Introduction
Den overalt og konstitutivt uttrykt transkripsjonsfaktor Interferon (IFN) regulerende faktor 3 (IRF3) er kritisk for den første linjen i forsvaret mot patogener hovedsakelig gjennom induksjon av IFNβ, men også gjennom induksjon av chemokine (CC motiv) ligand 5 (CCL5 ) og flere antivirale proteiner inkludert IFN-indusert protein med tetratricopeptide gjentar IFIT1 / 2/3 1-3. IRF3 aktivering er rapportert etter infeksjon med en rekke virus, eller eksponering for polyinosinic-polycytidylic syre (poly I: C) eller lipopolysakkarid (LPS) 4. Viktigere, har mest studerte virus utviklet mekanismer for å unngå den IRF3-mediert respons, og dermed unnslippe verten medfødte immunforsvaret 5. Således, overvåking IRF3 aktivering er av stor betydning for å forstå de molekylære mekanismer av medfødte antivirale vertsforsvar, men også for å identifisere den strategi som brukes av virus for å motvirke denne reaksjon.
ent "> Mange publiserte rapporter gir imidlertid bare en begrenset analyse av IRF3 aktivering utført ved overvåkning av IRF3-target geninduksjon (IFNB1 og IFIT1) og / eller luciferase reporter-genet koblet til analysen lav oppløsning natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS- PAGE) analyse av IRF3. Men mange biokjemiske studier, analyse av virkemåten til forskjellige IRF3 mutanter og belysning av IRF3 krystallstrukturen 6-11 har bidratt til å etablere at IRF3 utsettes for et komplekst sett av sekvensielle post-translasjonelle modifikasjoner av fosforylering ved flere steder. Settet av fosforylering involvert i IRF3 aktivering ser ut til å være avhengig av stimulus og mest sannsynlig på celletype. I uinfiserte celler, IRF3 eksisterer som ikke-fosforylerte og hypofosforylerte arter som inneholder phosphoresidues, inkludert Thr135 og Ser173, i ett -198 aa N-terminal region 6,12-14. Opphopning av denne hypofosforylerte form av IRF3 er indusert av stress-induse, vekstfaktorer og DNA-skadende midler 6. Fosforylering av Ser / Thr-rester på den C-terminale region av IRF3 inneholdende trans domenet utløses etter aktivering av virus, poly I: C eller LPS i en celletype-avhengig måte 15-17. C-terminal fosforylering av IRF3 innebærer ikke mindre enn 7 forskjellige phosphoacceptor nettsider organisert i to hoved klynger, Ser385 / Ser386 og Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, som hver bidrar til IRF3 aktivisering gjennom dimerization, kjernekraft akkumulering, tilknytning til CREB -binding protein (CBP) / P300 coactivators, DNA binding til IFN sensitiv respons element (SBR) konsensussekvenser og trans av målgener 9,10,17-19. Fosforylering av Thr390 er også tenkt å bidra til virus-indusert IRF3 aktivering 20. Massespektrometri analyser av IRF3 har vist at Ser386, Thr390, Ser396 og Ser402 rester er direkte phosphorylated ved hemmer av kB kinase ε (IKKε) / TANK-bindende kinase 1 (TBK1) kinaser 9,10. Fosforylering ved den C-terminale rester er også nødvendig for terminering av IRF3 aktivering polyubiquitination og proteasom-mediert nedbrytning 10. Denne prosessen er også avhengig av fosforylering ved Ser339, noe som er nødvendig for rekruttering av propyl-isomerase Pin1 10,11. IRF3 arter inneholder minst fosfor-Ser339 / 386/396 rester anses hyperfosforylert former. Den nøyaktige sekvensen og funksjonen til hvert område er fortsatt et spørsmål om diskusjon 10,21. Det er nå klart at aktivert IRF3 representerer ikke en homogen stat, men at ulike aktivert arter utviser tydelige fosforyleringsseter eller dimerisasjon egenskaper eksisterer 10,22.For å gi en fullstendig forståelse av IRF3 aktivering som svar på spesifikke patogener, er det derfor nødvendig å characterize hvilke av de aktiverte arter er indusert. Induksjon av IRF3 målgener, IFNB1 og IFIT1, har vist seg å gi en pålitelig avlesing for IRF3 aktivering. Men overvåking uttrykk av disse genene skiller ikke mellom ulike aktiverings tilstander av IRF3. En omfattende analyse av IRF3 aktiverings stater i en bestemt innstilling bygger på detaljert karakterisering av sin fosforylering og dimerization status 10. Ufosforylerte (skjema I), hypofosforylerte (skjema II) og hyperfosforylert (skjemaer III og IV) IRF3 former 6,18,23 kan løses ved redusert mobilitet i høy oppløsning SDS-PAGE analyse. Monomere og dimeriske IRF3 arter kan effektivt identifisert av innfødte-PAGE analyse. Disse metodene er kraftig forbedret når de brukes i kombinasjon med phosphospecific antistoffer rettet mot forskjellige IRF3 phosphoacceptor nettsteder.
