Introduction
Den allestedsnærværende og konstitutivt udtrykte transkriptionsfaktor Interferon (IFN) Regulatory Faktor 3 (IRF3) er kritisk for den første linje i forsvaret mod patogener primært gennem induktion af IFNp, men også gennem induktion af chemokinet (CC motiv) ligand 5 (CCL5 ) og flere antivirale proteiner, herunder IFN-induceret protein med tetratricopeptide gentager IFIT1 / 2/3 1-3. IRF3 aktivering, er blevet rapporteret efter infektion med mange vira, eller udsættelse for polyinosin-polycytidylsyre acid (poly I: C) eller lipopolysaccharid (LPS) 4.. Vigtigere er det, har mest undersøgte vira udviklet mekanismer til at omgå IRF3-medieret reaktion, og dermed undslippe værtens medfødte immunforsvar 5. Således overvågning IRF3 aktivering er af stor betydning for at forstå de molekylære mekanismer i det medfødte antivirale værtsforsvar, men også at identificere strategi, der anvendes af virus til at modvirke dette svar.
ent "> Mange offentliggjorte rapporter dog kun en begrænset analyse af IRF3 aktivering udføres ved overvågning af IRF3-målgen induktion (IFNB1 og IFIT1) og / eller luciferase reportergenanalysen koblet til lav opløsning natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS- PAGE) analyse af IRF3. dog de mange biokemiske undersøgelser, analyse af adfærden i forskellige IRF3 mutanter og belysning af IRF3 krystalstruktur 6-11 har bidraget til at fastslå, IRF3 underkastes et komplekst sæt af sekventielle posttranslationelle modifikationer ved phosphorylering på flere steder. Sættet af phosphorylering involveret i IRF3 aktivering synes at være afhængig af stimulus og sandsynligvis af celletypen. Hos ikke-inficerede celler, IRF3 sameksisterer som ikke-phosphorylerede og hypophosphorylerede arter indeholdende phosphoresidues, herunder Thr135 og Ser173, i 1 -198 aa N-terminale region 6,12-14. Akkumulering af denne hypophosphoryleret form af IRF3 induceres af stress induktorer, vækstfaktorer og DNA-beskadigende midler 6. Phosphorylering af Ser / Thr-rester ved C-terminale region af IRF3 indeholdende transaktiveringsdomænet udløses efter aktivering af virus, poly I: C eller LPS i en celletype afhængig måde 15-17. C-terminale phosphorylering af IRF3 involverer ikke mindre end 7 forskellige phosphoacceptor sites organiseret i to klynger, Ser385 / Ser386 og Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, at hver bidrager til IRF3 aktivering via dimerisering, nuklear ophobning, associering med CREB -bindende protein (CBP) / P300 coaktivatorer, DNA-binding til IFN følsom respons element (ISRE) konsensus sekvenser og transaktivering af målgener 9,10,17-19. Phosphorylering af Thr390 menes også at bidrage til virus-induceret IRF3 aktivering 20. Massespektrometri analyser af IRF3 har vist, at Ser386, Thr390, Ser396 og Ser402 resterne direkte phosphorylated af inhibitor af KB-kinase ε (IKKε) / TANK-bindende kinase 1 (TBK1) kinaser 9,10. Phosphorylering på C-terminale rester er også nødvendig for terminering af IRF3 aktivering via polyubiquitination og proteasom-medieret nedbrydning 10. Denne proces er også afhængig af phosphorylering ved Ser339, som er nødvendig for rekruttering af propyl- isomerase Ben1 10,11. IRF3 arter indeholder mindst phospho-Ser339 / 386/396 rester anses hyperphosphorylerede former. Den nøjagtige sekvens og funktion af hvert websted er fortsat et spørgsmål om diskussion 10,21. Det er nu klart, at aktiveret IRF3 ikke repræsenterer en homogen stat, men at forskellige aktiverede arter udviser distinkte phosphorylerings- eller dimerisering egenskaber eksisterer 10,22.At give en fuldstændig forståelse af IRF3 aktivering som reaktion på specifikke patogener, er det således nødvendigt at characterize hvilke af de aktiverede arter induceres. Induktion af IRF3 målgener, IFNB1 og IFIT1, har vist sig at tilvejebringe en pålidelig udlæsning for IRF3 aktivering. Men overvågning udtryk for disse gener skelner ikke mellem de forskellige aktivering stater i IRF3. En omfattende analyse af IRF3 aktivering stater i en bestemt indstilling er afhængig af den detaljerede karakterisering af dets phosphorylering og dimerisering status 10. Uphosphoryleret (formular I) hypophosphorylerede (formular II) og hyperphosphorylerede (formularer III og IV) IRF3 formularer 6,18,23 held kan løses ved nedsat mobilitet i høj opløsning SDS-PAGE-analyse. Monomere og dimere IRF3 art kan effektivt identificeres ved nativ-PAGE-analyse. Disse fremgangsmåder er i høj grad forbedret, når de anvendes i kombination med phosphospecifikke antistoffer rettet mod forskellige IRF3 phosphoacceptor sites.
