Introduction
För nästan 50 år nematoden Caenorhabditis elegans etablerat sig som en kraftfull modell för att studera viktiga frågor inom utveckling, neurobiologi, evolution, värd-patogen interaktioner, etc. en styrka av denna modell i studien av utvecklingen ligger i: dess korta livscykel 3 dagar; den lätthet med vilken dessa djur kan vara genetiskt förändrade; öppenhet som möjliggör observation av cellförskjutning och morfologi i levande djur och dess utveckling som är mest extrauterin. Utvecklingsstadier av nematoder involverar embryogenes och fyra larvstadier (L1 till L4), följt av vuxenlivet. Under fosterutvecklingen, drog epidermal morfogenes stor uppmärksamhet för sin förmåga att möjliggöra en bättre förståelse för hur epitelceller migrerar som en grupp, hur de omorganisera sin korsningar och ändra deras individuella morfologi samt deras inbördes placering i ett funktionellt epitel.Epidermal morfogenes är indelad i fyra steg: rygg inskjutning består i omorganisationen av rygg epidermala celler, kallade huden; ventrala hölje, bestående i migrering av ventrala hypodermal celler mot ventrala mittlinjen på så sätt innesluta embryot i en epitelcell monolager; tidiga och sena förlängning omvandla bönformade embryo i MASKFORMIG larver. Efter morfogenes, embryo kläcks och L1 larver börja mata med hjälp av tillgängliga bakterier i sin närmiljö.
Embryonal töjning är därför en sen fas av embryonal utveckling. Den består av en förlängning av embryot längs dess längdaxel och en minskning av dess tvärgående diameter. Detta involverar en dramatisk modifiering av formen på hypodermal celler. Töjning är uppdelad i en tidig och en sen fas. Den tidiga fasen börjar vid kommastadiet och slutar när kroppen väggen muskler börjar upphandlande vid 1,75-faldig steg i viktIDL-typ (wt) embryon - motsvarande embryon som är 1,75-faldig i längd jämfört med icke-långsträckt embryon. Morfogena processer som sker i detta skede är främst genom sammandragning av fintrådiga aktin buntar (FBS) som lokaliseras på den apikala pol hypodermal celler som driver sin förlängning längs antero-posterior axel av embryot två. Sammandragning av FBS kontroll genom fosforylering av myosin-lätta kedjor av tre kinaser LET-502 / ROCK, MRCK-1 och PAK-1 5. Den sena fasen av förlängningen börjar när kroppen väggen muskler blir funktionella och börja kontrakt. Det handlar mechanotransduction signalering från kroppen väggen muskler till rygg och ventrala hypodermal celler och slutar när djuren kläcks 3.
Förlängnings defekter kännetecknas generellt av andelen djur som dör som embryon (embryonal dödlighet, Emb) och de arrestera deras utveckling som L1 larver (Larv gripandet fenotyp; Lva) och är betydligt kortare än vikt. Identifiering av scenen av utvecklings gripandet kräver mikroskopisk observation av döda embryon och greps larver 3-6.
Det har nyligen visat att flera gener, såsom Cdc42 / Rac regulator och effektor pix-1 och pak-1, kontrollera morfogena processer under både tidig och sen töjning 3,7. Vi har nyligen visade också att morfogena processer skiljer sig längs antero-posterior axel embryon under tidig förlängning 3 7. Dessa fynd motiverade utveckling av nya mått speciellt riktade tidig eller sen förlängningssteg och annan statistik som möjliggör karakterisering av morfologi av embryon längs sin antero-posterior axel under tidig förlängning.
Dessa nya metoder består i att mäta längden av embryon i början och i slutet av början av förlängningen samt bredden av deras hanannonser och svansar. 7 Två protokoll har också utvecklats för att mäta längden på nykläckta larver, synkroniserad på L1 stadium 7.
Äggskalen av embryona skydda dem mot alkalisk hypoklorit behandling medan larver, vuxna och bakterier som finns i odlingsmediet löses genom behandlingen. Denna behandling används sedan för att rena embryon från en icke-synkroniserad population innehållande en majoritet av väl matade vuxna 8. Mat begränsning används för att synkronisera nykläckta larver. Att mäta längden på dessa larver används sedan för att detektera förlängnings defekter. Denna mätning är att föredra framför mätning av greps larver på odlingsplattor eftersom larver som kläcks ur inte helt långsträckta embryon kan återgå till "normal längd" vid utfodring men kommer att behålla sin reducerade storlek när gripits i frånvaro av livsmedel.
Här presenterar vi detaljerade protokoll som möjliggör mätning av length av förlängning embryon liksom bredden av huvudet och svansen med time-lapse DIC mikroskopi och bildanalys (protokoll 1). Vi tillhandahåller också detaljerade protokoll för att mäta längden på synkroniserade larver med hjälp av bildanalys (protokoll 2) och flödescytometri (protokoll 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Karakterisering av Tidiga Förlängning Defekter i WT och muterade djur
- Monterings Embryon för Normarski DIC Mikroskopi
- Förbered följande odlingsmedier och material:
- M9-buffert, lös upp 12,8 g / L Na 2 HPO 4 • 7 H2O, 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L NaCl, 0,25 g / L MgSO 4 • 7 H2O i destillerat vatten och autoklav för att sterilisera.
- NGM plattor, lösa 3 g / L NaCl, 16 g / L agar, 2,5 g / L baktopepton i DDH 2 O. Autoklavera och tillsätt 1 mM MgSO 4, 1 mM CaCl2, 1 mM fosfatbuffert och 5 | j, g / ml kolesterol. Häll 6 ml NGM per 60 mm rätter. Låt substratet stelna under 24 h vid rumstemperatur. Tillsätt några droppar av en mättad kultur av E. coli OP50 bakterier odlas i Luria-buljong (LB). Låt bakterierna växa under 48 timmar och lagra plattorna vid 4 ° C.
