Introduction
عامل النسخ أعرب بتواجد مطلق وجوهري إنترفيرون (IFN) عامل التنظيمي 3 (IRF3) هو أمر حاسم لخط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض أساسا من خلال تحريض IFNβ، ولكن أيضا من خلال تحريض على chemokine (CC عزر) يجند 5 (CCL5 ) والعديد من البروتينات المضادة للفيروسات بما في ذلك البروتين IFN التي يسببها مع tetratricopeptide يكرر IFIT1 / 2/3 1-3. تم الإبلاغ عن تفعيل IRF3 العدوى التالية مع العديد من الفيروسات أو التعرض لحمض polyinosinic-polycytidylic (بولي I: C) أو lipopolysaccharide في (LPS) 4. الأهم من ذلك، تطورت الفيروسات الأكثر دراسة آليات للتهرب من الاستجابة بوساطة IRF3، وبالتالي الهروب من المضيف الدفاع المناعي الفطري 5. وهكذا، ورصد تفعيل IRF3 له أهمية كبيرة لفهم الآليات الجزيئية للالفطري دفاع المضيف المضادة للفيروسات، ولكن أيضا لتحديد استراتيجية تستخدمها الفيروسات للتصدي لهذا الرد.
والأنف والحنجرة "> لكن العديد من التقارير المنشورة لا توفر سوى تحليل محدود من تفعيل IRF3 التي يؤديها رصد تحريض الجينات IRF3 المستهدفة (IFNB1 وIFIT1) و / أو مراسل luciferase الفحص الجيني بالإضافة إلى دقة منخفضة الصوديوم هلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS- PAGE) تحليل IRF3. ومع ذلك، العديد من الدراسات البيوكيميائية، ساهمت تحليل سلوك مختلف المسوخ IRF3 وتوضيح هيكل IRF3 الكريستال 11/06 لإثبات أن IRF3 يخضع لمجموعة معقدة من التعديلات بعد متعدية متتابعة من قبل الفسفرة في مواقع متعددة. ويبدو أن مجموعة من الفسفرة المشاركة في تفعيل IRF3 أن تعتمد على التحفيز وعلى الأرجح على نوع من الخلايا. في الخلايا غير المصابة، IRF3 تتعايش كأنواع غير فسفرته وhypophosphorylated تحتوي على phosphoresidues، بما في ذلك Thr135 وSer173، في 1 -198 أأ-N محطة المنطقة 6،12-14. تراكم هذا و hypophosphorylatedهو فعل مكتب إدارة السجلات من IRF3 بواسطة محرضات الإجهاد، وعوامل النمو وعوامل الإضرار DNA 6. الفسفرة من بقايا سر / منتدى المجالس الرومانسية في المنطقة C من محطة IRF3 تحتوي على المجال transactivation يتم تشغيل يتابع تفعيل الفيروسات، بولي I: C أو LPS في نوع الخلية بطريقة تعتمد 15-17. الفسفرة-C النهائي للIRF3 تشمل ما لا يقل عن 7 مواقع phosphoacceptor متميزة نظمت في مجموعتين رئيسيتين، Ser385 / Ser386 وSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405، التي تساهم كل لتفعيل IRF3 من خلال dimerization، تراكم النووي، بالتعاون مع CREB -binding البروتين (CBP) / coactivators P300، DNA ملزمة لالإنترفيرون عنصر استجابة حساسة (ISRE) تسلسل التوافق وtransactivation من الجينات المستهدفة 9،10،17-19. ويعتقد الفسفرة Thr390 أيضا للمساهمة في يسببها فيروس تفعيل IRF3 20. تحليل الطيف الكتلي من IRF3 أثبتت أن Ser386، Thr390، Ser396 وSer402 البقايا مباشرة phosphorylatإد من قبل المانع من كيلوبايت كيناز ε (IKKε) / ملزم TANK كيناز 1 (TBK1) تحركات 9،10. مطلوب أيضا الفسفرة في بقايا-C محطة لإنهاء تفعيل IRF3 من خلال polyubiquitination وبوساطة proteasome وتدهور 10. هذه العملية هي أيضا تعتمد على الفسفرة في Ser339، وهو أمر ضروري لتوظيف مزامرة بروبيل PIN1 10،11. وتعتبر الأنواع IRF3 التي تحتوي على ما لا يقل عن الفوسفات-Ser339 / 386/396 بقايا أشكال hyperphosphorylated. يبقى التسلسل الدقيق ووظيفة كل موقع مسألة مناقشة 10،21. فمن الواضح الآن أن IRF3 تنشيط لا يمثل دولة متجانسة، إلا أن الأنواع المختلفة تنشيط اظهار الفسفرة أو dimerization خصائص متميزة موجودة 10،22.لتوفير فهم كامل لتفعيل IRF3 ردا على مسببات الأمراض المحددة، بالتالي فمن الضروري لصفلاaracterize أي من الأنواع تفعيلها والتي يسببها. تحريض الجينات المستهدفة IRF3، IFNB1 وIFIT1، وقد ثبت أن نقدم موثوق للقراءة من أجل تفعيل IRF3. ومع ذلك، ورصد التعبير عن هذه الجينات لا يميز بين الدول التنشيط مختلفة من IRF3. يعتمد تحليل شامل للدول تفعيل IRF3 في وضع معين على توصيف مفصل للالفسفرة وdimerization ضعها 10. Unphosphorylated (النموذج الأول)، hypophosphorylated (النموذج الثاني) وhyperphosphorylated (أشكال الثالث والرابع) أشكال IRF3 6،18،23 يمكن حلها بنجاح من قبل قلة الحركة في قرار عالية من تحليل SDS-PAGE. الأنواع IRF3 أحادى ومثنوي يمكن تحديد كفاءة من خلال تحليل الأم-PAGE. يتم تحسين هذه المناهج إلى حد كبير عندما تستخدم بالاقتران مع الأجسام المضادة الموجهة ضد phosphospecific متميزة المواقع IRF3 phosphoacceptor.