Standardprotokoller tillade en dårlig opløsning afproteiner, der ikke tillader effektiv adskillelse af særskilte IRF3 phosphorylerede former. Her beskriver vi i detaljer en fremgangsmåde til at opnå den højeste opløsning for at overvåge induktionen af forskellige virus-aktiveret IRF3 art efter SDS-PAGE koblet til nativ PAGE i kombination med immunoblot under anvendelse af samlede og phosphospecifikt antistoffer. In vivo diskrimination af de forskellige aktiverede former for IRF3 udføres på grundlag af deres mobilitetsforskydninger observeret på SDS-PAGE. Derudover kan IRF3 monomer og dimer skelnes ved ikke-denaturerende elektroforese. Kombinationen af disse to komplementære teknikker med immunoblot viser sig at være en overkommelig og følsom metode til at erhverve alle de nødvendige oplysninger for en komplet analyse af phosphorylering-medieret aktivering af IRF3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Protokollen er beskrevet her ved hjælp af A549-celler inficeret med Sendai-virus (SeV). Men protokollen for SDS-PAGE og indfødte SIDE arbejder også med alle menneskelige og murine celletyper testet hidtil, især myeloide celler stimuleret med forskellige IRF3-aktiverende stimuli 9,15,19,24,25.
1. Infektion af A549-celler
- Opretholde A549-celler i kultur i en 15 cm plade ved 37 ° C / 5% CO2 i 20 ml F12K / Ham medium indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (HI-FBS) og 1% L-glutamin (komplet F12K / Ham medium).
BEMÆRK: Alle de løsninger, der anvendes til celledyrkning og behandlinger skal være sterile. - Ved 24 timer før infektionen, opsug medium og vask cellerne med 10 ml destilleret phosphatbufret saltvand (D-PBS) ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 1 ml 0,25% trypsin-EDTA-opløsning til hver plade til at dække cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter.
- Stop inkubationen så snart the cellerne begynder at løsne sig fra pladen ved at trykke forsigtigt pladen med den ene hånd. Inaktivere trypsin ved tilsætning af 10 ml forvarmet komplet F12K / Ham medium pr plade og overføre cellerne til et 15 ml konisk rør.
- Centrifuger ved 350 x g i 3 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 8 ml komplet F12K / Ham medium til opnåelse af en homogen enkelt cellesuspension.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer. Frø cellerne ved en densitet på 1 x 10 6 celler pr 60 mm plade i 4 ml forvarmet komplet F12K / Ham medium. Der inkuberes i 20 - 24 timer ved 37 ° C / 5% CO 2. Efter 20 - 24 timer, cellerne danner en 90% konfluent monolag (dette svarer til 1,5 x 10 6 celler).
- Fjern mediet og vask cellerne med 2 ml serum-frit F12K / Ham medium (SFM). Tilsæt 2 ml frisk SFM pr 60 mm plade.
- Tø en portion af Sendai-virus (SeV) (opbevaret i alikvoter ved -80 ° C) på is og vortex kortvarigt.
- Fortynd the virus i forvarmet SFM at opnå 60 HAU / 100 pi. Bland ved at pipettere op og ned blødt og tilsættes 100 pi fortyndet virus pr plade til at udføre infektion på 40 HAU / 10 6 celler. Tilsæt ikke virus i den ikke-inficerede kontrol plade.
- Inkubér cellerne i inkubatoren ved 37 ° C / 5% CO2. Omrør pladerne manuelt 3 eller 4 gange, eller ved hjælp af en automatisk orbital eller rokkende shaker placeres direkte i inkubatoren, i den første time for infektion.
- Ved 2 timer efter infektion, tilsættes 2 ml F12K / Ham medium indeholdende 20% HI-FBS for at opnå en slutkoncentration på 10% HI-FBS.
- Inkubér cellerne i inkubatoren ved 37 ° C / 5% CO2 i yderligere 1, 4 og 7 timer at nå de samlede infektion gange på 3, 6 og 9 timer, henholdsvis. På hvert af disse tidspunkter, skal du fortsætte til trin 2.1.
2. Fremstilling af helcelleekstrakter (WCE)
- Fjerne infektionen medium. Cellerne høstes ved skrabning i 1 mliskold D-PBS og overføre cellesuspensionen til en forud kølet 1,5 ml centrifugerør.
- Pelletere cellerne ved centrifugering ved 16.000 xg ved 4 ° C i 20 sekunder og dekanteres forsigtigt alle spor af D-PBS.