- För att generera masken pick, montera en 0,01 "diameter platinatråd på en kort Pasteur-pipett. Fäst platinatråd till den ände av glaset pipett genom att värma denna extremitet med en bensen brännare. Platta änden av tråden för att generera ett slags skyffel.
- Växa masken belastning på 60 mm NGM plattor med OP50 vid 20 ° C.
OBS: värmekänsliga alleler kan kräva växande djuren på icke-tillåtande temperaturer på upp till 25,5 ° C. Plattorna bör innehålla många unga vuxna och fortfarande gott om mat i syfte att nå de protokollen. - Placera ett objektglas mellan två distans slides som omfattas av två skikt av maskeringstejp (Figur 1A).
- Förbereda en 3% agaros-lösning (vikt / volym) i M9-buffert genom upplösning av 0,6 g agaros pulver i 20 ml M9-buffert genom upphettning i mikrovågsugn under 30 sek. Låt lösningen svalna i 5 min.
OBS: agaroslösning kan användas för ett par dagar efter smältning i en mikrovågsugn. Detkan också alikvoter och lagrades vid 4 ° C i flera veckor. - Placera en droppe av varm 3% agaroslösningen på glasskivan som ligger mellan de två distans-bilder. Undvik bubbelbildning.
- Snabbt täcker agarosen med en annan bild som visas i figur 1B och tryck försiktigt. Det översta objektglaset kommer att platta agarosen droppe och generera en dyna med tjockleken hos två skikt av maskeringstejp.
- Tillåta agarosen att stelna under minst 1 min vid rumstemperatur eller tills embryona är redo att överföras till dynan.
- Med hjälp av en mask plocka, överför 20 till 30 väl matas unga vuxna från NGM-plattan i en mikro-centrifugrör innehållande 400 pl M9 buffert.
- Tillåta maskarna att sedimentera genom gravitation i ungefär 5 min och avlägsna supernatanten med användning av en mikropipett. Detta steg syftar till att ta bort den maximala av bakterier plockade med nematoderna.
- Tillsätt 200 pl av M9-buffert till varje rör.
- Med användning av en Pasteur-pipette, överföra innehållet i röret (buffert och nematoder) till ett urglas.
- Använd en eller två 25G 5/8 "nålar för att skära djuren vid mittkroppssektionen (mellan spermatheca och vulva).
OBS: Ett skalpellblad kan också användas som ett alternativ till nålen (er). Gör detta på simning nematoder och kan kräva lite övning. Tanken är att använda nålar som sax eller en kniv beroende på hur många nålar används. När djuren är uppskuren, hermafroditer frigör deras embryon in i bufferten. - Koncentrera embryon vid centrum av den urglas genom generering av en cirkulär virvel i vätskan.
- Avlägsna det mesta av M9 från urglaset med användning av en mikropipett. Lämna cirka 30 pl M9 med embryona.
- Ta bort bilden som täcker agarosen pad (Figur 1B) genom att skjuta bort kudden.
- Skär plattan med ett rakblad för att kunna att helt täcka den med en täck (Figur 1C).
- Med hjälp av en pasteurpipett, överföra alla embryon (och mask skräp) på agarosen pad.
- Grupp embryona i mitten av dynan med hjälp av en ögonfrans limmad vid änden av en spets som används för 200 ul mikropipetter.
- Långsamt placera en täck på plattan undvika bubbelbildning och försegla den.
OBS: Flera tätningsmedel kan användas. Vi använder dra tuggummi finns i konst och hantverk butiker (vanligtvis används som maskering tuggummi för akvarellmålning). Detta gummi används eftersom det är hydrofilt och stelnar tämligen snabbt och är inte giftig för maskar. Bilderna kan också tätas med nagellack eller valap (blandning gjord av vaselin, lanolin och Parafin vax). - Låt dra tuggummi torka i ca 15 minuter.
- Förbered följande odlingsmedier och material:
- Inspelning Tidig Förlängning använder Fyrdimensionell Normarski DIC mikroskopi
OBS: Syftet med detta steg är att spela tidigt förlängning från kommatecken till början av slutet av töjning- Definieras som den tidpunkt då kroppen väggen muskler börjar kontrakt. Vi strävar också efter att spela mer än ett embryo åt gången. Åtta timmars inspelning är vanligtvis krävs för att spela in tidigt förlängning för en grupp av icke-synkroniserade embryon.- Placera den monterade-slide på scenen i ett mikroskop. Se till att mikroskop är utrustad med 10X och 60X mål samt DIC linser, prisma, kamera och fånga programvara som gör det möjligt time-lapse mikroskopi och generering av Z-stackar (automatisk Z-plattform).
OBSERVERA: se till att temperaturen är konstant mellan 20 och 23 ° C i mikroskopi rummet. En värme-kylkammare kan krävas på mikroskop scenen, speciellt när man använder värmekänsliga mutanter. - Identifiera en grupp av embryon vid pre-morfogenes steg med hjälp av 10X objektivet.
- När läge, glida av 10X objektivet och tillsätt en droppe olja nedsänkning på bilden.
- Med hjälp av 60X mål, identifiera toppen och botten av embryos att ställa bildparametrar Z-stack.
OBS: Tveka inte att ställa in Z-stack större än tjockleken av embryon. Ställ in avståndet mellan två intilliggande plan som 0,8 pm. Detta gör det möjligt att täcka det totala djupet av embryon i 35 till 50 Z-planer.
OBS: Om mikroskopet innehåller en automatiserad xy-plattformen, kan embryon placerade på olika platser i dynan spelas in samtidigt. För att göra detta, samordnar rekord xy av varje plats på plattan som du vill analysera under försöket. Se till att välja xy när du ställer in inspelningsparameter och följ resten av protokollet som anges. Tunn Z-sektionering av embryot under inspelningen inte nödvändigtvis för mätningarna som beskrivs i detta protokoll. Inspelning embryonal utveckling av wt och muterade djur med den maximala upplösningen är dock en god praxis för att bygga ett bibliotek av inspelningar som kan stödja ytterligare analyser. - Uppsättningupp time-lapse med 2 minuters intervall mellan två förvärv som varar åtta timmar.
