Wurm Pellet zu stören.
- 1 ml der Hypochloritlösung zu jedem Röhrchen (0,4 M Hypochlorit, 0,5 M NaOH) und Schütteln für 3 min.
HINWEIS: Alkaline Hypochlorit-Lösung frisch zubereitet werden soll und Embryonen in dieser Lösung sollte vorsichtig bewegt werden, sondern kontinuierlich Auflösung der Erwachsenen und die Sauerstoffversorgung des embr zu optimierenYos. Nach 3 min Rühren die meisten Erwachsenen sollten ihre Eier in die Lösung freizusetzen. - Schleudern bei 3.500 × g für 3 min bei Raumtemperatur und schnell zu entfernen, um den Überstand mit einer Mikropipette, ohne das Pellet zu stören.
- Viermaliges Waschen mit 1 ml M9-Puffer, gefolgt von Zentrifugation bei 3.500 × g für 3 min.
- Nach dem vierten Wasch Entfernen des Überstandes und Resuspendieren Eier in 700 ul M9-Puffer ohne die Eier Pipettieren up (wie die Eier auf dem Kunststoff der Spitze haften bleiben würde).
- Band das Rohr auf einem 3-mm-Orbitalschüttler in einem Inkubator bei der entsprechenden Wachstumstemperatur gebracht und schütteln über Nacht bei 600 Umdrehungen pro Minute.
- Längenmessung von Synchronized Larvae
- Zentrifuge verhaftet L1-Larven bei 3.500 × g für 3 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren die Larven in 100 ul M9-Puffer und übertragen sie auf einem Agarose-Pad mit einer Pasteurpipette (Agarose-Pads sollte vorbereitend wie in Abschnitt 1.1.2 bis 1.1.8 beschrieben). Legen Sie ein Deckglas auf dem Pad.
HINWEIS: Das Pad nicht mit Gummi für dieses Experiment abgedichtet werden muss, die kurze Erwerb beinhaltet. - Verwenden Sie ein 10X-Objektiv und Phasenkontrast-Beleuchtung, die Länge der Larven zu messen, wenn eine hochauflösende Kamera verwendet wird. Erhöhen Sie die Intensität des Lichts , der Lage sein , ein klares Bild von den Larven (2D) zum Erfassen von Bildern innerhalb von wenigen Millisekunden und somit erhalten.
HINWEIS: Während die Schwimm trashes der Larven durch die Agarose-Pad reduziert werden, werden sie noch in Bewegung. Daher ist die schnelle Aufzeichnung wichtig, ein klares Bild zu erhalten. - Öffnen Sie Fidschi-ImageJ und wiederholen Sie Schritt 1.3.1. Um die Länge der Larven zu messen, wählen Sie die segmentierte Zeilenwerkzeug. Zeichnen Sie eine segmentierte Linie von der Spitze des Kopfes bis zur Spitze des Schwanzes nach der Mittellinie der Larven (2D, rechts).
- Über das Menü Analyse / Messen, erhalten die Länge dergezogene Linie zu der Länge der Larven in Mikrometer entspricht.
- Zentrifuge verhaftet L1-Larven bei 3.500 × g für 3 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren die Larven in 100 ul M9-Puffer und übertragen sie auf einem Agarose-Pad mit einer Pasteurpipette (Agarose-Pads sollte vorbereitend wie in Abschnitt 1.1.2 bis 1.1.8 beschrieben). Legen Sie ein Deckglas auf dem Pad.
3. Charakterisierung der Spätdehnung Defekte Mit Durchflusszytometrie
- Synchronisieren Sie Larvae
- Reinige Embryonen die alkalische Hypochlorit-Behandlung, wie in Abschnitt 2.1 von vollen 100-mm-Platten von gut genährten jungen Erwachsenen beschrieben und lassen den Embryo Luke und die L1 Arrest in M9-Puffer für 16 bis 24 Stunden lang bei 20 oder 25,5 ° C in Abhängigkeit von der Belastung analysiert.
HINWEIS: Eine volle Teller von gut genährten Erwachsene pro Stamm ist ausreichend für die Analyse weiter unten beschrieben.
- Reinige Embryonen die alkalische Hypochlorit-Behandlung, wie in Abschnitt 2.1 von vollen 100-mm-Platten von gut genährten jungen Erwachsenen beschrieben und lassen den Embryo Luke und die L1 Arrest in M9-Puffer für 16 bis 24 Stunden lang bei 20 oder 25,5 ° C in Abhängigkeit von der Belastung analysiert.