BEMÆRK: I dette trin, kan cellepelleten direkte underkastes protein udvinding eller lynfrosset i flydende nitrogen eller tøris / ethanol-bad og opbevaret ved -80 ° C indtil lysis. - Forbered lysis buffer indeholdende 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% glycerol og 1% Nonidet P-40 i deioniseret vand (Hedeselskabet 2 O). Extemporarily tilføje protease (1 ug / ml leupeptin og 2 ug / ml aprotinin) og phosphataseinhibitorer (5 mM natriumfluorid, 1 mM aktiveret natriumorthovanadat, 2 mM p-nitrophenylphosphat og 10 mM β-glycerophosphat pH 7,5).
BEMÆRK: Lysispufferen uden inhibitorer kan opbevares ved 4 ° C. En specifik protokol for aktivering af natriumorthovanadat er beskrevet i Tabel over specifikke reagenser / Equipment. - Resuspender cellepelleten i 70 pi lysisbuffer. Typisk koncentration lysatet vil være omkring 2 pg / pl.
- Der inkuberes på is i 20 minutter. Flash-fryse lysatet ved inkubering i et flydende nitrogen-bad i 15 sek. Optø lysatet ved stuetemperatur indtil den er helt smeltet og vortex i 10 sek. Gentag fryse / tø / vortex cyklus 3 gange.
- Alternativt udføre frysetrinnet i en ethanol / tøris-bad i 1 min.
- Der centrifugeres ved 16.000 xg ved 4 ° C i 20 minutter. Overfør supernatanten (svarende til WCE) til en ny pre-kølet 1,5 ml centrifugerør. Hold WCE på is på alle tidspunkter.
- Kvantificere proteiner ved anvendelse af en hvilken som helst protein kvantificering procedure forenelig med lysis buffer, såsom Bradford-baserede proteinanalyse 26.
3. Beslutning af Vest af High Resolution SDS-PAGE
- Forbered tre denaturerende elektroforesegeler.
- Til påvisning afIRF3 former, hæld to geler på minimum 16 cm længde med en adskillelse gel sammensat af 7,5% acrylamid / bis-acrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCI pH 8,8 (RT), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% ammoniumpersulfat og 0,1% TEMED i Hedeselskabet 2 O og en stacking gel bestående af 4% acrylamid, 62,5 mM Tris-HCI pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% ammoniumpersulfat og 0,1% TEMED i ddH 2 O.
Forsigtighed! Acrylamid, TEMED og SDS er giftige og / eller irriterende. Bær beskyttelseshandsker og manipulere under en emhætte. - Til påvisning af SeV proteiner, hæld en gel på mindst 8,5 cm længde med egenskaber svarende til gelen beskrevet i 3.1.1, bortset fra, at adskillelsen gel indeholder 12% acrylamid.
- Til påvisning afIRF3 former, hæld to geler på minimum 16 cm længde med en adskillelse gel sammensat af 7,5% acrylamid / bis-acrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCI pH 8,8 (RT), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% ammoniumpersulfat og 0,1% TEMED i Hedeselskabet 2 O og en stacking gel bestående af 4% acrylamid, 62,5 mM Tris-HCI pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% ammoniumpersulfat og 0,1% TEMED i ddH 2 O.
- Denaturere WCE opnået i trin 2.6 ved tilsætning af 1: 4 (v / v) 5x loading buffer (125 mM Tris-HCI pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p / v) glycerol, 0,0005% bromphenolblåt og 25% β-mercaptoethanol i Hedeselskabet 2 O) efterfulgt af opvarmning ved 100 °C i 10 minutter. Hurtig tur rørene at nedbringe kondens, der danner i hætten.
Forsigtighed! β-mercaptoethanol er giftig ved indånding. Bær beskyttelseshandsker og manipulere under en emhætte. - Monter geler i apparatet migration. Fyld de øvre og nedre kamre med rindende puffer indeholdende 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS og 192 mM glycin i destilleret vand (dH 2 O).
- Belastning 14 ul molekylvægt standard i en brønd af hver 16 cm gel og 7 pi molekylvægt standard i en brønd af 8,5 cm gel. Load 30 ug denatureret Vest (fremstillet som beskrevet i trin 3.2) per brønd af de to geler fremstillet i trin 3.1.1 for IRF3 former detektion. Load 8 - 10 ug denatureret Vest (fremstillet som beskrevet i trin 3.2) per brønd på gelen fremstillet i trin 3.1.2 for SeV analyse.
- Kør gelerne ved 30 mA konstant strøm, indtil migration foran når bunden af gelen.
BEMÆRK: Migration varer typisk opstillet cately 3 timer for en 16 cm gel og 45 min for en 8,5 cm gel. - Fortsæt til overførsel på nitrocellulosemembraner (trin 5).
4. Analyse af IRF3 Dimerisering ved Native-PAGE
BEMÆRK: Denne metode blev oprindeligt beskrevet af gruppen af Dr. T. Fujita 27.