OBS: Exponeringstiden beror på ljusintensiteten inställd för mikroskopet. Cellrörelse under tidig töjning är mycket långsam; exponeringstiden kan vara ungefär en bild per sekund eller mindre. Om embryona är i tidiga stadier morfogenes (rygg interkalering, ventrala kapsling) skulle tidig töjning registreras inom en timme. Se till att ljuset slutare är stängd mellan varje förvärv. - Kör förvärv och spara den.
- Placera den monterade-slide på scenen i ett mikroskop. Se till att mikroskop är utrustad med 10X och 60X mål samt DIC linser, prisma, kamera och fånga programvara som gör det möjligt time-lapse mikroskopi och generering av Z-stackar (automatisk Z-plattform).
- Mätning av Tidiga Förlängning Fel användning av bildanalys
- Öppna Fiji-ImageJ programvara ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- I menyn väljer Analyze / Set Mått väljer Perimeter. För varje embryo, justera Z-skalfältet för att fokusera på svalget av embryot som visas i figur 2A. Detta kommer att säkerställa att du fokuserar på mitten av embryot. För att mäta längden av embryot, justera tidsskalan baren har embryot intresse i början av den tidiga förlängning (kommastadiet, figur 2A). Notera tiden ( "Time-början").
- Välj den segmenterade linjeverktyget. Rita en segmenterad linje från spetsen på mynningen av embryot upp till spetsen på svansen efter mittlinjen av embryot (Figur 2A). Använda menyfliken Analysera / Mät, få längden på den ritade linjen ( "Längd början").
- Upprepa denna mätning för samma embryo vid slutet av tidig förlängning (ögonblick då musklerna börjar upphandlande). Notera tiden ( "Time-end") och mäta längden på embryot ( "Längd-end") som beskrivs ovan (Figur 2B).
- Beräkna varaktigheten (D) av tidig töjning och ökningen längden (L) under detta steg som följer:
D = "Time-end" - "Time-början"
& #160; L = "Längd-end" - "Längd-början" - För att mäta huvudet bredd, justera tidsskalan baren har ett embryo i det skede av intresse (1,2-faldig steg eller slutet av tidig förlängning). Välj den linjära verktyg. Rita tvärgående (dorso-ventrala axel) mittlinje huvudet. Detta avsnitt är den tjockaste delen av embryot (Figur 2C). Använda menyn Analysera / Mät, få längden på linjen som motsvarar huvudet bredd.
- Vid samma tidpunkt, upprepa detta steg genom att dra den tvärgående mittlinjen av svansen (Mid-linje mellan den intestinala ventilen och svansspetsen, fig 2C) och mäta den för att erhålla svansen bredd.
OBS: Använd denna mätning att jämföra embryon i samma skede i olika fenotyper. För att säkerställa reproducerbarhet av denna mätning, se till att hitta en plats som ligger runt mittlinjen av svansen på djuret som lätt kan kännas igen från ett djur till ettnother. - För att beräkna huvudet svans bredd till dela bredden huvudet i svansen bredd.
2. Karakterisering av sen Förlängning Fel användning av bildanalys
- Synkronisering av L1 Larver med hjälp av alkaliskt hypokloritbehandling
- Från en icke-svalt 60 mm platta som innehåller många gravida vuxna, samla alla maskar i en mikro-centrifugrör genom tvättning nematoderna från plattan med 1 ml M9-buffert med användning av en Pasteur-pipett.
- Sediment nematoder i 3500 xg i 3 minuter vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten med användning av en mikropipett utan att störa den snäck pelleten.
- Tillsätt 1 ml hypokloritlösning till varje rör (0,4 M hypoklorit, 0,5 M NaOH) och skaka om under 3 min.
OBS: Alkaline hypokloritlösning bör beredas och embryon i denna lösning bör skakas försiktigt men kontinuerligt för att optimera upplösningen av de vuxna och syresättning av EMBRyos. Efter 3 min omrörning, bör de flesta vuxna släppa sina ägg i lösningen. - Snurra vid 3500 xg under 3 min vid rums-temperatur och snabbt avlägsna supernatanten med användning av en mikropipett utan att störa pelleten.
- Tvätta fyra gånger med 1 ml M9-buffert, följt av centrifugering vid 3500 xg under 3 min.
- Efter den fjärde tvätten, avlägsna supernatanten och återsuspendera ägg i 700 pl M9 buffert utan att pipettera upp äggen (som äggen skulle hålla sig till plasten i spetsen).
- Tejpa tuben på en 3-mm orbitalskak placerades i en inkubator vid en lämplig tillväxttemperatur och skaka vid 600 rpm över natten.
- Längd Mätning av synkroniserad Larver
- Centrifugera arrested L1 larver vid 3500 xg under 3 min vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten. Resuspendera larverna i 100 pl M9-buffert och överför dem till ett agaros dyna med användning av en Pasteur-pipett (agaros kuddar ska förberedad som beskrivs i avsnitt 1.1.2 till 1.1.8). Placera en täck på plattan.
OBS: Dynan behöver inte tätas med gummi för detta experiment som involverar kort förvärv. - Använd en 10X objektiv och faskontrast belysning för att mäta längden på larverna om en kamera med hög upplösning används. Öka intensiteten i ljuset för att kunna ta bilder inom några millisekunder och därmed få en klar bild av larver (figur 2D).
OBS: Även om simning trashes av larver reduceras genom agarosen pad, är de fortfarande i rörelse. Därför är snabb inspelning viktigt att få en tydlig bild. - Öppna Fiji-ImageJ och upprepa steg 1.3.1. För att mäta längden av larver, väljer den segmenterade linjeverktyget. Rita en segmenterad linje från spetsen av huvudet upp till spetsen av svansen efter mittlinjen av larver (figur 2D, höger panel).