- Die Kalibrierung des Worm Sorter
HINWEIS: Das Durchflusszytometer hier verwendet wird, eine große Partikel Durchflusszytometer (im Folgenden als der Schnecken Sortierer bezeichnet). Der Wurm Sortierer enthält eine 670 nm roten Diodenlaser, die vor einer Extinktion Detektor befindet. Der Wurm Sortierer enthält auch eine mehrzeilige Argon-Laser für Fluoreszenzanregung. Die standard Instrumente haben drei Photovervielfacherröhren (PMT) Fluoreszenzdetektoren verwendet, um Fluoreszenzemissionen in den grünen, gelben und roten Bereiche des Spektrums erfassen. In dem Protokoll hier beschrieben wird TOF verwendet werden, um die Größe der Larven zu messen, wird der rote Kanal verwendet werden tote Würmer zu identifizieren, die mit Propidiumiodid (PI) wird gefärbt. GP (General Purpose) hohe Fluoreszenzkontrolle Partikel verwendet, um das Instrument und als interne Kontrolle in unserem Experiment zeigen eine hohe Fluoreszenz in grün, gelb und rot zu kalibrieren. Sie werden nur die Objekte in der Probe mit hoher Emission im grünen Kanal detektiert analysiert und wird anschließend auf der Basis dieser Kennlinie ermittelt werden.
HINWEIS: Lebende Tiere werden auf der Grundlage der Abwesenheit von Fluoreszenz in den grünen und roten Kanal sowie auf der TOF identifiziert. Autofluoreszie- Emission aus dem Darm der Larven ist bei L1 Stadium nicht nachweisbar.- Schalten Sie den Laserblock, der Computer, der Kompressor eind der Wurm Sortierer Instrument. Drücken Sie die START-Taste auf der Wurm Sorter Software geöffnet, wie in der Bedienungsanleitung des Gerätes angezeigt.
- Beachten Sie die Argon-Laser Steuerung Pop-up-Fenster. Wählen Sie RUN-Modus und warten, wie die Laserleistung 10 ± 1 mW erreichen. Wählen Sie FERTIG auf dem Laser-Kontrollfenster.
- Stellen Sie den Mantel und die Probendrücken auf 5,10 ± 0,02 und 5,51 ± 0,01 beziehungsweise. Lassen Sie den Druck für mindestens 15 min äquilibrieren und klicken Sie auf OK DRUCKKontrollKästchen.
HINWEIS: Die Durchflussrate auf der Hülle und den Probendruck abhängt. - Sicherstellen, dass alle Blasen, die in den Strömungskanal Tubuli zwischen der Probenschale und der Analysekammer zu beseitigen. Dazu ACQUIRE klicken und sanft die Tubuli Flick, bis keine Luftblase erworben werden (wie im Aufnahmefenster zu sehen ist).
- Einstellung aller Parameter für Leuchtstoff- und TOF Messung und Erfassung wie folgt:
- Stellen Sie die Waage für TOF, Ext, Grün, Gelb und Rot256. Set Gewinn wie in Tabelle 1 beschrieben. Set PMT Steuerung bei 700 für Grün und Gelb und 900 für Rot.
HINWEIS: Zwei Anregungsfilter zur Verfügung (488 nm und 514 nm) und kann verwendet werden, um entweder das grün fluoreszierende Protein (GFP) oder gelb fluoreszierendes Protein (YFP) oder jegliche Fluorochrome bei diesen Wellenlängen mit dem mehrzeiligen Argonlaser angeregt zu erregen. Entsprechende Filter müssen in der Filterkammer des Gerätes eingesetzt werden. Wir verwendeten die 488 nm-Filter für das folgende Experiment.
- Stellen Sie die Waage für TOF, Ext, Grün, Gelb und Rot256. Set Gewinn wie in Tabelle 1 beschrieben. Set PMT Steuerung bei 700 für Grün und Gelb und 900 für Rot.
- Um den Wurm Sortierer kalibrieren, wählen Sie "Run Control Partikel" in Werkzeugmenü. Setzen Sie 20 ml 1x GP (General Purpose) hohe Fluoreszenzkontrolle Partikel in der Tasse (diese Partikel sind fluoreszierende Partikel präzise Größe, von der Zytometrie Hersteller verkauft ihr Instrument zu kalibrieren).
- Klicken Sie auf ACQUIRE-Taste Hülle und Probenfluss zu beginnen.
HINWEIS: eine mittlere Erwarten Sie, um die Verteilungsregelung Teilchens von 21 ± 6 und acoefficient Variations um diesen Mittelwert (CV) ≤11. Wenn der CV ist> 11 und der Mittelwert> 27 versuchen, die Röhrchen zu reinigen, indem mehrmals auf der sauberen Schaltfläche klicken oder den Strömungskanal schnippen.
- Erwerb von Tier TOF
HINWEIS: Licht streut, wenn ein Objekt geht in der Flusszelle zwischen der Laserquelle und dem Aussterben Detektor. Die Zeit, die das Licht braucht vom Flugobjekt (time of flight, TOF) wird verwendet, um zu messen, die axiale Länge des Objekts gestreut. Das Ausmaß des Lichts durch das Objekt maskiert (Extinktion, EXT) als Maß für die Opazität / optische Dichte verwendet.- Platz 10 ul synchronisiert Wildtyp (wt) L1 in einem Uhrglas und schätzen den Prozentsatz der toten Eier ein Binokular mit.