- Forbered øvre (-) og nedre (+) kammer elektroforese buffere. Det øvre kammer puffer består af 25 mM Tris-HCI pH 8,4 (RT), 192 mM glycin og 1% natriumdeoxycholat (DOC) i Hedeselskabet 2 O. Det nedre kammer buffer indeholder 25 mM Tris-HCI pH 8,4 (RT) og 192 mM glycin i Hedeselskabet 2 O.
BEMÆRK: De øvre og nedre kammer elektroforese buffere kan opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse. Men sørg for, at de er præ-opvarmet til stuetemperatur, før du udfører elektroforese. - Hæld en ikke-denaturerende adskillelsesgelen på mindst 8,5 cm længde indeholdende 7,5% acrylamid / bis-acrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCI pH 8,8 (RT), 1% ammonium persulfat og 0,1% TEMED i Hedeselskabet 2 O.
- Pre-run gelen ved 40 mA konstant strøm i 30 minutter på is. Tryk på kørende apparat i isen omtrent til niveauet for det nedre kammer elektroforese buffer. Det er vigtigt, at gelen ikke er i isen.
- Under pre-run, bland WCE holdt på is med 2x nativ PAGE loading puffer 1: 1 (v / v) indeholdende 125 mM Tris-HCI pH 6,8 (RT), 30% glycerol og 0,1% bromphenolblåt i Hedeselskabet 2 O.
- Load 8 - 10 ug WCE (fremstillet som beskrevet i trin 4.4) umiddelbart ved enden af præ-run.
- Kør gel ved 25 mA konstant strøm på is, som beskrevet ovenfor for pre-run, indtil migrationen foran når bunden af gelen (ca. 40 min).
5. Immunblotanalyse af IRF3 sort
- Forbered overførslen buffer indeholdende 25 mM Tris-base og 192 mM glycin i Hedeselskabet 2 O. Køleskab overførselsbufferen ved 4 ° C før brug.
- Wet tre stykker af nitrocellulosemembran skåret til en størrelse lidt større end gelerne i en plast / glas boks indeholdende overførselsbufferen. Angiver orienteringen af membranen ved at skære et hjørne. Overførselsbufferen kan genbruges 3 gange. Opbevar buffer ved 4 ° C mellem anvendelser.
- Afforskallet gelerne (SDS-PAGE og nativ-PAGE) og skæres et hjørne af hver gel for korrekt orientering.
- For nativ-PAGE, inkuberes gelen ved stuetemperatur med forsigtig omrøring i mindst 30 minutter i SDS-PAGE løbebufferen at fjerne DOC før overførsel til overførselsbufferen.
- Inkubér geler (SDS-PAGE og nativ-PAGE) i overførselsbufferen for 5 - 10 min.
- Monter en overførsel sandwich pr gel i en overførsel kassette med membranen mod den positive elektrode (skum pad / filterpapir / membran / gel / filter papir / skumpude). Vær omhyggelig med at fjerne alle boblerne i mellem lagene af sandwich.
- Udfør overførslen som anbefalet by producenten for overførsel anvendte apparatur.
BEMÆRK: Udfør alle inkubationer og vaske i de næste skridt på en vuggende eller orbital rystebord. - Ved udgangen af overførselstid, inkuberes membranerne i 15 minutter i fikseringsopløsning indeholdende 7% eddikesyre, 40% ethanol og 3% glycerol i Hedeselskabet 2 O. Vask membranerne 3x 5 min i PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10,2 mM Na 2 HPO 4 og 1,8 mM KH 2 PO 4 i dH2O).
Forsigtighed! Eddikesyre er giftigt, irriterende og brandfarligt. Bær beskyttelseshandsker og manipulere under stinkskabet.
BEMÆRK: fikseringsopløsning kan genbruges flere gange. - For den indfødte-PAGE membran fortsætte direkte til trin 5.11.
- Skyl de tre SDS-PAGE membraner hurtigt i dH2O før inkubere dem i 1 min i rød ponceau opløsning indeholdende 6,57 mM rød Ponceau og 1% eddikesyre i Hedeselskabet 2 O.
BEMÆRK: Den røde Ponceau løsning kan være r eused flere gange. - Skyl membranerne i dH2O, indtil baggrunden er hvid nok til at se proteinbånd farvet rødt. Bemærk markeringerne med en blyant og skære det overskydende membran omkring proteiner. Affarvning membranerne ved inkubering i 5 minutter i PBS under omrøring.
- Inkuber membranerne i 1 time ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C i blokerende opløsning (PBS indeholdende 0,05% Tween 20 og 5% fedtfri tørmælk (PBS-T-mælk). Vask membranerne 3x 5 minutter i PBS-T.