- Använda menyn Analysera / Mät, få längddragna linjen motsvarar längden av larverna i mikrometer.
- Centrifugera arrested L1 larver vid 3500 xg under 3 min vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten. Resuspendera larverna i 100 pl M9-buffert och överför dem till ett agaros dyna med användning av en Pasteur-pipett (agaros kuddar ska förberedad som beskrivs i avsnitt 1.1.2 till 1.1.8). Placera en täck på plattan.
3. Karakterisering av sen Förlängning Defekter med flödescytometri
- synkronisera Larver
- Rena embryon med hjälp av alkalisk hypoklorit behandling som beskrivs i avsnitt 2.1 från hela 100 mm plattor av välnärda unga vuxna och låta embryot luckan och L1 gripandet i M9 buffert för 16 till 24 timmar vid 20 eller 25,5 ° C beroende på stammen analyseras.
OBS: En fullständig platta med välnärda vuxna per stam är tillräcklig för den analys som beskrivs nedan.
- Rena embryon med hjälp av alkalisk hypoklorit behandling som beskrivs i avsnitt 2.1 från hela 100 mm plattor av välnärda unga vuxna och låta embryot luckan och L1 gripandet i M9 buffert för 16 till 24 timmar vid 20 eller 25,5 ° C beroende på stammen analyseras.
- Kalibrering av Worm Sorter
OBS: flödescytometer som används här är en stor partikel flödescytometer (nedan kallad snäcksorterare). Masken sorterare inkluderar en 670 nm röd diodlaser, som ligger framför en utrotning detektor. Masken sorterare innehåller också en multi-line argonlaser för fluorescerande excitation. standard instrument har tre fotomultiplikatorrör (PMT) fluorescensdetektorer används för att detektera fluorescensemissioner i de gröna, gula och röda områden av spektrumet. I det protokoll som beskrivs här kommer TOF användas för att mäta storleken på larverna kommer den röda kanalen användas för att identifiera döda maskar som ska färgas med propidiumjodid (PI). GP (General Purpose) hög fluorescens kontroll Partiklar som används för att kalibrera instrumentet och som en intern kontroll i vårt experiment visar hög fluorescens i grönt, gult och rött. De kommer att vara de enda objekt i det analyserade provet med hög emission detekteras i den gröna kanalen och kommer därefter att identifieras utifrån denna egenskap.
OBS: levande djur identifieras baserat på frånvaron av fluorescens i kanalen grönt och rött samt på TOF. Autofluorescent utsläpp från tarmen av larver är inte detekterbar vid L1 skede.- Slå på laserblock, datorn, kompressor end masken sorteringsinstrument. Tryck på START-knappen på den öppnade masken sorterare programvara som anges i bruksanvisningen för instrumentet.
- Observera argonlaser styr popup-fönster. Välj RUN-läge och vänta eftersom de lasereffekter når 10 ± 1 mW. Välj DONE på laserkontrollfönstret.
- Ställ höljet och provtrycket till 5,10 ± 0,02 och 5,51 ± 0,01 respektive. Låta trycket i jämvikt under åtminstone 15 min och klicka på TRYCK OK kryssruta.
OBS: Flödet beror på höljet och provtrycket. - Se till att eliminera alla bubblor som finns i flödeskanalen tubuli mellan provkoppen och analyskammaren. För att göra detta, klicka förvärva och knacka försiktigt på tubuli tills ingen bubbla förvärvas (sett i förvärvs fönster).
- Inställning av alla parametrar för lysrör och TOF mätning och detektering enligt följande:
- Ställ in skalor för TOF, Ext, grönt, gult och rött till256. Ställ förstärkning som beskrivs i tabell 1. Ställ in PMT kontroll vid 700 för grönt och gult och 900 för Red.
OBS: Två excitationsfilter är tillgängliga (488 nm och 514 nm) och kan användas för att excitera antingen grönt fluorescerande protein (GFP) eller gult fluorescerande protein (YFP) eller några fluorokromer exciterade vid dessa våglängder med multiline argonlaser. Lämpliga filter måste sättas in i filterkammaren i utrustningen. Vi använde 488 nm filter för följande experiment.
- Ställ in skalor för TOF, Ext, grönt, gult och rött till256. Ställ förstärkning som beskrivs i tabell 1. Ställ in PMT kontroll vid 700 för grönt och gult och 900 för Red.
- För att kalibrera masken sorterare, välj "kör kontroll partiklar" i verktygsmenyn. Sätt 20 ml 1x GP (General Purpose) hög fluorescens kontroll Partiklar i koppen (dessa partiklar är fluorescerande partiklar av exakt storlek, säljs av cytometry tillverkaren att kalibrera sina instrument).
- Klicka på FÅ FRAM knappen för att börja mantel och provflödet.
OBS: Räkna med en genomsnittlig samband med distribution av 21 ± 6 och AC kontroll partikeloefficient variation kring detta medelvärde (CV) ≤11. Om CV> 11 och medelvärdet är> 27 försök att rengöra tubuli genom att klicka flera gånger på ren-knappen eller genom att ställa flödeskanalen.
- Förvärv av Animal TOF
OBS: Ljus scatters när ett föremål passerar i cellflödet mellan laserkällan och extinktionen detektorn. Den tid det tar för ljuset att spridas genom den flygande föremål (time of flight, TOF) används för att mäta den axiella längden av föremålet. Omfattningen av ljus maskeras av objektet (extinktion, EXT) används som ett mått på dess opacitet / optisk densitet.- Placera 10 pl synkroniserad vildtyp (wt) L1 i ett urglas och uppskatta andelen döda-ägg med ett dissektionsmikroskop.