Standard protokoller tillate en dårlig oppløsning påproteiner som ikke tillater effektiv separasjon av distinkte IRF3 fosforylerte formene. Her beskriver vi i detalj en fremgangsmåte for å oppnå den høyeste oppløsningen for å overvåke induksjon av forskjellige virus-aktivert IRF3 arter ved hjelp av SDS-PAGE koblet med nativ-PAGE i kombinasjon med immunblot ved hjelp av total og phosphospecific antistoffer. In vivo diskriminering mellom de forskjellige aktiverte former IRF3 utføres basert på deres mobilitet skift observert på SDS-PAGE. I tillegg kan IRF3 monomer og dimer være preget av ikke-denaturerende elektroforese. Kombinasjonen av disse to komplementære teknikker med immunoblot viser seg å være en rimelig og sensitiv tilnærming til å skaffe all nødvendig informasjon for en fullstendig analyse av fosforylering-mediert aktivering av IRF3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Protokollen er beskrevet her bruker A549 celler infisert med Sendai virus (SeV). Imidlertid fungerer også protokollen for SDS-PAGE og nativ PAGE med alle humane og murine celletyper som ble testet hittil, særlig myeloide celler stimulert med forskjellige IRF3-aktiverende stimuli 9,15,19,24,25.
1. Infeksjon av A549-celler
- Oppretthold A549-celler i kultur i en 15 cm plate ved 37 ° C / 5% CO2 i 20 ml F12K / Ham medium inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (HI-FBS) og 1% L-glutamin (fullstendig F12K / Ham medium).
MERK: Alle løsningene som brukes for cellekultur og behandlinger må være sterile. - Ved 24 timer før infeksjonen, aspirere mediet og vask av cellene med 10 ml destillert fosfatbufret saltoppløsning (D-PBS) ved romtemperatur.
- Tilsett 1 ml av 0,25% trypsin-EDTA-løsning til hver plate for å dekke cellene og inkuberes ved 37 ° C i 3 min.
- Stopp inkubasjon så snart the cellene begynner å løsne fra platen ved å banke forsiktig på plate med en hånd. Inaktivere trypsin ved tilsetning av 10 ml forvarmet komplett F12K / Ham medium per plate og overføre cellene til en 15 ml konisk rør.
- Sentrifuge ved 350 x g i 3 minutter ved RT. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 8 ml komplett F12K / Ham medium for å oppnå en homogen enkelt cellesuspensjon.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Seed cellene ved en tetthet på 1 x 10 6 celler pr 60 mm skål i 4 ml forvarmet komplett F12K / Ham medium. Inkuber i 20 - 24 timer ved 37 ° C / 5% CO 2. Etter 20 - 24 timer, cellene danner en 90% konfluent monolag (dette tilsvarer 1,5 x 10 6 celler).
- Fjern medium og vaske cellene med 2 ml serum-free F12K / Ham medium (SFM). Tilsett 2 ml fersk SFM per 60 mm plate.
- Tine en delmengde av Sendai-virus (SeV) (lagret aliquotert ved -80 ° C) på is og vortex kort.
- Fortynne the-viruset i forvarmet SFM å skaffe 60 HAU / 100 mL. Bland ved å pipettere opp og ned sakte og tilsett 100 mL fortynnet virus per plate for å utføre infeksjon ved 40 HAU / 10 6 celler. Ikke legg virus i den ikke-infiserte kontroll plate.
- Cellene inkuberes i inkubatoren ved 37 ° C / 5% CO2. Agitere platene for hånd 3 eller 4 ganger, eller ved hjelp av en automatisk orbital eller gynge shaker plasseres direkte i kuvøse, under den første timen av infeksjon.
- Ved to timer etter infeksjon, tilsett 2 ml F12K / Ham medium inneholdende 20% HI-FBS for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 10% HI-FBS.
- Cellene inkuberes i inkubatoren ved 37 ° C / 5% CO2 i ytterligere 1, 4 og 7 timer for å nå total infeksjon ganger av 3, 6 og 9 timer, henholdsvis. På hvert av disse tidspunktene, fortsett til trinn 2.1.