HINWEIS: Synchronisierte L1 Anzeige hoher Emb (höher als 20%) in wt sollte nicht für die weitere Analyse verwendet werden. - Transfer synchronisiert L1 vom Mikro (approximately 700 & mgr; l M9 enthält L1) zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen , Propidiumiodid (PI) in einer Endkonzentration von 10 ug / ml (Verdünnung 1/100 von einer 1 mg / ml Stammlösung) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Tote Eier und Larven werden als stark fluoreszierende Objekte unter Verwendung von PI und erfasst werden gefärbt, um die roten Kanal. - 10 ml M9-Puffer gefärbten Populationen zu verdünnen. Nehmen Sie 5 ml der verdünnten Populationen und verdünnen sie viermal um 15 ml M9-Zugabe. Dieses Verdünnung in den Probenbecher.
- Führen Sie den Probenfluss durch Klicken akquirieren und beobachten die Fließgeschwindigkeit.
HINWEIS: Um eine genaue Messung zu haben, die Durchflussrate sollte zwischen 15 und 25 Objekte / s bleiben. - Falls erforderlich, passen Sie die Menge der Tiere in der Tasse die gewünschte Strömungsrate zu erreichen.
HINWEIS: Die Strömungsrate hängt von dem Druck (Mantel und Probe), die konstant sind, wie in 3.2.3 und von der Konzentration der Larven i angedeutetn die Tasse. Wenn die Durchflussrate von mehr als 25 Objekte / s etwas Puffer in der Tasse hinzufügen. Wenn es weniger als 15 Objekte / sec konzentrierte L1 (aus Schritt 3.3.3) in der Tasse. - Sobald die geeignete Konzentration des Objekts erreicht ist, das Volumen in der Tasse zu bewerten und 1/4 th dieses Volumens in High Fluorescent GP Kontroll Partikel 4x Lösung hinzufügen.
- Stellen Sie die Gating und Sortierparameter. Dazu klicken Sie auf "Gating" auf dem Menü und wählen Sie "TOF vs. ' und "Grün". Klicken Sie auf "Sortieren" auf dem Menü und wählen Sie "TOF vs. 'und' Red '. Gating und Sortier Grafiken wird dann erscheinen , wie in 3A gezeigt.
Hinweis: Dies wird die Visualisierung der Kontrollpartikel (Emission in Grün und Rot), tote Tiere befleckt von PI und Blasen (Emission in Rot und nicht Grün) und lebende Tiere (keine Emission in weder Grün noch Rot - Kanäle) erlauben (3A ). - Führen Sie das Experiment von ACQ klickenUire.
HINWEIS: Um kleine Unterschiede zwischen den Larven, analysieren rund 10.000 Objekte zu identifizieren, so etwa 8000 Tiere. Stoppen Sie das Experiment und exportieren Sie die Daten als TXT-Format, indem Sie auf STORE klicken.
- Platz 10 ul synchronisiert Wildtyp (wt) L1 in einem Uhrglas und schätzen den Prozentsatz der toten Eier ein Binokular mit.
- Messung der relativen Größe des lebenden Tiere in Synchronized Populations
- Öffnen Sie die TXT-Datei mit einer Software in der Lage, um große Datentabellen zu verwalten.
- Von den untersuchten Objekten, die die TOF-Werte im Zusammenhang mit Steuer Teilchen extrahieren, die höher durch Emission im grünen Kanal gekennzeichnet sind als 100 willkürlichen Einheiten (hängt dieser Wert auf den in Abschnitt Parameter 3.2.5). Erstellen Sie eine neue Spalte und nennen es "Steuer Partikel". Erstellen Sie eine Spalte enthält alle anderen Objekte mit Ausnahme der Steuer Partikel genannt "Probe". HINWEIS: die Fluoreszenzemission von neuen Teilchen Charge muss überprüft werden, bevor die Akquisitionen zu starten. Dadurch wird die Fluoreszenzschwelle gesetzt, die Identifizierung zu ermöglichenSteuer Partikel über L1s.
- Für jeden analysierten Stamms des Teils des Experiments festzustellen, wo die Strömungsrate (aufgrund des Vorhandenseins eines Stopfens von Eiern beispielsweise) verändert wurde. Dazu:
- Zeichnen Sie die TOF von 'Steuer Partikel "für jede Probe als Faktor Zeit (3B).
- Zeichnen Sie die lineare Trendlinie die Trendlinie Werkzeug und die Gleichung zeigen auf der Karte.