بروتوكولات موحدة تسمح قرار فقيرالبروتينات التي لا يسمح الفصل الفعال للIRF3 متميزة أشكال فسفرته. هنا، نحن تصف بالتفصيل إجراء لتحقيق أعلى دقة لرصد تحريض متميزة الأنواع IRF3 تنشيط الفيروس باستخدام SDS-PAGE بالإضافة إلى الأم-PAGE في تركيبة مع طخة مناعية باستخدام الكلية وphosphospecific الأجسام المضادة. المجراة التمييز بين مختلف تفعيلها يتم تنفيذ أشكال IRF3 على أساس التحولات حراكها لوحظ على SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، IRF3 مونومر وديمر يمكن تمييزها من قبل الكهربائي غير تغيير طبيعة. الجمع بين هذه التقنيات التكميلية مع اثنين من طخة مناعية يبرهن على أن تكون نهجا بأسعار معقولة وحساسة للحصول على جميع المعلومات اللازمة لإجراء تحليل كامل لتفعيل بوساطة الفسفرة IRF3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم وصف بروتوكول هنا باستخدام خلايا A549 المصابين بفيروس سينداي (SEV). ومع ذلك، فإن بروتوكول لSDS-PAGE وPAGE الأم يعمل أيضا مع جميع أنواع الخلايا الإنسان والفئران تم اختبارها حتى الآن، وخاصة خلايا الدم النخاعي حفز مع مختلف-تفعيل IRF3 9،15،19،24،25 المحفزات.
1. العدوى من خلايا A549
- الحفاظ على خلايا A549 في الثقافة في 15 سم لوحة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 في 20 مل F12K / هام المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل للحرارة المعطل الجنين البقري (مرحبا-FBS) و 1٪ L-الجلوتامين (F12K كاملة / لحم الخنزير المتوسطة).
ملاحظة: يجب على جميع الحلول المستخدمة لزراعة الخلايا والعلاجات تكون عقيمة. - في 24 ساعة فقط قبل الإصابة، نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع 10 مل من الفوسفات المقطر مخزنة المالحة (D-PBS) في RT.
- إضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA حل لكل لوحة لتغطية الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- وقف الحضانة بمجرد عشرالخلايا ه بداية لفصل من لوحة عن طريق النقر بهدوء لوحة بيد واحدة. إبطال نشاط التربسين وذلك بإضافة 10 مل من تسخينه مسبقا كامل F12K / هام المتوسطة في لوحة ونقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- أجهزة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 3 دقائق على RT. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 8 مل من F12K / هام المتوسطة للحصول على تعليق خلية واحدة متجانسة.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 خلايا في 60 ملم لوحة في 4 مل من يسخن قبل كامل F12K / هام المتوسطة. احتضان لمدة 20-24 ساعة عند 37 ° C / 5٪ CO 2. بعد 20-24 ساعة، والخلايا تشكل متموجة أحادي الطبقة 90٪ (وهذا يتوافق مع 1.5 × 10 6 خلايا).
- إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 2 مل من مصل خالية F12K / هام المتوسطة (SFM). إضافة 2 مل من SFM جديدة في 60 ملم لوحة.
- ذوبان الجليد قسامة من فيروس سينداي (SEV) (المخزنة aliquoted -80 ° C) على الجليد ودوامة لفترة وجيزة.
- تمييع عشرفيروس الإلكترونية في الإدارة المستدامة للغابات ما قبل ساخنة للحصول على 60 HAU / 100 ميكرولتر. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا بهدوء وإضافة 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف لكل لوحة لأداء العدوى في 40 HAU / 10 6 خلايا. لا تقم بإضافة الفيروس في لوحة التحكم غير المصابة.
- احتضان الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2. تستنهض الهمم لوحات باليد 3 أو 4 مرات، أو باستخدام شاكر المداري أو هزاز التلقائي وضعها مباشرة في الحاضنة، خلال الساعة الأولى من الإصابة.
- في 2 ساعة بعد الإصابة، إضافة 2 مل من F12K / هام المتوسطة التي تحتوي على 20٪ مرحبا-FBS للحصول على تركيز النهائي من 10٪ مرحبا-FBS.
- احتضان الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية / 5 CO 2٪ إضافيين من 1 و 4 و 7 ساعة للوصول إلى مجموع مرات إصابة 3 و 6 و 9 ساعة، على التوالي. في كل من هذه النقاط الزمنية، انتقل إلى الخطوة 2.1.
2. إعداد كله خلية مقتطفات (WCE)
- إزالة المتوسطة العدوى. حصاد الخلايا عن طريق كشط في 1 ملمن الجليد الباردة D-PBS ونقل تعليق خلية إلى قبل المبردة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 16000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 20 ثانية وصب بعناية كل آثار D-PBS.
ملاحظة: في هذه الخطوة، بيليه الخلية يمكن أن تخضع مباشرة لاستخراج البروتين أو فلاش المجمدة في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف / حمام الإيثانول وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تحلل. - إعداد العازلة تحلل تحتوي على 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA، 10٪ الجلسرين و 1٪ Nonidet P-40 في الماء منزوع الأيونات ([ده 2 O). Extemporarily إضافة البروتيني (1 ميكروغرام / مل leupeptin و 2 ميكروغرام / مل أبروتينين) والفوسفاتيز مثبطات (5 ملم فلوريد الصوديوم، تنشيط 1 ملم orthovanadate الصوديوم، 2 مم البارانتروفنيل الفوسفات و 10 ملم β-سكرولي 7.5 درجة الحموضة).