2. Utarbeidelse av hele cellen ekstrakter (WCE)
- Fjerne infeksjonen medium. Høste celler ved skraping i 1 mliskald D-PBS og overføre cellesuspensjonen til en på forhånd avkjølt 1,5 ml sentrifugerør.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 16.000 xg ved 4 ° C i 20 sekunder og nøye dekanter alle spor av D-PBS.
NB: I dette trinnet, kan cellepelleten blir direkte utsatt for proteinekstraksjon eller flash-frosset i flytende nitrogen eller tørris / etanol-bad og lagret ved -80 ° C inntil lyse. - Klargjør lysis buffer som inneholder 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% glyserol og 1% Nonidet P-40 i deionisert vann (DDH 2 O). Extemporarily legge protease (1 ug / ml leupeptin, 2 ug / ml aprotinin) og fosfatase-inhibitorer (5 mM natriumfluorid, 1 mM aktivert natriumortovanadat, 2 mM p-nitrofenylfosfat, og 10 mM β-glycerofosfat pH 7,5).
MERK: lysis buffer uten inhibitorer kan lagres ved 4 ° C. En spesifikk protokoll for aktivering av natriumortovanadat er beskrevet i tabellen over spesifikke reagenser / utstyr;nt. - Resuspender cellepelleten i 70 pl av lyseringsbuffer. Typisk lysatet konsentrasjon vil være rundt 2 ug / ul.
- Inkuber på is i 20 min. Flash-fryse lysatet ved inkubering i et bad av flytende nitrogen i 15 sekunder. Tine løsningen ved romtemperatur inntil den er fullstendig smeltet og virvle i 10 sek. Gjenta fryse / tine / vortex syklus 3 ganger.
- Alternativt kan utføre frysetrinnet i et etanol / tørris-bad i 1 min.
- Sentrifuger ved 16.000 xg ved 4 ° C i 20 min. Overfør supernatanten (svarende til WCE) til en ny på forhånd avkjølt 1,5 ml sentrifugerør. Hold WCE på is til alle tider.
- Kvantifisere proteiner ved anvendelse av hvilket som helst protein kvantifisering prosedyre forenlig med lysis buffer som for eksempel for Bradford-proteinanalyse basert 26.
3. Vedtak om WCE av High Resolution SDS-PAGE
- Forbered tre denaturerende elektroforese gels.
- For påvisning avIRF3 former, hell to geler av minst 16 cm lengde med en separasjon gel bestående av 7,5% akrylamid / bis-akrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (romtemperatur), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% ammoniumpersulfat og 0,1% TEMED i DDH 2 O og en stabling gel bestående av 4% akrylamid, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% ammoniumpersulfat og 0,1% TEMED i DDH 2 O.
Forsiktighet! Akrylamid, TEMED og SDS er giftige og / eller irriterende. Bruk vernehansker og manipulere under en avtrekkshette. - For påvisning av SEV proteiner, helles en gel av et minimum på 8,5 cm lengde med lignende egenskaper som den gel som er beskrevet i 3.1.1, bortsett fra at separasjonen gelen inneholder 12% akrylamid.
- For påvisning avIRF3 former, hell to geler av minst 16 cm lengde med en separasjon gel bestående av 7,5% akrylamid / bis-akrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (romtemperatur), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% ammoniumpersulfat og 0,1% TEMED i DDH 2 O og en stabling gel bestående av 4% akrylamid, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% ammoniumpersulfat og 0,1% TEMED i DDH 2 O.
- Denaturere WCE oppnådd i trinn 2.6 ved tilsetning av 1: 4 (v / v) 5x lastebuffer (125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p / v) glycerol, 0,0005% bromfenolblått og 25% β-merkaptoetanol i DDH 2 O), etterfulgt av oppvarming ved 100 °C i 10 min. Hurtig spin rørene for å få ned kondens som dannes i hetten.
Forsiktighet! β-merkaptoetanol er giftig ved inhalering. Bruk vernehansker og manipulere under en avtrekkshette. - Monter gels i migrasjon apparat. Fyll de øvre og nedre kamre med rennende buffer inneholdende 25 mM Tris-base, 0,1% SDS og 192 mM glycin i destillert vann (dH 2 O).
- Belastning 14 ul av molekylvektstandard i en brønn av hver 16 cm gel og 7 ul av molekylvektstandard i en brønn på 8,5 cm gel. Belastning 30 ug denaturert WCE (fremstilt som beskrevet i trinn 3.2) per brønn av de to geler fremstilt i trinn 3.1.1 for IRF3 former deteksjon. Last 8 - 10 ug av denaturert WCE (fremstilt som beskrevet i trinn 3.2) per brønn på gelen fremstilt i trinn 3.1.2 SeV for analyse.