OBS: Synkroniserad L1 som uppvisar hög Emb (högre än 20%) i vikt bör inte användas för vidare analys. - Överföring synkroniserad L1 från mikrocentrifug (approximately 700 pl M9 innehållande L1) till en 15 ml koniska rör. Lägg propidiumjodid (PI) vid en slutlig koncentration av 10 | ig / ml (spädning 1/100: e från en 1 mg / ml stamlösning) och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Döda ägg och larver kommer att färgas med PI och detekteras som mycket fluorescerande objekt med den röda kanalen. - Tillsätt 10 ml M9 buffert för att späda färgade populationer. Ta 5 ml av den utspädda befolkningen och späda ut dem fyra gånger genom att tillsätta 15 ml M9. Placera denna utspädning i provkoppen.
- Kör provflödet genom att klicka förvärva och observera flödet.
NOTERA: För att få en noggrann mätning, bör flödeshastigheten stanna mellan 15 och 25 föremål / sek. - Om det är nödvändigt, justera mängden djur i koppen för att nå den önskade flödeshastigheten.
OBS: flödeshastighet beror på trycket (slida och prov) som är konstanta som anges i 3.2.3 och på koncentrationen av larver in koppen. Om flödeshastigheten är högre än 25 objekt / sek lägga en buffert i koppen. Om den är lägre än 15 objekt / sec Lägg koncentrerad L1 (från steg 3.3.3) i koppen. - När lämplig koncentration av ändamål uppnås, utvärdera volymen i koppen och tillsätt 1/4: e av denna volym i High Fluorescent GP kontroll Partiklar 4x lösning.
- Justera grindnings och sorteringsparameter. För att göra detta, klicka på "Gating" på menyn och välj "TOF vs." och "gröna". Klicka på "Sortering" på menyn och välj "TOF vs." och "Red". Gating och sorterings grafik visas då som visas i figur 3A.
OBS: Detta kommer att möjliggöra visualisering av styr partiklarna (utsläpp i grönt och rött), döda djur färgas av PI och bubblor (emission i rött och inte grön) och levande djur (ingen emission i varken grön eller röd kanaler) (Figur 3A ). - Kör experimentet genom att klicka på ACQUire.
OBS: För att identifiera små storleksskillnader mellan larver, analysera cirka 10.000 föremål, så ca 8000 djur. Avbryta experimentet och exportera data som .txt-format genom att klicka på STORE.
- Placera 10 pl synkroniserad vildtyp (wt) L1 i ett urglas och uppskatta andelen döda-ägg med ett dissektionsmikroskop.
- Mätning av den relativa storleken på levande djur i Synchronized populationer
- Öppna txt-fil med hjälp av en programvara kunna hantera stora datatabeller.
- Från de analyserade objekten extrahera TOF värden som är förknippade med kontroll partiklar som kännetecknas av utsläpp i den gröna kanalen högre än 100 godtyckliga enheter (detta värde beror på de parametrar som i punkt 3.2.5). Skapa en ny kolumn och kallar det "kontroll partiklarnas. Skapa en kolonn som innehåller alla andra föremål utom kontroll partiklar som kallas "prov". OBS: fluorescensemissionen av nya partiklar parti behöver kontrolleras innan förvärven. Detta ställer in fluorescerande tröskel som gör det möjligt att identifierakontrollpartiklar över L1s.
- För varje analyserat stam identifiera den del av experiment där flödeshastigheten har ändrats (på grund av närvaron av en plugg av ägg för exempel). Att göra så:
- Rita TOF av kontrollsystem partiklarnas för varje prov som en faktor av tid (Figur 3B).
- Rita den linjära trendlinjen med hjälp av trendlinjen verktyget och visar ekvationen på sjökortet.
OBS! TOF kontrollpartiklar bör vara konstant över tiden (horisontell linje, figur 3B). Med tanke på ekvationen för den linjära trendlinje ritas på data y = ax + b, se till att "ett" värde är lägre än 10 -4. Alla mätningar som gjorts inom tidsavsnitt visar en bristning i anpassningen av kontroll partikel bör tas bort från analysen.
- Ta bort döda embryon och bubblor (utsläpp är högre än 15 i den röda) samt små skräp och stora ägg pluggar (TOF lägre än 10 och höger än 70 respektive) från "prov" mätning.
- Rita "kontroll partiklarnas fördelning för varje stam analyserats. Såsom framgår av fig 3C dessa fördelningar bör överlappa nästan perfekt. Detta säkerställer att TOF mätvärdena för olika stammar kan jämföras. OBS: normalisering av provelement TOF jämfört med kontrollpartiklar kan användas om de fördelningar av kontrollpartiklar i ett prov inte överlagra med den hos kontrollprover. Normaliserade TOF beräknas som följer:
- Normalisera TOF för genotyp G = (prov TOF för G) / (genomsnittlig "kontroll partikelns TOF för G) x (genomsnittlig" kontroll partikelns TOF för wt) där wt är kontrollprovet.
- Rita Larver TOF fördelning för varje stam inklusive kontrollprov, i vårt fall vikt djur (Figur 3D). Mäta medelvärdet och standardfelet för medelvärdet (SEM) för varje population (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Huvud-, bak- och chef / Tail-bredd är robusta Metrics.