ملاحظة: تحلل العازلة دون مثبطات يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية. يوصف بروتوكول معين لتفعيل orthovanadate الصوديوم في جدول الكواشف محددة / اجهزة لازيوتالإقليم الشمالي. - resuspend الكرية خلية في 70 ميكرولتر من تحلل العازلة. عادة تركيز المحللة ستكون حوالي 2 ميكروغرام / ميكرولتر.
- احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. فلاش تجميد المحللة التي كتبها حضانة في حمام النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية. ذوبان الجليد في المحللة في RT حتى ذاب تماما ودوامة لمدة 10 ثانية. تكرار تجميد / الذوبان / دورة دوامة 3 مرات.
- بدلا من ذلك، نفذ الخطوة تجميد في الإيثانول / الجاف حمام الثلج لمدة 1 دقيقة.
- الطرد المركزي في 16000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. نقل طاف (المقابلة لWCE) إلى قبل المبردة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة. الحفاظ على WCE على الجليد في جميع الأوقات.
- تحديد البروتينات باستخدام أي إجراء تقدير البروتين متوافق مع تحلل العازلة مثل تستند برادفورد فحص البروتين 26.
3. قرار WCE التي كتبها عالية الدقة SDS-PAGE
- إعداد ثلاث تغيير طبيعة المواد الهلامية الكهربائي.
- للكشف عنأشكال IRF3، صب نوعان من المواد الهلامية ما لا يقل عن 16 سم طول مع هلام فصل يتكون من 7.5٪ الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد (37.5: 1)، 375 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8 (RT)، 0.1٪ سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS )، بيرسلفات 1٪ الأمونيوم و 0.1٪ TEMED في ده 2 O وهلام التراص مكونة من 4٪ الأكريلاميد، 62.5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 (RT)، 0.05٪ SDS، فوق كبريتات الأمونيوم 1٪ و 0.1٪ TEMED في ده 2 O.
الحذر! مادة الأكريلاميد، TEMED وSDS سامة و / أو مهيجة. ارتداء قفازات واقية والتلاعب تحت غطاء الدخان. - للكشف عن البروتينات SEV، صب جل واحدة لا تقل عن 8.5 سم طول مع خصائص مشابهة للهلام هو موضح في 3.1.1، إلا أن جل فصل يحتوي على 12٪ مادة الأكريلاميد.
- للكشف عنأشكال IRF3، صب نوعان من المواد الهلامية ما لا يقل عن 16 سم طول مع هلام فصل يتكون من 7.5٪ الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد (37.5: 1)، 375 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8 (RT)، 0.1٪ سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS )، بيرسلفات 1٪ الأمونيوم و 0.1٪ TEMED في ده 2 O وهلام التراص مكونة من 4٪ الأكريلاميد، 62.5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 (RT)، 0.05٪ SDS، فوق كبريتات الأمونيوم 1٪ و 0.1٪ TEMED في ده 2 O.
- تفسد WCE حصلت عليه في الخطوة 2.6 بإضافة 1: 4 (V / V) العازلة 5X تحميل (125 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 (RT)، و 10٪ SDS، 20٪ (ع / ت) الجلسرين، 0.0005٪ برموفينول الأزرق و 25٪ β المركابتويثانول في ده 2 O) تليها التدفئة في 100 °C لمدة 10 دقيقة. دوران سريع الأنابيب لاسقاط التكثيف الذي يشكل في الحد الأقصى.
الحذر! β المركابتويثانول هي سامة عن طريق الإستنشاق. ارتداء قفازات واقية والتلاعب تحت غطاء الدخان. - تحميل المواد الهلامية في جهاز الهجرة. ملء الغرف العلوية والسفلية مع تشغيل العازلة التي تحتوي على 25 ملي تريس، قاعدة، 0.1٪ SDS و 192 ملي الجلايسين في الماء المقطر (DH 2 O).
- تحميل 14 ميكرولتر من معيار الوزن الجزيئي في بئر واحدة من كل 16 سم جل و7 ميكرولتر من معيار الوزن الجزيئي في بئر واحدة من 8.5 سم هلام. تحميل 30 ميكروغرام من WCE التشويه والتحريف (أعد كما هو موضح في الخطوة 3.2) لكل بئر من اثنين من المواد الهلامية التي أعدت في الخطوة 3.1.1 للكشف عن أشكال IRF3. تحميل 8-10 ميكروغرام من WCE التشويه والتحريف (أعد كما هو موضح في الخطوة 3.2) لكل بئر على هلام أعدت في الخطوة 3.1.2 لتحليل SEV.
- تشغيل المواد الهلامية في 30 أمبير تيار مستمر حتى تصل أمام الهجرة الجزء السفلي من هلام.
ملاحظة: الهجرة عادة يستمر approximately 3 ساعة ل16 سم هلام و 45 دقيقة للحصول على 8.5 سم هلام. - الشروع في نقل على الأغشية النيتروسليلوز (الخطوة 5).
4. تحليل IRF3 Dimerization من قبل الأم-PAGE
ملاحظة: هذه الطريقة تم وصفها في الأصل من قبل مجموعة من الدكتور T. فوجيتا 27.