- Kjør geler ved 30 mA konstant strøm før overføringen fronten når bunnen av gelen.
MERK: Migrasjon vanligvis varer den tilnærmettely 3 timer for en 16 cm gel og 45 min for en 8,5 cm gel. - Fortsett til overføring på nitrocellulosemembranene (trinn 5).
4. Analyse av IRF3 Dimerisasjon av Native-PAGE
MERK: Denne metoden ble opprinnelig beskrevet av gruppen av Dr. T. Fujita 27.
- Forberede de øvre (-) og nedre (+) kammer elektroforese buffere. Det øvre kammer buffer består av 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (romtemperatur), 192 mM glycin, 1% natriumdeoksycholat (DOC) i DDH 2 O. Det nedre kammer bufferen inneholder 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (romtemperatur) og 192 mM glycin i DDH 2 O.
MERK: De øvre og nedre kammer elektroforese buffere kan lagres ved 4 ° C inntil bruk. Men pass på at de er forhånds varmet opp til romtemperatur før du utfører elektroforese. - Hell en ikke-denaturerende oppløsende gel fra et minimum på 8,5 cm lengde som inneholdt 7,5% akrylamid / bis-akrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% ammonium persulfat og 0,1% TEMED i DDH 2 O.
- Pre-drevne gelen ved 40 mA konstant strømstyrke i 30 minutter på is. Trykk setteapparatet inn i isen omtrent til nivået for den nedre kammer elektroforese buffer. Det er viktig at gelen ikke er i isen.
- Under pre-run, bland WCE holdt på isen med 2x innfødt-PAGE loading buffer 1: 1 (v / v) inneholder 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% glyserol og 0,1% bromfenolblått i DDH 2 O.
- Last 8 - 10 ug WCE (fremstilt som beskrevet i trinn 4.4) umiddelbart ved enden av pre-run.
- Kjør gelen ved 25 mA konstant strømstyrke på is, som beskrevet ovenfor for den pre-løp, før overføringen fronten når bunnen av gelen (ca. 40 min).
5. immunoblotanalyse av IRF3 Arter
- Forberede overføringen buffer som inneholder 25 mM Tris-Base og 192 mM glysin i DDH 2 O. Kjøle overføringsbuffer ved 4 ° C før bruk.
- Våte tre stykker av nitrocellulosemembranen kuttet til en størrelse litt større enn gelen i et plast / glass boksen som inneholder overføringsbuffer. Indikerer orienteringen av membranen ved å kutte et hjørne. Overføringen buffer kan brukes på nytt 3 ganger. Oppbevar buffer ved 4 ° C mellom hver bruk.
- Uncast gelene (SDS-PAGE og native-PAGE) og kuttet ett hjørne av hver gel for riktig orientering.
- For native-PAGE, inkuber gelen ved romtemperatur med forsiktig omrøring i minst 30 minutter i SDS-PAGE-buffer for å fjerne DOC før de overføres til overføringsbuffer.
- Inkuber gels (SDS-PAGE og native-PAGE) i overføringsbuffer i 5 - 10 min.
- Montere en overføring smørbrød per gel i en overføring kassett med membranen mot den positive elektroden (skum pad / filter papir / membran / gel / filter papir / skum pad). Vær nøye med å fjerne alle boblene i mellom lagene i sandwich.
- Utfør overføring som anbefalte by produsenten for overføringen anvendte apparat.
MERK: Utfør alle inkuberinger og vasker i de neste trinnene på en gynge eller orbital risting plattform. - Ved slutten av overføringstiden, Inkuber membraner i 15 min i fikseringsløsning inneholdende 7% eddiksyre, 40% etanol og 3% glycerol i DDH 2 O. Vaske membranene 3 x 5 min i PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na HPO 2 4 og 1,8 mM KH 2PO 4 i dH 2 O).
Forsiktighet! Eddiksyre er giftig, irriterende og brannfarlig. Bruk vernehansker og manipulere under avtrekkshette.
MERK: fikseringsløsning kan brukes om igjen flere ganger. - For den innfødte PAGE membran gå direkte til trinn 5.11.
- Skyll de tre SDS-PAGE-membraner raskt i dH 2 O før inkubering av dem i 1 minutt i rødt ponceau løsning inneholdende 6,57 mM red Ponceau og 1% eddiksyre i DDH 2 O.