BEMÆRK: PBS-T vask er valgfri og kun strengt nødvendigt, når de anvender antistoffer fortyndet i PBS-T indeholdende 5% bovint serumalbumin (PBS-T-BSA) (figur 1 og tabel 1) i det næste trin. - Inkuber de fire membraner (fra SDS-PAGE og nativ-PAGE) med de primære antistoffer ifølge den sekventielle rækkefølge vist detaljeret i figur 1 og tabel 1. Udfør 5x 5 minutters vaske i PBS-T.
Figur 1. Sekvens af immunoblot analyser. Den skematiske beskrives de enkelte SDS-PAGE og nativ PAGE-geler, der er nødvendige for at detektere de forskellige IRF3 phosphorylerede og monomere / dimere former. Den specifikke rækkefølge af antistoffer anvendes til membranen som følge af hver gel i immunoblot procedure er beskrevet. Bemærk, at anti-actin antistoffer anvendes først for at sikre lige belastning af prøverne før påføring af andre specifikke antistoffer. Den alternative sekvens med anti-actin-antistoffer anvendes efter at anti-phospho-IRF3 antistoffer, fungerer også. Stripping bruges mellem anti-actin og anti-SeV-antistoffer, eller mellem anti-phospho-IRF3 og anti-IRF3 antistoffer på grund af overlappende størrelse af signalerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Primære antistoffer | Fortynding | Fortyndingsbuffer | Inkubation | Sekundære antistoffer | Kommentarer |
| Anti-Actin | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | 15 min ved stuetemperatur | Anti-muse | Anvendelse efter SDS-PAGE Fortyndede antibodyies kan genbruges flere gange, hvis de opbevares ved 4 ° C i nærvær af 0,02% natriumazid. |
| Anti-IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N ved 4 ° C | Anti-kanin | Anvendelse efter Native-PAGE. Det anbefales ikke at genbruge det fortyndede antistof |
| Anti-IRF3-P-Ser396 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N ved 4 ° C | Anvendelse efter SDS-PAGE. Det anbefales ikke at genbruge det fortyndede antistof Anti-IRF3-P-396 er også tilgængelig fra cellesignalering. Optimal fortynding blev defineret som 1 / 1.000 til dette antistof, men kan variere mellem partier. | |
| Anti-IRF3-P-Ser398 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N ved 4 ° C | Anti-kanin | Anvendelse efter SDS-PAGE. Det anbefales ikke at genbruge det fortyndede antistof |
| Anti-IRF3 fuld længde | 1 / 7.500 | PBS-T-mælk | 3 timer ved stuetemperatur | Anti-kanin | Anvendelse efter SDS-PAGE. Anti-IRF3 fuld længde antistof kan anvendes efter nativ PAGE, men det er mindre følsom til at påvise monomeren. Fortyndede antistoffer kan genbruges flere gange, hvis de opbevares ved 4 ° C i nærvær af 0,02% natriumazid. |
| Anti-IRF3-NES | 0,5 ug / ml | PBS-T-mælk | 3 timer ved stuetemperatur | Anti-kanin | Anvendelse efter Native-PAGE. Fortyndede antibodyies kan genbruges flere gange, hvis de opbevares ved 4 ° C i nærvær af 0,02% natriumazid. |
| Anti-SeV | 1 / 14.000 | PBS-T-BSA | 3 timer ved stuetemperatur | Anti-kanin | Anvendelse efter SDS-PAGE. Fortyndede antibodyies kan genbruges flere gange, hvis de opbevares ved 4 ° C i nærvær af 0,02% natriumazid. |
| BEMÆRK: Fortynding og buffer benyttes til HRP-koblede sekundære antistoffer skal optimeres, da det varierer fra det ene selskab til det andet. | |||||
Tabel 1. Specifikationer for antistoffer anvendes i immunblotting Procedure.
- Inkuber membranerne med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer som beskrevet i figur 1 og tabel 1. Vask membranerne 5x 5 minutter i PBS-T efterfulgt af 2x 5 min i PBS til fuldt ud at fjerne spor af Tween.
- Inkuber membranerne i 1 min i et volumen på forøget kemiluminescens reagens tilstrækkelig til fuldstændig at dække membranerne. Tør membranerne under anvendelse af filtrerpapir.
- Placer membranerne i et luminescerende billedanalysator at visualisere immunreaktive bånd.
- Alternativt, udføre påvisning af immunoreaktive bånd ved hjælp af følsomme X-Ray film.
- Vask membranerne 3x 5 minutter i PBS.
BEMÆRK: I dette trin membranerne kan holdes tørt. Hvis yderligere stripping er påkrævet, er det bedre at udføre stripning inden tørring membranen. Membraner kan også gemmes til kortvarig i PBS. - For membranerne, der ikke kræver stripping mellem inkubation med antistoffer (se figur 1) gå direkte til trin5.20.