- إعداد العليا (-) وانخفاض (+) مخازن غرفة الكهربائي. يتكون المخزن المؤقت الغرفة العليا من 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.4 (RT)، 192 ملي الجلايسين و1٪ deoxycholate الصوديوم (DOC) في ده 2 O. المخزن المؤقت النواب يحتوي على 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.4 (RT) و 192 ملي الجلايسين في ده 2 O.
ملاحظة: يمكن تخزين غرفة مخازن الكهربائي العلوية والسفلية في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. ومع ذلك، تأكد من أنها قبل استعد لRT قبل تنفيذ الكهربائي. - صب جل غير تغيير طبيعة-حل ما لا يقل عن 8.5 سم طول تحتوي على 7.5٪ الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد (37.5: 1)، 375 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8 (RT)، 1٪ ذخيرةبيرسلفات nium و 0.1٪ TEMED في ده 2 O.
- قبل تشغيل هلام في 40 مللي أمبير تيار مستمر لمدة 30 دقيقة على الجليد. اضغط على جهاز الجري في الجليد تقريبا إلى مستوى أقل عازلة الكهربائي الغرفة. من المهم أن الجل ليس في الجليد.
- خلال مرحلة ما قبل التشغيل، مزيج أبقى WCE على الجليد مع 2X الأم-PAGE تحميل العازلة 1: 1 (ت / ت) التي تحتوي على 125 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 (RT)، و 30٪ الجلسرين و 0.1٪ برموفينول الأزرق في ده 2 O.
- تحميل 8-10 ميكروغرام WCE (أعد كما هو موضح في الخطوة 4.4) على الفور في نهاية مرحلة ما قبل التشغيل.
- تشغيل هلام في 25 مللي أمبير تيار مستمر على الجليد، كما هو موضح أعلاه لما قبل التشغيل، حتى تصل أمام الهجرة الجزء السفلي من هلام (حوالي 40 دقيقة).
5. تحليل طخة مناعية الأنواع IRF3
- إعداد المخزن المؤقت نقل تحتوي على 25 ملي تريس، قاعدة و 192 ملي الجلايسين في ده 2 O. بردت العازلة نقل في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
- الرطب ثلاث قطع من غشاء النيتروسليلوز قطع إلى حجم أكبر قليلا من المواد الهلامية في مربع من البلاستيك / الزجاج التي تحتوي على المخزن المؤقت النقل. تشير إلى اتجاه الغشاء عن طريق قطع زاوية واحدة. المخزن المؤقت نقل يمكن إعادة استخدامها 3 مرات. تخزين المخزن المؤقت في 4 ° C بين الاستخدامات.
- Uncast المواد الهلامية (SDS-PAGE والأم-PAGE) وقطع زاوية واحدة من كل جل للالتوجه السليم.
- لالأم-PAGE، واحتضان الجل في RT مع الإثارة لطيف لمدة 30 دقيقة على الأقل في المنطقة العازلة SDS-PAGE تشغيل لإزالة DOC قبل ان ينتقل الى المخزن المؤقت النقل.
- احتضان المواد الهلامية (SDS-PAGE والأم-PAGE) في المخزن المؤقت نقل عن 5-10 دقيقة.
- جبل شطيرة نقل في هلام في شريط نقل مع غشاء نحو القطب الموجب (رغوة ورقة وسادة / فلتر / غشاء / هلام / ورقة مرشح / وسادة رغوة). كن حذرا لإزالة جميع الفقاعات في بين طبقات من الساندويتش.
- أداء نقل على النحو الموصى به بذ الشركة المصنعة للجهاز نقل المستخدمة.
ملاحظة: تنفيذ جميع حضانات ويغسل في الخطوات المقبلة على منصة هزاز أو المدارية تهتز. - في نهاية الوقت نقل، واحتضان الأغشية لمدة 15 دقيقة في محلول التثبيت التي تحتوي على حمض الخليك 7٪، 40٪ من الإيثانول و 3٪ الجلسرين في ده 2 O. غسل الأغشية 3X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني (137 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10.2 ملي نا 2 هبو 4 و 1.8 ملي KH 2 PO 4 في DH 2 O).
الحذر! حمض الخليك غير سامة، مهيجة وقابلة للاشتعال. ارتداء قفازات واقية والتلاعب تحت غطاء الدخان.
ملاحظة: الحل تثبيت يمكن إعادة استخدامها عدة مرات. - لغشاء الأم-PAGE الانتقال مباشرة إلى الخطوة 5.11.
- شطف الأغشية SDS-PAGE ثلاثة بسرعة في DH 2 O قبل تفرخ لهم لمدة 1 دقيقة في حل الشقائقية الحمراء التي تحتوي على 6.57 ملي الشقائقية الأحمر وحامض الخليك 1٪ في DDH 2 O.
ملاحظة: الحل الشقائقية الأحمر يمكن أن يكون ص eused عدة مرات. - شطف الأغشية في DH 2 O حتى خلفية بيضاء بما فيه الكفاية لرؤية العصابات البروتين ملطخة باللون الأحمر. لاحظ علامات مع قلم رصاص وقطع غشاء الزائدة حول البروتينات. يزيل اللون الأغشية قبل الحضانة لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني في إطار التحريض.
- احتضان الأغشية لمدة 1 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية في عرقلة الحل (PBS تحتوي على 0.05٪ توين 20 و الحليب الجاف 5٪ الخالي من الدسم () الحليب PBS-T. غسل الأغشية 3X 5 دقائق في PBS-T.
ملاحظة: غسل PBS-T هو اختياري والوحيد المطلوب بدقة عند تطبيق الأجسام المضادة المخفف في تحتوي على 5٪ ألبومين المصل البقري (PBS-T-BSA) (الشكل 1 والجدول 1) في الخطوة التالية PBS-T. - احتضان أربع الأغشية (من SDS-PAGE والأم-PAGE) مع الأجسام المضادة الأولية وفقا لترتيب تسلسلي المفصل في الشكل 1 والجدول 1. نفذ 5X 5 دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني-T.