De protokoll som beskrivs här har med framgång använts för att karakterisera funktionen hos regulatorer och effektorer av Rho GTPaser pix-1, pak-1 och låt-502 under tidig förlängning 7. Pix-1 och pak-1-kod respektive en guanin utbytesfaktor (GEF) och en effektor specifik för Rac / Cdc42 GTPases och låt-502 kodar för en effektor för RHO-1 7. I denna studie var pix-1 och pak-1 visade att kontrollera epidermal morfogenes under tidig förlängning 7. Denna studie används huvud och svans breddmätning som mätvärden visar för första gången, att hypodermal celler belägna i den främre embryo följa olika morfogena program än de som ligger i dess bakre 7. För att fastställa reproducerbarhet och robusthet av dessa mått, var chef bredd mätt oberoende fem gånger på 12 vildtyp (wt) embryon vid 1,2-faldig skede. Avvikelser mellan de fem olika grupper av mätningen jämfördes sedan utvärderas med hjälp av Brown-Forsythe testet (med R statistikpaketet) avslöjar inga signifikanta skillnader mellan mätningarna (F- prov p- värde> 0,5, Figur 4A) vilket antyder att mätningar för en grupp av embryon är reproducerbara. Bedömning av reproducerbarhet och sats effekter förknippade med dessa mätningar gjordes genom mätning av bredden chef för wt embryon vid 1,2-faldig steget från 4D-DIC imaging göras på tre olika dagar (n = 12 embryon). Över dessa tre mätnings grupper, variansen var inte signifikant olika och inga signifikanta sats effekter befanns påverka huvudet-wIDþ mätresultat (F-test p-värde> 0,5; Fig 4B).
Liknande resultat erhölls för mätningar svans bredd och för mätningar gjorda i olika skeden av tidig förlängning (data visas ej). Dessa data etablerade huvud-bredd, svans bredd och huvud / svans bredd robusta mått för att karakterisera början förlängnings defekter.
Mätning huvud och svans Bredd samt Längd på Embryon Tillåter för karakterisering av gener som kontrollerar Tidig Töjning längs Antero-posterior axel av embryot.
Mätning av längden av embryona, samt bredden på deras huvud och svans gjordes på wt och mutanta Embryon som null eller termosensitiva stark förlust-av funktions alleler för gener som kontrollerar tidig förlängning: pix-1 (gk416);pak-1 (ok448) och låt-502 (sb118ts) 7. Vi mätte huvud / svans (H / T) bredd hos wt och mutanta embryon i början (1,2-faldig steget) och vid slutet av den tidiga förlängningen vid icke permissiva temperaturer (Figur 4C vänster och höger panel respektive). Medan i början av tidig töjning fanns det ingen förändring-eller en reducerad H / T-förhållande observerades i pix-1, pak-1 och låt-502 mutanter i jämförelse med wt-djur (1,2-faldig stadium, figur 2C, vänster panel ), vid slutet av tidig töjning samtliga tre mutanter uppvisade en signifikant högre H / T-förhållande än wt-embryon (t-test p-värden <0,006; figur 4C, höger panel). Detta visade att pix-1, pak-1 och låt-502 mutanta embryon uppvisar onormal antero-posterior morfologi vid slutet av tidig töjning. Ytterligare analys jämföra huvud bredd och svans bredd between 1,2-faldig scenen och i slutet av tidig förlängning, med samma parametrar mätning visade att huvudbredden mindre minskas i pix-1, pak-1 och låt-502 mutanter medan svansen bredd minskar betydligt mindre i Let-502 mutanter endast 7. Detta avslöjade att låta-502 styr morfogena processer liknande längs antero-posterior axel av embryot, medan pix-1 och pak-1 kontroll morfogena processer som sker i huvudsak på den främre delen av embryot 7. Skillnaden i längd mellan embryon vid slutet jämfört med i början av tidig förlängning (Figur 4D) mättes också. Vi fann att tidig förlängning reducerades signifikant i pix-1, pak-1 och låt-502 mutanter i jämförelse med vikt tyder på att förändring av den främre morfogenes i pix-1 och pak-1 mutanter enbart är tillräcklig för att avsevärt minska elongation av embryot.
Protokoll 2 och 3 användes för att mäta längden på greps larver i wt och mutanta bakgrunder. Längden på dessa larver bestämdes med användning av både bildanalys (Protokoll 2) 7 och flödescytometri (Protokoll 3; opublicerade data). Mätningar av larver längd med hjälp av bildanalysresultat i absoluta mätningar av djurens längd i mikrometer i en robust och mycket reproducerbart sätt (Figur 5A). Denna analys visade att synkroniserad mutant larver display minskas avsevärt längd jämfört med vikt (figur 5A) 7. Mätning av dessa larver med hjälp av flödescytometri baserat protokoll (protokoll 3) gav jämförbara resultat (Figur 5B). Emellertid bör det noteras att det stora antalet larver mätas med den senare metoden ökade signifikant den statistiska robustheten genotyp jämförelse (t - test p-värden <10 -24). Baserat på dessa resultat, kan flödescytometri strategi vara ett bättre val än bildanalys för att karaktärisera muterade djur som uppvisar mycket subtila förlängnings defekter.
Figur 1. Beredning av en agaros Pad. A, objektglas placeras mellan två distans-bilder som omfattas av två skikt av maskeringstejp. B, är agarosen pad täckt med en annan bild som stöds av de två distans-bilder. C, den slutliga formen och storleken på agarosen pad efter skärning med ett rakblad för att passa täck. klicka här för att se en större version av denna siffra.