- Når stripning der kræves mellem antistoffer (se figur 1), inkubere membranerne i foropvarmede stripning opløsning indeholdende 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCI pH 6,8 (RT) og 0,7% β-mercaptoethanol i Hedeselskabet 2 O ved 50 ° C i 20 minutter under regelmæssig omrøring. Vask membranerne 3x 5 minutter i PBS.
BEMÆRK: Omrøring under afisoleringen er nøglen. Stripning kan udføres i en hybridiseringsovn. Alternativt, stripning kan udføres under anvendelse membraner forseglet i plastikposer og nedsænket i et vandbad. I dette tilfælde er det vigtigt at omrøre membranerne 4 - 5 gange under inkubationen. - Inkuber membranerne i 1 time ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C i PBS-T-mælk.
- Gentag trin 5,12-5,16 ifølge figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser en typisk immunoblot billede af IRF3 påvist med IRF3 samlede antistoffer og IRF3-phosphospecifikke antistoffer mod Ser396 og Ser398 efter løsning af WCE ved høj opløsning SDS-PAGE. I ustimulerede A549-celler, er IRF3 detekteres som to bånd ved 50 og 53 kDa på SDS-PAGE svarer til den ikke-phosphoryleret (form I) og hypophosphorylerede (formular II) arter af IRF3. Eksponering af A549-celler til SEV 3 - 9 timers resulterer i en tidsafhængig skift til langsomt migrerende hyperphosphorylerede former III og IV, som er godt adskilt fra de former I og II. De hyperphosphorylerede bands migrere på 55-57 kDa. De formularer III og IV er også specifikt immunodetekteret hjælp af phosphospecifikke antistoffer mod Ser396 og Ser398. Immunpåvisningen af actin tjener som en kontrol af samme belastning mellem banerne. En kontrol af SeV-infektion er vist ved akkumulering af virusnukleocapsidantigen protein (N), der migrerer ved 60 kDa.
I figur 3, profilen af påvisning af IRF3 opnået fra WCE løses ved nativ PAGE efterfulgt af immunoblot ved anvendelse af anti-IRF3-NES antistoffer og phosphospecifikke antistoffer mod Ser386 vises. I ustimulerede A549-celler, er IRF3 påvises som et enkelt bånd svarende til den monomere form. Efter infektion med SeV til 3-9 timer, niveauerne af IRF3 monomer fald med en ledsagende akkumulering af en langsomt vandrende bånd, der svarer til den dimere form af IRF3. De phosphospecifikke antistoffer mod Ser386 kun afsløre IRF3 dimer arter.
Figur 2. Påvisning af Distinct IRF3 Phosphorylerede Arter (formular I-IV), induceret af SeV Infektion i A549 celler. A549 celler blev efterladt ikke-inficerede eller inficeret med SeV for indicated gange. WCE blev analyseret ved høj opløsning SDS-PAGE efterfulgt af immunoblot (IB) under anvendelse af anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) og anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) phosphospecifikke antistoffer og anti -IRF3 protein i fuld længde antistoffer. Infektionen blev overvåget under anvendelse af anti-SeV-antistoffer (nukleokapsidproteinet N-protein er vist). Anti-actin antistoffer blev anvendt som en belastning kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Overvågning af phosphoryleret / dimeriseret IRF3 Induktion af SeV i A549-celler. A549-celler blev efterladt uinficeret eller inficeret med SeV til de angivne tidspunkter. WCE blev opløst ved nativ-PAGE og viste ved immunoblot ved anvendelse af anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) phosphospecifikke antistoffer og anti-IRF3-NES ANTIBodies. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen vi beskriver her består af en kombination af høj opløsning SDS-PAGE og nativ PAGE-koblet til anvendelsen af adskillige phosphospecifikke antistoffer til at skelne den monomere / dimere og phosphoforms I-IV i IRF3. Passende påvisning af disse arter IRF3 er afgørende for fuldt ud at karakterisere IRF3 aktivering i en bestemt indstilling. For eksempel, LPS-stimulering af aktiverede makrofager fører til dannelsen af dimer, Ser396 / 398 phosphoryleret IRF3 som udviser en hypophosphoryleret (formular II), men ikke hyperphosphoryleret (formular III og IV), mønster i SDS-PAGE 15. Brug den beskrevne protokol, kan denne profil skelnes fra virus-induceret hyperphosphorylerede former, der kræver yderligere Ser339 fosforylering foruden Ser386 og Ser396 fosforylering 10. Det er vigtigt, giver dette også mulighed som skelner mellem Ser396 phosphorylerede arter, som ikke udviser dimerisering, men er transkriptionelt aktiv 10. Importantly, skal det bemærkes, at form I-IV mønster af IRF3 phosphoforms anvendes på menneskelige IRF3. Murine IRF3 ikke udviser et lignende mønster og dermed aktivering af IRF3 karakteriseres udelukkende ved anvendelse af phosphospecifikke antistoffer i immunoblot efter SDS-PAGE og ved nativ-PAGE.