الشكل 1. تسلسل تحليلات طخة مناعية. ويصف التخطيطي الفردية SDS-PAGE والأم-PAGE المواد الهلامية اللازمة للكشف عن مختلف أشكال فسفرته وأحادى / مثنوي IRF3. يوصف ترتيب معين من الأجسام المضادة تطبيقها على غشاء الناتجة عن كل هلام في إجراء طخة مناعية. لاحظ أن الأجسام المضادة الأكتين وتستخدم الأولى لضمان التحميل على قدم المساواة من العينات قبل تطبيق أي أجسام مضادة محددة أخرى. تسلسل بديل، مع أضداد أكتين تطبق بعد أضداد الفوسفات-IRF3، ويعمل أيضا. ويستخدم تجريد بين المضادة للالأكتين ومعاداة SEV الأجسام المضادة، أو بين مكافحة الفوسفات-IRF3 وأضداد IRF3 بسبب تداخل حجم الإشارات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الأجسام المضادة الأولية | تخفيف | عازلة التخفيف | حضانة | الأجسام المضادة الثانوية | تعليقات |
| المضادة للأكتين | 1/10000 | PBS-T-BSA | 15 دقيقة في RT | مكافحة فأر | استخدام بعد SDS-PAGE antibodyies المخفف يمكن إعادة استخدامها عدة مرات إذا المخزنة في 4 درجات مئوية في وجود 0.02٪ أزيد الصوديوم. |
| مكافحة IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N عند 4 درجات مئوية | المضادة للأرنب | استخدام بعد الأم-PAGE. فمن غير المستحسن إعادة استخدام الأجسام المضادة المخفف |
| مكافحة IRF3-P-Ser396 | 1/10000 | PBS-T-BSA | O / N عند 4 درجات مئوية | استخدام بعد SDS-PAGE. فمن غير المستحسن لإعادة المخفف الأجسام المضادة لمكافحة IRF3-P-396 هو متاح من الإشارات الخلوية أيضا. وقد تم تعريف التخفيف الأمثل ك 1/1000 لهذا الجسم المضاد، ولكن قد تختلف بين الكثير. | |
| مكافحة IRF3-P-Ser398 | 1/10000 | PBS-T-BSA | O / N عند 4 درجات مئوية | المضادة للأرنب | استخدام بعد SDS-PAGE. فمن غير المستحسن إعادة استخدام الأجسام المضادة المخفف |
| المضادة للIRF3 كامل طول | 1/7500 | PBS-T-الحليب | 3 ساعة على RT | المضادة للأرنب | استخدام بعد SDS-PAGE. المضادة للIRF3 كامل طول الأجسام المضادة يمكن أن تستخدم بعد الأم-PAGE، ولكنه أقل حساسية للكشف عن مونومر. الأجسام المضادة المخفف يمكن إعادة استخدامها عدة مرات إذا المخزنة في 4 درجات مئوية في وجود 0.02٪ أزيد الصوديوم. |
| مكافحة IRF3-NES | 0.5 ميكروغرام / مل | PBS-T-الحليب | 3 ساعة على RT | المضادة للأرنب | استخدام بعد الأم-PAGE. antibodyies المخفف يمكن إعادة استخدامها عدة مرات إذا المخزنة في 4 درجات مئوية في وجود 0.02٪ أزيد الصوديوم. |
| المضادة للSEV | 1/14000 | PBS-T-BSA | 3 ساعة على RT | المضادة للأرنب | استخدام بعد SDS-PAGE. antibodyies المخفف يمكن إعادة استخدامها عدة مرات إذا المخزنة في 4 درجات مئوية في وجود 0.02٪ أزيد الصوديوم. |
| ملاحظة: التخفيف وعازلة تستخدم لالأجسام المضادة الثانوية HRP الديناميكي تحتاج إلى أن يكون الأمثل كما انها تختلف من شركة إلى أخرى. | |||||
الجدول 1. مواصفات الأجسام المضادة المستخدمة في إجراء Immunoblotting.
- احتضان الأغشية مع البيروكسيديز الفجل (HRP) -conjugated الأجسام المضادة الثانوية على النحو المفصل في الشكل 1 والجدول 1. غسل الأغشية 5X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني-T، تليها 2X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني لإزالة تماما آثار توين.
- احتضان الأغشية لمدة 1 دقيقة في حجم المعزز التوهج كاشف كافية لتغطية كامل الأغشية. تجف الأغشية باستخدام ورق الترشيح.
- ضع الأغشية في محلل صورة الانارة لتصور العصابات مناعيا.
- بدلا من ذلك، نفذ الكشف عن عصابات مناعيا باستخدام الحساسة أفلام X-راي.
- غسل الأغشية 3X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: في هذه الخطوة الأغشية يمكن أن تبقى جافة. ومع ذلك، إذا كان المطلوب المزيد من تجريد، فمن الأفضل لأداء تجريد قبل التجفيف الغشاء. يمكن أيضا تخزين الأغشية لفترة قصيرة في برنامج تلفزيوني. - لالأغشية التي لا تتطلب تجريد بين الحضانة مع الأجسام المضادة (انظر الشكل 1) الانتقال مباشرة إلى الخطوة5.20.