g2.jpg "/>
. Figur 2. Mätning av tidiga och sena Förlängning Defekter A - B, mätning av längden av ett embryo vid kommasteget (A) och vid slutet av tidig förlängning (B). Den röda linjen, används för att mäta embryona drogs genom att använda den segmenterade linjen verktyget i ImageJ. C, huvud och svans bredd mäts i embryon vid 1,2-faldig steget (till vänster) och i slutet av tidig förlängning (höger). Pilar representerar lokalisering av uppmätta områden (modifierade från Martin et al., 2014). Skala bar:. 20 pm D är längd Larver mätt för synkroniserad L1-larver. Högra panelen är en förstorad vy av den tagna bilden (vänster). Den röda linjen drogs med hjälp av den segmenterade linjen verktyg för ImageJ. Det används för att mäta längden på larven. Skala bar:. 100 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Mätning av längd Synkroniserad Larver Använda flödescytometri. A, Gating och sortering fönster Copas Biosort visar grönt och rött utsläpp av kontrollpartiklar, bubblor, döda och levande djur med avseende på deras Time-of-flight (TOF ). B, TOF kontrollpartiklar vid olika tidpunkter för ett representativt experiment. Lutningen av den linjära funktion av TOF i förhållande till tiden är ca 10 -5, vilket indikerar att TOF av kontrollpartiklar är konstant över tiden genom hela experimentet. C, Fördelning av kontrollpartikel tofs uttryckta som procent av maximalt värde av fördelningar. Icke-normaliserade och normaliserade kontroll partikelfördelningar representerade för pak-1 (ok448). Andra distributioner är inte normaliserats. D, distribution av tofs för att levadjur, uttryckt i procent av det maximala värdet av de fördelningar. Tofs är inte normaliserade på kontrollpartiklar med undantag för pak-1 (ok448) som anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Pix-1, Pak-1 och Låt-502 Mutants Nuvarande Tidig Förlängning defekter. A - B, bredd Reproducerbarhet och robusthet bedömning av huvudet mätningar A, Fem oberoende mätningar av bredden huvud för wt-embryon vid 1,2-faldig steget (n = 12 embryon).. Medel och standardavvikelser (felstaplar) anges. Icke signifikanta (NS) skillnader mellan mätningarna beräknades med hjälp av Brown-Forsythe test (ossIng R statistikpaketet) (F-test p-värde> 0,5). B, chef breddmätning för wt embryon vid tre olika dagar (n = 12 embryon). Medelvärden och standardavvikelser anges liksom; Det var ingen signifikant skillnad i variansen över mätningar (ns, Brown-Forsythe F-test p- värde> 0,5) C, Utdelning av huvud / svans bredd på 1,2-faldig skede (till vänster), i slutet av början. förlängning (högra panelen) i vikt, pix-1 (gk416) pak-1 (ok448) och låt-502 (sb118ts) mutanter vid 23-24 ° C. Observera att mödrar låt 502ts embryon som används för denna studie odlades vid 25,5 ° C. D, Fördelning av förlängningen i vikt, pix-1 (gk416) pak-1 (ok448) och låt-502 (sb118ts) mutanter mellan kommatecken steget och början av slutet av förlängningen. Box-tomter representerar min, max, 25: e, 50: e (median) och 75th percentiler av befolkningen. * T-test p-värde <0,05, ** t-test p-värde <0,006 (modifierad från Martin et al., 2014). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) och L et-502 (sb118ts) Larver Present Length Defekter. A, längd larver mätt i vikt, pix-1 (gk416) pak-1 (ok448) och låt-502 (sb118ts) djur mäts med hjälp av bildanalys (protokoll 2). B, relativ larver längd mäts med hjälp av flödes cytometer ( protokoll 3). Siffror inom parentes motsvarar antalet djur som används för the mätningar. Medel för längder och standardfel för medelvärdet (SEM, felstaplar) är representerade. Students t-test p- värden anges (s). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver nya mätmetoder för att karakterisera tidiga och sena faser av embryonala förlängning.
I avsnitt 1, är det kritiska steget potentiella förekomsten av bakterier på plattan. Embryona är hermetiskt innesluten mellan dynan och täck under bildtagning. Tätning bilden krävs för att undvika uttorkning av djuren under förvärv som varar mer än två timmar. Såvitt vi vet, inget av de sealers används för att montera agaros dynor mellan sliden och täckglas är luftgenomsläppligt. Följaktligen, när en stor mängd bakterier (eller embryon) är närvarande på plattan, de kan gå miste om syre efter några timmar som leder till deras tidig död. Med trefaldiga embryon - motsvarande embryon som är tre gånger i längd jämfört med icke-långsträckta embryon - inspelade tillsammans med embryon av intresse kommer att vara en bra indikator på potentiella hypoxiska förhållanden, eftersom dessa embryon slutar röra sig i their äggskal i frånvaro av syre. Inga morfologiska mätningar bör göras på hypoxiska förhållanden eller på döda embryon.
En annan kritisk steg vid användning av time-lapse avbildning är temperatur vid vilken utveckling av embryot sker. Värmekänsliga mutanter används för närvarande i C. elegans. Den biologiska effekten av temperaturförändring kan vara omedelbar eller fördröjd beroende på halveringstiden för proteinet och vilken typ av mutation dess bär. Följaktligen bör den temperatur vid vilken embryot exponeras vara konstant över tiden och bör kontrolleras av lämplig ventilation av mikroskopi rum eller ett värmnings-kylkammare på mikroskop scenen.
Avsnitt 2 är beroende av larver synkronisering med hjälp av alkalisk hypoklorit behandling. Under vissa omständigheter kan denna behandling leda till embryonal dödlighet (Emb). EMB över 20% i vikt befolkningen tyder på en förhöjd toxicitet under hypoklorit behandlaning som kan påverka morfogenes negativt. Synkroniserad L1 visar hög Emb i vikt bakgrunden bör inte användas för vidare analys. Denna begränsning gäller även för protokoll 3.
Vi rekommenderar inte användning av anestesimedel för att immobilisera larver. Levamisol i synnerhet immobiliserar nematoden genom induktion av muskel tetani som tenderar att krympa larverna införa försöks partiskhet. Om exponeringstiden inte är tillräckligt snabb som en följd av de begränsningar av mikroskopet, rekommenderar vi att minska motiliteten av larver genom att öka koncentrationen av agaros i dynan och att reducera mängden av vätska mellan dynan och täckglas. Försiktighet bör iakttas dock inte torka ut larverna, eftersom uttorkning kommer att minska deras storlek.