Opnåelsen af en høj opløsning separation af de forskellige fosforylerede arter af IRF3 ved SDS-PAGE kræver specifikke parametre. For passende opløsning, er det meget vigtigt at bruge geler, der har en længde på mindst 16 cm. Selv med denne længde adskillelse gel, er det afgørende at lade migration forreste nå bunden af gelen til opnåelse af en passende adskillelse af de forskellige IRF3 former. Desuden skal stabelgelen udvides til et minimum på 1 cm under kammen for at opnå veldefinerede bånd. Dette er vigtigt, da de hyperphosphorylerede former for IRF3 migrerer meget tæt på hinanden. Dårligt fokuserede bands vil resultere i manglende skelnen mellem phosphorylaTed danner forringe deres respektive kvantificering. Derudover er koncentrationen af ammoniumpersulfat og TEMED varierer fra SDS-PAGE-protokollen til en anden. Variation i disse koncentrationer fra dem, der er angivet her fandtes at væsentligt forringe opløsningen i adskillelsen af IRF3 arter.
Påvisning af IRF3 dimerdannelse gennem den indfødte-PAGE blev oprindeligt beskrevet af gruppen af Dr. T. Fujita. Denne protokol anvender buffer indeholdende DOC, der tillader dissociation af IRF3 dimer fra CBP / p300 27. Det anbefales at fortsætte til nativ-PAGE umiddelbart efter cellelysis som opbevaring af WCE ved -80 ° C blev fundet at resultere i en væsentlig ændring af IRF3 monomer / dimer forhold. Desuden er det meget vigtigt, at pH i den øvre og nedre kammer buffere justeres til pH 8,4 ved stuetemperatur, og ikke ved 4 ° C, til efter at blande alle komponenter sikre en ordentlig adskillelse af monomeren vs dimer. En adskillelsegel med en længde på mindst 8,5 cm muliggør passende adskillelse af IRF3 monomer og dimer. Den ideelle prøvevolumen plus loadingpuffer er omkring 8 pi for en 5 mm samt opløsningen er bedre, når lydstyrken er holdt på et minimum. Det er således vigtigt at anvende den laveste mængde lysisbuffer at opnå WCE med en høj koncentration. Imidlertid bør det tages i betragtning, at en effektiv proteinekstraktion kræver lysis på mindst 5x volumenet af cellepelleten. Hvis omfanget af prøverne overskrider grænsen angivet ovenfor, vil det resultere i dårlig opløsning af monomeren / dimer. Dette kan løses ved at tilføje en stabelgelen indeholdende 4% acrylamid, 62,5 mM Tris-HCI pH 6,8 (RT), 1% ammoniumpersulfat og 0,1% TEMED i Hedeselskabet 2 O. Det er meget vigtigt at indlæse prøverne uden at forstyrre banding. Indlæses langsomt med en gel-loading spids tæt på bunden af brønden giver meget gode resultater.
Her beskriver vi in vivo detektion af phosphorylering ved specifikke rester hjælp tiden tilgængelige phosphospecifikt antistoffer mod Ser386 9, Ser396 19 og Ser398 15. Brugen af IRF3 mutanter og massespektrometri analyser har bekræftet, at disse rester phosphoryleres ved virusinfektion eller overekspression af IKKε / TBK1 kinaser og er kritiske for IRF3 aktivering 6,9,10,19,21. Immunpåvisningen phospho-Ser396, phospho-Ser398 og total IRF3 efter SDS-PAGE kræver brug af to identiske geler (figur 1). Faktisk er observeret betydeligt tab af følsomhed, når phosphospecifikt antistoffer anvendes efter stripning af membranen. Derfor er det stærkt anbefales at bruge phosphospecifikt antistoffer først. Bemærk at alternative primære og sekundære antistoffer kan også fungere, men de specifikke fortyndinger og sekvens af brugen bør optimeres. For IRF3 analyse, 30 ug WCE er hensigtsmæssigt at opnå en betydelig påvisning af IRF3phosphorylering ved immunoblot under anvendelse af de angivne antistoffer ved brug af 4 mm bredde brønde. Selv om der i mange celletyper inficeret med forskellige vira 30 ug fandtes at være passende, kan dette beløb skal øges afhængigt af celletype og stimulering. Det foretrækkes at bruge friske ekstrakter til SDS-PAGE, men påvisning af IRF3 phosphorylering ved hjælp af phosphospecifikke antistofferne beskrevet i dette dokument er stabil nok til at tillade en runde af opbevaring af WCE ved -80 ° C inden analyse. Koncentrationerne af phosphataseinhibitorer er beskrevet her blev fundet at være tilstrækkelig, når der anvendes A549-celler. Højere koncentrationer blev ikke fundet at give bedre resultater. Men disse koncentrationer skal muligvis, øges når man studerer IRF3 aktivering i celletyper, der udviser højere phosphatase aktivitetsniveau. Vigtigt