- عندما تجريد مطلوب بين الأجسام المضادة (انظر الشكل 1)، احتضان الأغشية في مرحلة ما قبل حرارة حل تجريد تحتوي على 2٪ SDS، 62.5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 (RT) و 0.7٪ β المركابتويثانول في ده 2 O في 50 ° C لمدة 20 دقيقة في إطار التحريض منتظم. غسل الأغشية 3X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: الانفعال أثناء إجراء تجريد هو مفتاح الحل. تجريد لا يمكن أن يؤديها في فرن التهجين. بدلا من ذلك، وتجريد يمكن القيام بها باستخدام الأغشية مختومة في أكياس بلاستيكية ومغمورة في حمام مائي. في هذه الحالة، فمن المهم أن تستنهض الهمم الأغشية 4-5 مرات خلال الحضانة. - احتضان الأغشية لمدة 1 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني-T-الحليب.
- كرر الخطوات 5،12-5،16 وفقا لشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 2 صورة طخة مناعية نموذجية من IRF3 الكشف مع IRF3 مجموع الأجسام المضادة والأجسام المضادة IRF3-phosphospecific ضد Ser396 وSer398 بعد قرار من WCE التي كتبها عالية الدقة SDS-PAGE. في الخلايا A549 unstimulated، تم الكشف عن IRF3 كما شريطين في 50 و 53 كيلو دالتون على SDS-PAGE المقابلة لغير فسفرته (النموذج الأول) وhypophosphorylated (النموذج الثاني) نوعا من IRF3. تعرض خلايا A549 لSEV عن 3-9 النتائج ساعة في التحول تعتمد على الوقت لترحيل ببطء أشكال hyperphosphorylated الثالث والرابع، والتي تتميز بشكل جيد من الأشكال الأول والثاني. العصابات hyperphosphorylated تهاجر في 55-57 كيلو دالتون. كما immunodetected الأشكال الثالث والرابع على وجه التحديد باستخدام الأجسام المضادة ضد phosphospecific Ser396 وSer398. ومناعي أكتين بمثابة تحكم التحميل المساواة بين الممرات. ويرد السيطرة على العدوى SEV من تراكم قفيصة منواة فيروس صrotein (N)، الذي يهاجر في 60 كيلو دالتون.
في الشكل (3)، وصورة من كشف IRF3 الحصول عليها من WCE حلها عن طريق الأم-PAGE تليها طخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة IRF3-متنوعه والأجسام المضادة phosphospecific ضد Ser386 هو مبين. في الخلايا A549 unstimulated، تم الكشف عن IRF3 بمثابة فرقة واحدة المقابلة لشكل أحادى. على العدوى مع SEV عن 3-9 ساعة، مستويات انخفاض مونومر IRF3 مع تراكم يصاحب ذلك من عصابة المهاجرة ببطء الذي يتوافق مع شكل مثنوي من IRF3. الأجسام المضادة ضد phosphospecific Ser386 فقط الكشف عن الأنواع IRF3 ديمر.
الشكل 2. الكشف عن IRF3 مميز الأنواع فسفرته (النموذج I-IV) المستحثة بواسطة العدوى SEV في خلايا A549. تركت خلايا A549 غير مصاب أو مصابة SEV لإنديكامرات تيد. وقد تم تحليل WCE التي كتبها عالية الدقة SDS-PAGE تليها طخة مناعية (IB) باستخدام مكافحة IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) ومضادة للIRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) الأجسام المضادة phosphospecific ومكافحة -IRF3 كاملة بروتين أجسام طول. تم رصد العدوى باستخدام أضداد SEV (يظهر قفيصة منواة N البروتين). تم استخدام الأجسام المضادة الأكتين كعنصر تحكم التحميل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. رصد مفسفر / dimerized التعريفي IRF3 بواسطة SEV في خلايا A549. تركت خلايا A549 غير مصاب أو مصابة SEV عن الأوقات المحددة. تم حل WCE من قبل الأم-PAGE والتي كشفت عنها طخة مناعية باستخدام مكافحة IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) الأجسام المضادة phosphospecific ومكافحة IRF3-NES antibodies. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول وصفنا هنا يتكون من مزيج من عالية الدقة SDS-PAGE والأم-PAGE بالإضافة إلى استخدام العديد من الأجسام المضادة phosphospecific لتمييز أحادى / مثنوي وphosphoforms I-IV من IRF3. كشف المناسب من هذه الأنواع IRF3 ضروري لتوصيف كامل تفعيل IRF3 في وضع معين. على سبيل المثال، LPS تحفيز الضامة تفعيلها يؤدي إلى تشكيل مثنوي، Ser396 / 398 IRF3 مفسفر الذي يظهر hypophosphorylated (النموذج الثاني)، ولكن ليس hyperphosphorylated (النموذج الثالث والرابع)، ونمط في SDS-PAGE 15. باستخدام بروتوكول وصفها، هذا الملف يمكن تمييزها عن يسببها فيروس أشكال hyperphosphorylated التي تتطلب الفسفرة Ser339 إضافية بالإضافة إلى Ser386 وSer396 الفسفرة 10. الأهم من ذلك، وهذا يسمح أيضا تمييزا بين Ser396 الأنواع فسفرته التي لا تظهر dimerization، ولكنها نشطة transcriptionally 10. ايمportantly، لا بد من الإشارة إلى أن نمط النموذج I-IV من phosphoforms IRF3 تطبيقها على IRF3 البشري. الفئران IRF3 لا يحمل نمطا مماثلا، وبالتالي يتميز تفعيل IRF3 فقط عن طريق استخدام الأجسام المضادة phosphospecific في طخة مناعية بعد SDS-PAGE والأم-PAGE.