I avsnitt 3, mätning av längd av larver används jämförelse av flödeshastigheter mellan analyserade prover. För att göra detta måste fördelningen av kontrollpartiklar vara comparöd. Om fördelningarna helt överläggnings kan TOF (time-of-flight) värden som erhållits för motsvarande prover jämföras, om inte dessa värden måste normaliseras. Normalisering av prov-TOF jämfört med kontrollpartiklar-TOF (som beskrivs i 3.4.5.1) har använts med framgång såsom visas för pak-1 (ok448) (figur 3C och figur 5B). Relativa längden av pak-1 (ok448) vs vikt visade sig vara liknande i åtminstone 3 oberoende experiment med eller utan normalisering (data visas ej). Vi rekommenderar dock, vilket bekräftar de resultat som erhållits med normalisering med de som erhölls utan den, särskilt när man jämför larver med små storleksskillnader. Det bör noteras att mätning av larverna längd med användning av flödescytometri tillhandahåller en längd i förhållande till ett kontrollprov, i detta fall, vikt- larver snarare än en absolut längd i mikrometer som för bildanalys. Detta innebär att mätningar från oberoende experiment kan intekombineras inte beräkna storleksförhållande över wt.
Bufferten som användes för utspädning i provkoppen kommer att ha en inverkan på flödeshastigheten. Vi observerade att manteln buffert som rekommenderas av tillverkaren innehåller rengöringsmedel som ökar mängden bubblor som genereras under förvärvet. Med användning av M9-buffert, som inte innehåller detergent, reducerade signifikant bildandet av bubblor men var mindre effektiv i att undvika igensättning av ägg i tubuli av sorteraren, som påverkar flödeshastigheten för prover. Ägg igensättning lätt upptäckas vid förvärvet av en markant minskning av den observerbara TOF kontrollpartiklar i ett par sekunder, följt av en förhöjd TOF- även under några sekunder. Ägg plugg kan också leda till obstruktion av kanalen och den fullständiga gripandet av partikelströmmen (mindre än 5 objekt per sekund). Om detta skulle inträffa, klicka på CLEAN-knappen tills flödeshastigheten är återställd. Alla mätningar som förekommer under dessa evenemangs bör uteslutas från dataanalys. Mantel buffert kan rekommenderas för försök med stammar som kännetecknas av höga döda ägg.
Provet och mantel tryck (inställt på steget 3.2.3), kan förändras (något) över tid och bör justeras manuellt under hela experimentet för att säkerställa en mycket konstant flöde. Minskning eller ökning av den låga räntan kommer att vara observerbara när man analyserar resultaten och plotta de tofs av kontrollpartiklar över tiden (Figur 3C). Reduktion av flödeshastigheten kommer att resultera i en ökning av den genomsnittliga tofs av partiklar över tiden, medan en ökning av flödeshastigheten kommer att resultera i det motsatta. Förändring av flödeshastigheten kommer att negativt påverka känsligheten hos förfarandet vid detektering av små storleksskillnader mellan populationer av larver.
Metoder som syftar till att identifiera gener som styr töjning och kräver tidsförlopp mikroskopi inspelning är i allmänhet högly tidsödande och omständlig när fenotypning flera genotyper. Flödes cytometer baserat tillvägagångssätt, samtidigt som den kräver utrustning som inte är tillgänglig för alla laboratorier, är mindre tidskrävande och därmed mer effektiv när flera stammar måste karaktäriseras. Denna metod är också mer statistiskt robust jämfört med mätningar med bildanalys (bedöms av studentens t- test som jämförde muterade och vikt TOF distributioner, figur 5A och B). Denna metod kan då vara mycket lämplig för stammar som uttrycker förlängnings fel med låg expressivitet / penetrans.
Flera metoder som använder flödescytometri har utvecklats tidigare för att mäta lämplighet nematoder 9-12. Dessa metoder använder djur som lämnas ut i en 96-brunnsplattor och Reflex modul av masken sorterare ". Reflex modul möjliggör direkt analys av nematodpopulation dispens inom 96-brunnsplattor. Följaktligen är dessa metoder är i stånd att characteRIZE hundratals villkor per dag och utgör ett robust sätt, på vilket för att mäta lämpligheten hos en icke-synkroniserad population. De är dock inte väl lämpad för att identifiera små storleksskillnader mellan synkroniserad L1. Mätning av små skillnader mellan L1 larver kräver mätningen över ett stort antal djur, vilket är oförenligt med användning av 96-brunnsplattor och Reflex modul som effektivt kan karakterisera 100 föremål som mest per brunn. Den här beskrivna metoden är utformad för detta ändamål på bekostnad av den genomströmning, vilket avsevärt minskar. Det gör det möjligt karakterisering av tre till fyra villkor i timmen när instrumentet är kalibrerat, vilket är en markant förbättring jämfört med användning av bildanalys i protokoll 2.
Mätning av huvud och svans bredd är den första metoden som utvecklades för att karakterisera morfogena processer som sker ojämnt längs antero-posterior axel av embryot 7. Närtillämpas på gener visat sig kontrollera tidigt förlängning, kommer dessa metoder att klargöra den geografiska fördelningen av signalvägar som styr morfogenes i detta skede. Mätning av längden av arrested larver med användning av antingen bildanalys eller flödescytometri i kombination med mätning av längden av embryon vid slutet av tidig töjning kommer att möjliggöra identifieringen av gener som kontrollerar antingen tidigt eller sent töjning eller båda, med hög känslighet och precision. Dessa procedurer kan därefter avsevärt bidra till framtida förståelse av den rumsliga och tidsmässiga reglering av signalvägar som styr embryo töjning i C. elegans. Dessutom kan dessa metoder också anpassas för att studera signalvägar som styr kroppslängd, såsom insulin och TGF-beta vägar 13, 14 och kronisk exponering för miljöföroreningar 15, 16. Dessa mätningar kan göras på olika larvstadier eller hos vuxna using mindre ändringar av protokoll 2 och 3. Mätning storleksskillnader i L1 är mer utmanande med masken sorterare än större objekt såsom L3, L4 eller vuxna. Protokoll 3 kan sedan lätt anpassas att göra dessa mätningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