HINWEIS: Die TOF von Steuer Partikel sollten im Laufe der Zeit (horizontale Linie, 3B) konstant sein. Betrachtet man die Gleichung des linearen Trendlinie auf der Daten y = ax + b gezogen, sicherzustellen , dass die "a" Wert ist niedriger als 10 -4. Alle Messungen innerhalb von Zeitabschnitten einen Bruch in der Ausrichtung der Steuerpartikel Anzeige sollte aus der Analyse entfernt werden.
- Entfernen Sie die toten Embryonen und Blasen (Emission von mehr als 15 in den roten Zahlen) sowie kleine Trümmer und große Ei-Stecker (TOF von weniger als 10 und eine hoheer als 70 bezeichnet) von der "Probe" Messung.
- Zeichnen Sie die 'Steuer Partikel' Verteilung für jeden analysierten Stamm. Wie in 3C gesehen sollten diese Verteilungen nahezu perfekt überlagern. Dies stellt sicher, dass für verschiedene Stämme erhalten TOF-Messungen verglichen werden können. HINWEIS: Normalisierung der Probenelemente TOF über Kontrollpartikeln verwendet werden können, wenn die Verteilungen der Steuer Teilchen in einer Probe mit dem Overlay nicht von Kontrollproben. Normierte TOF werden wie folgt berechnet:
- Normalisieren TOF für Genotyp G = (Probe TOF für G) / (durchschnittliche Kontrolle Teilchen "TOF für G) x (durchschnittliche Kontrolle Teilchen" TOF für wt) , wobei Gew die Kontrollprobe ist.
- Plot Larvae TOF Verteilung für jeden Stamm einschließlich Kontrollprobe, in unserem Fall wt Tieren (3D). Messen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) für jede Population (
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Representative Results
Head-, Schwanz- und Kopf / Schwanz-Breite - Verhältnis sind Robust Metrics.
Die Protokolle hier beschrieben wurden während der frühen Verlängerung 7. Pix-1 und pak-1 - Code jeweils für eine Guanin-Austauschfaktor Funktion der Regulatoren und Effektoren der Rho - GTPasen pix-1, pak-1 und let-502 erfolgreich zur Charakterisierung (GEF) und ein Effektor spezifisch für Rac / Cdc42 GTPasen und let-502 - Codes für einen Effektor für RHO-1 7. In dieser Studie pix-1 und pak-1 wurden epidermale Morphogenese während 7 frühen Dehnung gezeigt zu steuern. In dieser Studie wurden Kopf und Schwanz Breitenmessung als Metriken zeigen zum ersten Mal, dass hypodermal Zellen in der vorderen emb gelegenRyo folgen verschiedene morphogenic Programme als die sich in ihrem hinteren 7. Um festzustellen , wurde die Reproduzierbarkeit und Robustheit dieser Metriken, Kopfbreite gemessen unabhängig fünf Mal am 12. Wildtyp (wt) Embryonen mit 1,2-fache der Bühne. Abweichungen zu den fünf verschiedenen Gruppen von Mess verglichen wurden dann bewertet die Brown-Forsythe - Test (mit R Statistik - Paket) bei den Messungen keine signifikanten Unterschiede offenbaren (F- Test p - Wert> 0,5; 4A) darauf hindeutet , dass die Messungen für eine Gruppe von Embryonen sind reproduzierbar. Beurteilung der Auswirkungen Reproduzierbarkeit und Chargen zu diesen Messungen wurde an drei verschiedenen Tagen durchgeführt bei 1,2-fach Stufe von 4D-DIC - Bildgebung durch Messung der Kopfbreite von wt Embryonen durchgeführt (n = 12 Embryonen). In diesen drei Messgruppen war die Varianz nicht signifikant verschieden und keine signifikanten Effekte wurden batch den Kopf-w auszuwirken gefundenreite Messergebnisse (F-Test p -Wert> 0,5; 4B).
Ähnliche Ergebnisse wurden für tail Breitenmessungen erhalten und in verschiedenen Stadien der frühen Dehnung erfolgen Messungen (Daten nicht gezeigt). Diese Daten etabliert Kopf-Breite, Schwanz-Breite und Kopf / Schwanz-Breite-Verhältnis als robust Metriken frühen Dehnung Defekte zu charakterisieren.
Messkopf und Schwanz Breite sowie Länge des Embryos Ermöglicht die Charakterisierung von Genen steuern Frühe Elongation entlang der anteroposterioren Achse des Embryos.