er det, phosphorylering af IRF3 og de underliggende mekanismer er stadig langt fra at blive forstået. Derfor er en komplet panel af Ser / Thr- og Tyr-phosphatase iudstillere bruges til at blokere eventuelle endnu ukarakteriserede aktiviteter, der kan påvirke påvisningen af IRF3 fosforylering, dimerisering og nedbrydning. Til påvisning af IRF3 monomer og dimer efter de fleste virusinfektioner og i de fleste celletyper, 8 - blev 10 ug WCE sig at være tilstrækkeligt. Dog kan større mængde af proteiner kræves til stimulering aktiverer IRF3 mindre effektivt. De phosphospecifikke antistoffer mod Ser386 anvendt i denne undersøgelse anbefales at blive anvendt i nativ PAGE som følsomheden denaturerende SDS-PAGE er meget svag. Desuden er phosphorylering ved Ser386 foreslået at korrelere med den dimere form af IRF3 9, hvilket gør anvendelsen af disse antistoffer i native-PAGE en passende strategi for at bekræfte dette koncept i en bestemt indstilling. Notatet er alternative antistoffer tilgængelige fra forskellige selskaber, og hævdes at effektivt at opdage phospho-Ser386 efter SDS-PAGE. Phosphospecifikt antistoffer mod Ser396 har også været effektivt used at detektere IRF3 phosphorylering efter nativ PAGE 20. Det er vigtigt, blev Ser402 i den C-terminale gruppe af phosphoacceptor sites også fundet at være vigtig for IRF3 aktivering og phosphorylering af Ser402 blev observeret gennem massespektrometri analyse af IKKε / TBK1-phosphoryleret IRF3 10,21,28. Men på trods af to forskellige forsøg (NG, upubliceret), er i øjeblikket tilgængelige til at følge phosphorylering af denne specifikke rest in vivo ingen phosphospecifikke antistoffer. Bemærk, at phosphospecifikke antistoffer mod Thr157 og Ser339 er også blevet beskrevet 11,13. Disse yderligere phosphospecifikke antistoffer kunne anvendes i en procedure med høj opløsning SDS-PAGE svarende til den beskrevet her. I dette tilfælde ville yderligere store SDS-PAGE geler kræves for hvert antistof og behandles på samme måde som gel # 2 (Figur 1). Til vores viden ingen phosphospecifikke antistoffer mod Ser173 eller Thr390 endnu er blevet beskrevet,men de kunne nemt tilføjes til protokollen beskrevet her, når de bliver tilgængelige 14,20.
IRF3 aktivitet afsluttes ved proteasom-medieret nedbrydning af hyperphosphorylerede former 11,17. Protokollen beskrevet her tillader også overvågningen af IRF3 nedbrydning, når den kinetiske stimulation er forlænget og er koblet til brugen af proteasominhibitorer (MG132, lactacystin eller bortezomid). Typisk, i A549-celler inficeret med SeV ved 40 HAU / 10 6 celler, IRF3 phosphorylering starter, så snart 2 timer efter SeV-infektion og IRF3 nedbrydning starter efter 12 timer. Proteasom-medieret nedbrydning vil blive indgået fra den observerede nedgang i formularer III og IV niveauer på sene tidspunkter, der er vendt i forhold med proteasominhibitorer. Dette vil også oversætte på indfødte-PAGE i en formindskelse af IRF3 dimer niveauer, der genvindes ved proteasominhibitor behandling 29. Vigtigere er det, høj opløsning technique præsenteres her tillader at skelne mellem nedbrydningsprocessen og manglende aktivering. Faktisk både nedbrydning og manglende aktivering af IRF3 resultatet i fravær af påvisning af dimer / phospho-Ser386 / 396. Imidlertid er manglen på aktivering er forbundet med påvisning af IRF3 monomer og former I og II, mens disse IRF3 arter ikke opdages, når IRF3 nedbrydes 30.
Immunopræcipitation kombineret med massespektrometri-analyse er en metode til valg at detektere in vivo phosphorylering af IRF3 på forskellige steder. Denne teknik blev brugt til at bekræfte phosphorylering af IRF3 på Ser173, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 og Ser402 rester 10,20,21. Men massespektrometri endnu ikke er en prisbillig / benchside teknik, der let kan anvendes til daglig analyse af IRF3 aktivering efter flere stimuleringer på forskellige tidspunkter. Derfor fremgangsmåden beskrevet her ved hjælp af SDS-PAGE koblet til nativ-PAGE i kombination med immunoblot hjælp totale og phosphospecifikt antistoffer udgør et konkret, økonomisk overkommelige og følsom metode til at opdage alle aktuelt definerede former for actived IRF3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
- Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