تحقيق قرار فصل عال من الأنواع فسفرته متميزة من IRF3 بواسطة SDS-PAGE يتطلب معايير محددة. لقرار مناسب، من المهم جدا استخدام المواد الهلامية التي لديها الحد الأدنى من طول 16 سم. حتى مع هذا الطول من هلام الفصل، فإنه من المهم السماح للجبهة الهجرة تصل إلى الجزء السفلي من هلام للحصول على فصل ملائم للأشكال IRF3 مختلفة. أيضا، يجب أن جل التراص تمتد إلى ما لا يقل عن 1 سم تحت مشط للحصول على نطاقات محددة جيدا. وهذا أمر مهم، حيث أن أشكال hyperphosphorylated من IRF3 تهاجر قريبة جدا من بعضها البعض. سيئة العصابات مركزة سوف يؤدي إلى عدم التمييز بين phosphorylaتيد يشكل عرقلة تقدير كل منهما. بالإضافة إلى ذلك، فإن تركيز فوق كبريتات الأمونيوم وTEMED تختلف من واحدة بروتوكول SDS-PAGE إلى آخر. تم العثور على الاختلاف في هذه التركيزات من تلك المشار إليها هنا لتضعف بشكل كبير هذا القرار في الفصل بين الأنواع IRF3.
وقد وصفت الكشف عن تشكيل IRF3 ديمر عن طريق PAGE الأم في الأصل من قبل مجموعة من الدكتور T. فوجيتا. يستخدم هذا البروتوكول العازلة التي تحتوي على DOC التي تسمح للتفكك وديمر IRF3 من CBP / P300 27. ينصح بشدة للمضي قدما إلى الأم-PAGE مباشرة بعد تحلل الخلية كمخزن للWCE في -80 ° C وجد أن يؤدي إلى تغيير كبير في نسبة IRF3 مونومر / ديمر. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم جدا أن الرقم الهيدروجيني للمخازن الغرفة العلوية والسفلية وتعديلها لدرجة الحموضة 8.4 في RT، وليس في 4 درجات مئوية، بعد خلط كل المكونات لتحقيق الفصل السليم للمونومر مقابل ديمر. A الانفصالهلام مع الحد الأدنى للطول 8.5 سم يسمح فصل ملائم للمونومر IRF3 وديمر. حجم مثالي لعينة زائد العازلة تحميل حوالي 8 ميكرولتر ل5 مم وكذلك القرار هو أفضل عندما يتم الاحتفاظ حجم إلى أدنى حد ممكن. وبالتالي، فمن المهم استخدام أدنى حجم العازلة تحلل للحصول على WCE مع تركيز عال. ومع ذلك، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار أن يتطلب استخراج البروتين كفاءة تحلل في ما لا يقل عن 5X حجم بيليه الخلية. إذا كان حجم العينات يتجاوز الحد المشار إليه أعلاه، فإن هذا يؤدي إلى قرار الفقراء من مونومر / ديمر. هذا يمكن حلها عن طريق إضافة مادة هلامية تحتوي على التراص 4٪ الأكريلاميد، 62.5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 (RT)، فوق كبريتات الأمونيوم 1٪ و 0.1٪ TEMED في ده 2 O. من المهم جدا لتحميل عينات من دون إزعاج النطاقات. تحميل ببطء مع طرف على مقربة هلام التحميل إلى قاع البئر يعطي نتائج جيدة جدا.
هنا، نحن تصف في الجسم الحي DETEction من الفسفرة في بقايا محددة باستخدام الأجسام المضادة phosphospecific المتاحة حاليا ضد Ser386 9، Ser396 19 و 15 Ser398. استخدام المسوخ IRF3 ومطياف الكتلة تحليلات وأكدت أن هذه البقايا هي فسفرته على عدوى فيروس أو overexpression من IKKε تحركات / TBK1 وحاسمة لتفعيل IRF3 6،9،10،19،21. ومناعي من الفوسفات-Ser396، الفوسفات، Ser398 ومجموع IRF3 بعد SDS-PAGE يتطلب استخدام اثنين من المواد الهلامية متطابقة (الشكل 1). في الواقع، لوحظ خسارة كبيرة من الحساسية عندما تستخدم الأجسام المضادة phosphospecific بعد تعرية الغشاء. ولذلك، فإنه ينصح بشدة لاستخدام الأجسام المضادة phosphospecific أولا. لاحظ أن الأجسام المضادة الأولية والثانوية بديلة قد تعمل أيضا، ولكن ينبغي أن يكون الأمثل التخفيفات وتسلسل استخدام محددة. لتحليل IRF3، 30 ميكروغرام من WCE المناسب للحصول على كشف كبير من IRF3الفسفرة التي كتبها طخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة أشار عند استخدام 4 مم الآبار العرض. وعلى الرغم من العثور على 30 ميكروغرام في العديد من أنواع الخلايا المصابة مع مختلف الفيروسات ليكون مناسبا، قد تحتاج هذا المبلغ إلى زيادة اعتمادا على نوع من الخلايا والتحفيز. فمن الأفضل لاستخدام مقتطفات جديدة لSDS-PAGE، ولكن الكشف عن IRF3 الفسفرة باستخدام الأجسام المضادة phosphospecific وصفها في هذه الورقة هو مستقر بما يكفي للسماح جولة من تخزين WCE في -80 درجة مئوية قبل التحليل. تم العثور على تركيزات من مثبطات إنزيم الفوسفاتيز هو موضح هنا أن تكون كافية عند استخدام الخلايا A549. لم يتم العثور على تركيزات أعلى لتحقيق نتائج أفضل. ومع ذلك، قد تحتاج هذه التركيزات إلى زيادة عند دراسة تفعيل IRF3 في أنواع الخلايا التي تظهر أعلى مستويات النشاط الفوسفاتيز. الأهم من ذلك، فسفرة IRF3 والآليات الكامنة لا تزال بعيدة عن أن يكون مفهوما. ولذلك، فإن لوحة كاملة من السير / Thr- وصور-الفوسفاتيز فييتم استخدام مثبطات لمنع أنشطة حتى الآن uncharacterized المحتملة التي يمكن أن تؤثر على الكشف عن IRF3 الفسفرة، dimerization والتدهور. للكشف عن مونومر IRF3 وديمر بعد معظم إصابات فيروس وفي معظم أنواع الخلايا، 8 - تم العثور على 10 ميكروغرام WCE أن تكون كافية. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة كمية أكبر من البروتينات لتنشيط وتفعيل IRF3 أقل كفاءة. ينصح الأجسام المضادة ضد phosphospecific Ser386 المستخدمة في هذه الدراسة لاستخدامها في مسقط-PAGE مثل حساسية في تغيير طبيعة SDS-PAGE ضعيف جدا. وعلاوة على ذلك، يقترح الفسفرة في Ser386 لربط مع النموذج مثنوي من IRF3 9، مما يجعل استخدام هذه الأجسام المضادة في الأم-PAGE استراتيجية مناسبة لتأكيد هذا المفهوم في وضع معين. من المذكرة، هي الأجسام المضادة البديلة المتاحة من مختلف الشركات وادعى لكشف بكفاءة الفوسفات-Ser386 بعد SDS-PAGE. كانت الأجسام المضادة ضد Phosphospecific Ser396 أيضا بكفاءة شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي للكشف عن IRF3 الفسفرة بعد الأم-PAGE 20. الأهم من ذلك، وجد Ser402 في الكتلة-C محطة المواقع phosphoacceptor أيضا أن من المهم لتفعيل IRF3 والفسفرة من Ser402 لوحظ من خلال تحليل الطيف الكتلي من IKKε /-فسفرته TBK1 IRF3 10،21،28. ومع ذلك، على الرغم من محاولتي مختلفة (NG، غير منشورة)، متاحة حاليا لمتابعة الفسفرة من هذه المخلفات محددة في الجسم الحي لا الأجسام المضادة phosphospecific. ملاحظة كما تم وصفها أن الأجسام المضادة ضد phosphospecific Thr157 وSer339 11،13. ويمكن استخدام هذه الأجسام المضادة phosphospecific إضافية في إجراء عالية الدقة SDS-PAGE مماثلة لتلك التي وصفها هنا. في هذه الحالة، قد تكون هناك حاجة كبيرة الهلام إضافية SDS-PAGE لكل الأجسام المضادة ومعالجتها بنفس الطريقة هلام # 2 (الشكل 1). على حد علمنا لم يتم حتى الآن لم يصف أي أجسام مضادة ضد phosphospecific Ser173 أو Thr390،ولكن يمكن بسهولة إضافة إلى بروتوكول الموصوفة هنا مرة واحدة عندما تصبح متاحة 14،20.
يتم إنهاء النشاط IRF3 بتدهور بوساطة proteasome وأشكال hyperphosphorylated 11،17. بروتوكول الموصوفة هنا أيضا يسمح للرصد تدهور IRF3 عند فترات طويلة والحركية من التحفيز ويقترن إلى استخدام مثبطات proteasome و(MG132، lactacystin أو bortezomid). عادة، في الخلايا A549 المصابين SEV في 40 HAU / 10 6 خلايا، تبدأ IRF3 الفسفرة حالما يبدأ 2 ساعة بعد SEV العدوى وIRF3 تدهور بعد 12 ساعة. وسوف تختتم تدهور بوساطة proteasome ومن انتقاص لوحظ من أشكال الثالث والرابع في مستويات نقاط أواخر الوقت الذي يتم عكسها في الظروف مع مثبطات proteasome و. وهذا يترجم أيضا على الأم-PAGE في تضاؤل مستويات ديمر IRF3 أن يتم استردادها على العلاج proteasome والمانع (29). الأهم من ذلك، عالية الدقة TECHNIعرض كيو هنا يسمح التفريق بين عملية تدهور ونقص في التنشيط. في الواقع، كل من التدهور وعدم تفعيل نتيجة IRF3 في غياب الكشف عن ديمر / الفوسفات-Ser386 / 396. ومع ذلك، ويرتبط نقص التنشيط مع الكشف عن IRF3 مونومر وأشكال الأول والثاني، في حين لم يتم الكشف عن هذه الأنواع IRF3 عندما تتحلل IRF3 30.
مناعي جانب التحليل القائم على قياس الطيف الكتلي هو الأسلوب المفضل للكشف عن الفسفرة في الجسم الحي من IRF3 في مواقع متميزة. وقد استخدمت هذه التقنية لتأكيد الفسفرة IRF3 في Ser173، Ser175، Ser386، Thr390، Ser396 وSer402 مخلفات 10،20،21. ومع ذلك، مطياف الكتلة ليست حتى الآن بأسعار معقولة / تقنية benchside التي يمكن استخدامها بسهولة لأغراض التحليل اليومي لتفعيل IRF3 بعد عدة التحفيز عند نقاط زمنية مختلفة. لذلك، ووصف الإجراء هنا باستخدام SDS-PAGE بالإضافة إلى أصلي PAGE بالاشتراك مع طخة مناعية باستخدام الكلية وphosphospecific الأجسام المضادة يشكل نهجا عمليا، وبأسعار معقولة وحساسة للكشف جميع أشكال المعرفة حاليا من actived IRF3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
- Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