Die Messung der Länge der Embryonen sowie die Breite des Kopfes und der Schwanz wurde auf wt und mutanten Embryonen getan tragen null oder thermisch empfindlichen starken Verlust der Funktion Allele für Gene steuern frühen Dehnung: pix-1 (gk416);pak-1 (ok448) und let-502 (sb118ts) 7. Wir maßen die Kopf / Schwanz (H / T) Breite - Verhältnis von wt und mutanten Embryonen am Anfang (1,2-fach - Stufe) und am Ende der frühen Dehnung nicht-permissiven Temperaturen (4C linke und rechte Platte beziehungsweise). Während zu Beginn der frühen Dehnung kein Änderungs- oder eine reduzierte H / T - Verhältnis betrug in pix-1, pak-1 und let-502 - Mutanten beobachtet , wenn zur Gew Tiere verglichen (1,2-fach Stufe 2C, linkes Panel am Ende des frühen Dehnung) sind alle drei Mutanten zeigten eine signifikant höhere H / T - Verhältnis als wt Embryonen (t -test p -Werten <0,006; 4C; rechtes Feld). Dies zeigte , dass pix-1, pak-1 und let-502 Mutantenembryos am Ende des frühen Dehnung abnormal antero-posterior Morphologie anzuzeigen. Eine weitere Analyse zu vergleichen Kopfbreite und Heckbreite between 1,2-fache der Bühne und das Ende der frühen Dehnung zeigten die gleichen Messparameter mit , dass die Kopfbreite weniger in pix-1 reduziert wird, pak-1 und let-502 - Mutanten , während der Schwanz Breite in let-502 - Mutanten deutlich weniger reduziert nur 7. Dies zeigte , dass let-502 Kontrollen morphogenic Prozesse ähnlich entlang der anteroposterioren Achse des Embryos, während pix-1 und pak-1 - Steuer morphogenic Prozesse hauptsächlich am vorderen Teil des Embryos 7 auftritt. Der Längenunterschied zwischen den Embryonen am Ende gegenüber dem Beginn der frühen Dehnung (4D) wurde ebenfalls gemessen. Wir fanden , dass eine frühzeitige Verlängerung deutlich in pix-1 reduziert wurde, pak-1 und let-502 - Mutanten im Vergleich zu wt , dass eine Veränderung des vorderen Morphogenese in pix-1 und pak-1 was darauf hindeutet , Mutanten allein ausreichend ist , um signifikant die Elongatio reduzierenn des Embryos.
Protokoll 2 und 3 wurden verwendet , um die Länge der verhafteten Larven in wt und mutanten Hintergründe zu beurteilen. Die Länge dieser Larven wurde unter Verwendung von sowohl der Bildanalyse (Protokoll 2) 7 und Durchflusszytometrie beurteilt (Protokoll 3; unpublizierte Daten). Die Messungen der Larven Länge unter Verwendung von Bildanalyseergebnisse in absoluten Messungen der Tiere 'Länge in Mikrometern in einer robusten und hoch reproduzierbar (5A). Diese Analyse zeigte , dass synchronisierte mutant Larven Anzeige deutlich Länge reduziert , wenn auf wt (5A) , verglichen 7. Messung dieser Larven der Durchflusszytometrie basiertes Protokoll (Protokoll 3) ergab vergleichbare Ergebnisse (5B) verwendet wird . Es sollte jedoch , dass die große Anzahl der Larven mit dem letzteren Ansatz gemessen werden merkt signifikant die statistische Robustheit des Genotyps Vergleich (t erhöht - Test p -Werten <10 -24). Basierend auf diesen Ergebnissen kann die Durchflusszytometrie Ansatz eine bessere Wahl über Bildanalyse, um sein mutierten Tiere zu charakterisieren sehr subtile Dehnungsfehler anzeigt.
Abbildung 1 : Herstellung eines Agarose Pad. A, Objektträger , die zwischen zwei Distanzrutschen durch zwei Lagen Klebeband abgedeckt. B wird die Agarose - Pad mit einer anderen Folie durch die beiden Spacer-Dias. C, um die endgültige Form und Größe des Agarose - Pad unterstützt bedeckt nach dem Schneiden mit eine Rasierklinge das Deckglas zu passen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
g2.jpg "/>
. Abbildung 2. Messung der frühen und späten Elongation Defekte A - B, Messung der Länge eines Embryos bei comma Stufe (A) und am Ende der frühen Verlängerung (B). Die rote Linie verwendet , um die Embryonen zu messen wurde mit der segmentierten Zeilentool von ImageJ gezogen. C, Kopf und Schwanz Breite werden in Embryonen mit 1,2-fach - Stufe (links) und am Ende der frühen Dehnung (rechts) gemessen. Pfeile stellen die Lokalisierung der Messbereiche (modifiziert von Martin et al., 2014). Maßstabsbalken:. 20 um D, Länge des Larvae wird für synchronisierte L1-Larven gemessen. Rechte Tafel ist eine vergrößerte Ansicht des aufgenommenen Bildes (links). Die rote Linie wurde mit der segmentierten Zeilenwerkzeug von ImageJ gezogen. Es wird verwendet, um die Länge der Larven zu messen. Maßstabsbalken:. 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Messung der Länge des Synchronized Larvae Mit Durchflusszytometrie. A, Gating und Sortierfenster von COPAS Biosort zeigt Grün und Rot Emission von Steuer Partikel, Blasen, tote und lebende Tiere im Hinblick auf ihre Time-Of-Flight (TOF ). B, TOF Kontroll Partikel zu verschiedenen Zeitpunkten für ein repräsentatives Experiment. Die Steigung der linearen Funktion von TOF gegen die Zeit ist etwa 10 -5, was anzeigt , daß TOF von Steuer Partikel im Laufe der Zeit während des Experiments konstant. C, Verteilung der Partikelkontroll TOFs als Prozentsatz der Maximalwert von Verteilungen ausgedrückt. Nicht normalisierte und normalisierte Steuerpartikelverteilungen dargestellt werden für pak-1 (ok448). Andere Distributionen sind nicht normalisiert. D, die Verteilung von TOFs für das LebenTiere, ausgedrückt als Prozentsatz des Maximalwertes der Verteilungen. TOFs nicht normalisiert sind auf Steuer Teilchen mit Ausnahme von pak-1 (ok448) wie angegeben. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Pix-1, Pak-1 und Let-502 Mutants geschichtlich frühe Elongation Mängel. A - B, Reproduzierbarkeit und Robustheit Beurteilung der Kopfbreite Messungen A, fünf unabhängige Messungen der Kopfbreite für wt Embryonen bei 1,2-facher Stufe (n = 12 Embryonen).. Mittelwerte und Standardabweichungen (Fehlerbalken) angezeigt. Nicht signifikant (ns) Unterschiede zwischen den Messungen berechnet wurden die Brown-Forsythe-Test (using R - Statistikpaket) (F-Test p-Wert> 0,5). B, Leiter Breitenmessung für wt Embryonen an drei verschiedenen Tagen (n = 12 Embryonen). Mittelwerte und Standardabweichungen werden ebenfalls angezeigt; es war für die Messungen keinen signifikanten Unterschied in Varianz (ns; Brown-Forsythe F-Test p - Wert> 0,5) C, Verteilungen von Kopf / Schwanz - Breite - Verhältnis bei 1,2-facher Stufe (links), am Ende des früh. Dehnung (rechtes Bild) in wt, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) und let-502 (sb118ts) Mutanten bei 23 - 24 ° C. Beachten Sie, dass Mütter von let-502ts Embryonen für diese Studie verwendet wurden bei 25,5 ° C gewachsen. D, Verteilung der Dehnung in wt, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) und let-502 (sb118ts) Mutanten zwischen Komma Bühne und dem Beginn der späten Dehnung. Die Box-Plots stellen die min, max, 25 th, 50. (Median) und 75Perzentile der Bevölkerung. * T -Test p - Wert <0,05, ** t - Test p - Wert <0,006 (von Martin et al modifiziert., 2014). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) und L et-502 (sb118ts) Larvae heutige Länge Mängel. A, Länge der Larven in wt gemessen, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) und let-502 (sb118ts) Tiere anhand der Bildanalyse (Protokoll 2) gemessen. B, Relative Larven Länge gemessen Durchflusszytometer unter Verwendung von ( Protokoll 3). Die Zahlen in Klammern entsprechen der Anzahl der Tiere, für th verwendete Messungen. Die Mittel der Längen und Standardfehler des Mittelwertes (SEM; Fehlerbalken) sind vertreten. Student-t - Test p - Werte angegeben (p). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt neue Metriken frühen und späten Phasen der embryonalen Dehnung zu charakterisieren.
Im Bereich 1 ist der kritische Schritt die mögliche Anwesenheit von Bakterien auf dem Pad. Die Embryonen werden hermetisch zwischen dem Kissen und dem Deckglas während der Bilderfassung eingeschlossen ist. die Folie Abdichtung ist erforderlich während der Erfassung Desikkation der Tiere zu vermeiden, dass mehr als zwei Stunden dauert. Unseres Wissens nach keiner der Versiegelungen verwendet, um Agarose-Pads zwischen Schlitten und Deckglas montieren sind luftdurchlässig. Folglich wird, wenn eine große Menge von Bakterien (oder Embryonen), die auf der Unterlage ist, kann sie von Sauerstoff nach wenigen Stunden zu ihrem vorzeitigen Tod führt beraubt werden. Mit dreifache Embryonen - entsprechend Embryonen, die 3-fach in der Länge sind im Vergleich zu nicht verlängerten Embryonen - aufgezeichnet zusammen mit den Embryonen von Interesse wird ein guter Indikator für die potentielle hypoxischen Bedingungen sein, da diese Embryonen in thei zu stoppen bewegenr Eischalen in Abwesenheit von Sauerstoff. Keine morphologische Messungen sollten auf hypoxischen Bedingungen oder auf toten Embryonen durchgeführt werden.
Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Zeitraffer-Bildgebung ist Temperatur, bei der Entwicklung des Embryos stattfindet. Wärmeempfindliche Mutanten sind derzeit in C eingesetzt elegans. Die biologische Wirkung der Temperaturverschiebung kann sofort oder verzögert auf der Halbwertszeit des Proteins abhängig und die Art der Mutation ihre trägt. Folglich, bei dem die Temperatur der Embryo ausgesetzt ist, sollte über die Zeit konstant sein und sollte durch geeignete Belüftung der Mikroskopie Raum oder einer Heiz-Kühlkammer auf dem Mikroskoptisch gesteuert werden.
Abschnitt 2 ist abhängig von Larven Synchronisation mit alkalischen Hypochlorit-Behandlung. Unter bestimmten Umständen kann diese Behandlung mit embryonalen Letalität (EMB) führen. Emb über 20% in Gewichts Bevölkerung deutet auf eine erhöhte Toxizität bei Hypochlorit treatment, die sich negativ auswirken können Morphogenese. Synchronisierte L1 hohe Emb in wt Hintergrund Anzeige sollte nicht für die weitere Analyse verwendet werden. Diese Einschränkung gilt auch für Protokoll 3.
Wir empfehlen nicht den Einsatz von Anästhetika Larven zu immobilisieren. Levamisol insbesondere lähmt die Nematoden durch Induktion von Muskel Tetanie, die die Larven der Einführung experimentelle Tendenz zu schrumpfen neigt. Wenn die Belichtungszeit nicht schnell genug, um als Folge der Beschränkungen des Mikroskops ist, empfehlen wir die Verringerung der Motilität der Larven durch die Konzentration der Agarose in dem Kissen zu erhöhen und die Menge an Flüssigkeit, die zwischen dem Kissen und dem Deckglas zu reduzieren. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, nicht die Larven auszutrocknen, da Austrocknungs ihre Größe zu reduzieren.
In Abschnitt 3, Messung der Länge der Larven verwendet Vergleich der Durchflussraten zwischen analysierten Proben. Dazu muss die Verteilung der Steuer Partikel Compa zu seinrot. Wenn die Verteilungen overlay vollständig die TOF (time-of-flight) Werte für entsprechende Proben erhalten werden, können verglichen werden, wenn nicht, diese Werte normalisiert werden müssen. Normalisierung der sample-TOF über Steuer Partikel-TOF (wie in 3.4.5.1 beschrieben) wurde erfolgreich verwendet , wie für pak-1 (ok448) (3C und 5B) gezeigt. Relative Länge pak-1 (ok448) vs wt gefunden wurde in mindestens 3 unabhängigen Experimenten ähnlich zu sein , mit oder ohne Normalisierung (Daten nicht gezeigt). Wir empfehlen jedoch, die Ergebnisse bestätigt, mit einer Normalisierung erhalten diejenigen mit, ohne sie zu erhalten, vor allem, wenn Larven mit geringen Größe Unterschiede zu vergleichen. Es sollte beachtet werden , dass die Messung der Larven Länge unter Verwendung von Durchflusszytometrie eine Länge relativ zu einer Kontrollprobe liefert, in diesem Fall wt Larven anstatt eine absolute Länge in Mikrometern , wie für die Bildanalyse. Dies bedeutet, dass die Messungen von unabhängigen Experimenten kann nichtes sei denn , die Berechnung Größenverhältnis über Gewichts kombiniert werden.
Der Puffer für die Verdünnung in den Probenbecher verwendet wird, einen Einfluss auf die Durchflussrate. Wir beobachteten, dass die Hülle Puffer vom Hersteller enthält Waschmittel empfohlen, die die Menge von Blasen während der Erfassung erzeugt erhöht. Verwendung M9 Puffer, der kein Waschmittel enthält, signifikant reduziert die Bildung von Blasen war aber weniger effizient in das Verstopfen der Eier in den Tubuli des Sortierers zu vermeiden, die die Strömungsrate der Proben beeinflusst. Ei Verstopfens während der Übernahme durch eine deutliche Abnahme des beobachtbaren TOF von Regulierungsteilchen für einige Sekunden, gefolgt von einer erhöhten TOF auch für einige Sekunden leicht erkannt. Ei-Plugging kann auch auf die Behinderung des Kanals führen und die gesamte Verhaftung des Partikelstroms (weniger als 5 Objekte pro Sekunde). Sollte dies passieren, klicken Sie auf die CLEAN-Taste, bis Fließgeschwindigkeit wieder hergestellt wird. Alle Messungen während dieser Veranstaltung auftretens sollte aus der Datenanalyse ausgeschlossen werden. Mantel Puffer kann für Experimente empfohlen werden, denen durch hohe Raten von toten Eier gekennzeichnet Stämme.
Die Probe und Mantel Druck (bei dem Schritt 3.2.3 gesetzt), kann (leicht) ändern im Laufe der Zeit und sollte während des gesamten Experiments, um eine sehr konstante Durchflussrate, um sicherzustellen, manuell eingestellt werden. Reduzierung oder Erhöhung der niedrigen Rate wird zu beobachten sein , wenn die Ergebnisse der Analyse und die TOFs der Kontrolle Partikel über die Zeit (3C) aufgetragen ist . Verringerung der Strömungsgeschwindigkeit in der Zunahme der durchschnittlichen TOFs von Teilchen im Laufe der Zeit führt, während eine Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit in der entgegengesetzten Folge. Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit wird die Empfindlichkeit des Verfahrens zum Nachweis kleiner Größenunterschiede zwischen den Populationen der Larven negativ beeinflussen.
Methoden Ziel Gene zu identifizieren, die Dehnung zu steuern und Zeitraffer-Mikroskopie Aufnahme erfordern, sind im Allgemeinen hochly zeitraubend und mühsam, wenn mehrere Genotypen Phänotypisierung. Die strömungs Zytometer-basierten Ansatz, während erfordern Ausrüstung nicht verfügbar für alle Laboratorien, ist weniger zeitaufwendig und damit effizienter, wenn mehrere Stämme charakterisiert werden müssen. Dieses Verfahren ist auch statistisch robust im Vergleich zu Messungen Bildanalyse (beurteilt durch die t- Test nach Student verglichen Mutante und wt TOF Verteilungen; 5A und B). Dieses Verfahren kann dann sehr geeignet sein für die Stämme Dehnung Defekte mit niedrigen Expressivität / Penetranz Ausdruck zu bringen.
Mehrere Verfahren Durchflusszytometrie in der Vergangenheit entwickelt wurden , unter Verwendung von 9-12 Eignung von Nematoden zu messen. Diese Methoden verwenden Tiere verzichtet in einer 96-Well-Platten und der Reflex-Modul des Schnecken sorter ". Die Reflex-Modul ermöglicht die direkte Analyse der Nematodenpopulation innerhalb von 96-Well-Platten verteilt. Folglich sind diese Verfahren können characteRize Hunderte von Bedingungen pro Tag und bilden, in dem eine robuste Art und Weise die Eignung eines nicht synchronisierten Population zu messen. Sie sind jedoch nicht gut geeignet, geringe Größe Unterschiede zwischen synchronisierten L1 zu identifizieren. Messung von kleinen Unterschieden zwischen L1-Larven erfordert die Messung über eine große Anzahl von Tieren, die mit der Verwendung von Platten mit 96 Vertiefungen und des Reflex-Modul inkompatibel ist, die effizient 100 Objekte am meisten pro Vertiefung charakterisieren kann. Das hier beschriebene Verfahren ist für diesen Zweck auf Kosten des Durchsatzes ausgelegt, die erheblich reduziert wird. Es ermöglicht die Charakterisierung von 3 bis 4 Bedingungen pro Stunde, wenn das Instrument kalibriert ist, welches gegenüber der Verwendung der Bildanalyse in Protokoll 2 eine deutliche Verbesserung darstellt.
Messung der Kopf- und Schwanzbreitenverhältnis ist das erste Verfahren , das entwickelt wurde , ungleichmßig 7 entlang der antero-posterioren Achse des Embryos vorkommen morphogenic Prozesse zu charakterisieren. Wannangewendet Gene gezeigt frühen Dehnung zu steuern, werden diese Methoden, um die räumliche Verteilung von Signalwegen klären zu diesem Zeitpunkt die Steuerung Morphogenese. Messung der Länge der verhafteten Larven entweder Bildanalyse oder Durchflußzytometrie in Kombination mit der Messung der Länge der Embryonen am Ende des frühen Dehnung verwendet, wird die Identifizierung von Genen entweder früh oder spät Dehnung oder beide mit hoher Empfindlichkeit und Präzision zu steuern ermöglichen. Diese Verfahren können dann tragen wesentlich zur zukünftigen Verständnis der räumlichen und zeitlichen Regulation von Signalwegen embryonale Dehnung in C. Steuerung elegans. Darüber hinaus können diese Ansätze auch zu studieren Signalwege Länge wie die Insulin- und TGF-beta Wege zur Umweltschadstoffe 13, 14 und chronische Exposition 15, 16 Kontrollorgan angepasst werden. Diese Messungen können bei verschiedenen Larvenstadien oder bei Erwachsenen durchgeführt werden using-Moll Variationen der Protokolle 2 und 3. Messgröße Unterschiede in L1 ist eine größere Herausforderung mit dem Schneckensortierer als größere Objekte wie L3, L4-Larven oder Erwachsene. Protokoll 3 kann dann leicht, diese Messungen zu tun angepasst werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
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