MERK: Den røde ponceau løsning kan være r eused flere ganger. - Skyll membranene i dH 2 O til bakgrunnen er hvit nok til å se proteinbåndene farget i rødt. Legg merke til markører med en blyant og klippe det overskytende membranen rundt proteiner. Destain membranene ved inkubasjon i 5 minutter i PBS under omrøring.
- Inkuber membraner i 1 time ved RT eller O / N ved 4 ° C i blokkeringsoppløsning (PBS inneholdende 0,05% Tween 20 og 5% ikke-fettholdig tørrmelk (PBS-T-melk). Vask membranene 3 x 5 min i PBS-T.
MERK: PBS-T vask er valgfritt og bare strengt nødvendig ved å anvende antistoffer fortynnet i PBS-T inneholdende 5% bovint serumalbumin (PBS-T-BSA) (figur 1 og tabell 1) i det neste trinn. - Inkuber de fire membraner (fra SDS-PAGE og native-PAGE) med de primære antistoffene i henhold til den rekkefølge som er beskrevet i Figur 1 og Tabell 1. Utfør 5 x 5 min vaskinger i PBS-T.
Figur 1. Sekvens av Immunoblotanalyse Analyser. Den skjematisk beskriver de enkelte SDS-PAGE og native-PAGE-geler som kreves for å gjenkjenne de ulike IRF3 fosforylerte og monomere / dimer former. Den bestemte rekkefølgen av antistoffer anvendt på membranen som følge av hver gel i immunoblot-fremgangsmåten er beskrevet. Legg merke til at anti-aktin antistoffer brukes først for å sikre lik lasting av prøvene før du bruker noen andre spesifikke antistoffer. Den alternative sekvensen, med anti-aktin antistoffer blir brukt etter at anti-phospho-IRF3 antistoffer, fungerer også. Stripping er brukt mellom anti-aktin og anti-Sev antistoffer, eller mellom anti-fosfor-IRF3 og anti-IRF3 antistoffer på grunn av overlappende størrelse av signalene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primære antistoffer | Fortynning | Fortynningsbuffer | Inkubasjon | Sekundære antistoffer | Kommentarer |
| Anti-Actin | 1/10000 | PBS-T-BSA | 15 min ved RT | Anti-mus | Brukes etter SDS-PAGE Fortynnede antibodyies kan brukes om igjen flere ganger, når den lagres ved 4 ° C i nærvær av 0,02% natriumazid. |
| Anti-IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N ved 4 ° C | Anti-kanin | Brukes etter Native-PAGE. Det er ikke anbefalt å bruke den fortynnede antistoff |
| Anti-IRF3-P-Ser396 | 1/10000 | PBS-T-BSA | O / N ved 4 ° C | Brukes etter SDS-PAGE. Det er ikke anbefalt å bruke den fortynnede antistoff Anti-IRF3-P-396 er også tilgjengelig fra Cell Signaling. Optimal fortynning ble definert som 1/1000 for dette antistoff, men kan variere mellom masse. | |
| Anti-IRF3-P-Ser398 | 1/10000 | PBS-T-BSA | O / N ved 4 ° C | Anti-kanin | Brukes etter SDS-PAGE. Det er ikke anbefalt å bruke den fortynnede antistoff |
| Anti-IRF3 full lengde | 1/7500 | PBS-T-melk | 3 timer ved romtemperatur | Anti-kanin | Brukes etter SDS-PAGE. Anti-IRF3 full lengde antistoff kan brukes etter nativ PAGE, men det er mindre følsomt til å detektere monomer. Fortynnede antistoffer kan brukes om igjen flere ganger, når den lagres ved 4 ° C i nærvær av 0,02% natriumazid. |
| Anti-IRF3-NES | 0,5 ug / ml | PBS-T-melk | 3 timer ved romtemperatur | Anti-kanin | Brukes etter Native-PAGE. Fortynnede antibodyies kan brukes om igjen flere ganger, når den lagres ved 4 ° C i nærvær av 0,02% natriumazid. |
| Anti-SeV | 1/14000 | PBS-T-BSA | 3 timer ved romtemperatur | Anti-kanin | Brukes etter SDS-PAGE. Fortynnede antibodyies kan brukes om igjen flere ganger, når den lagres ved 4 ° C i nærvær av 0,02% natriumazid. |
| MERK: fortynning og buffer brukes for HRP-koblede sekundære antistoffer må være optimalisert som det varierer fra ett selskap til et annet. | |||||
Tabell 1. Spesifikasjoner av antistoffer som brukes i prosedyren immunoblotting.
- Inkuber membraner med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer som beskrevet i Figur 1 og Tabell 1. Vask membranene 5 x 5 minutter i PBS-T, fulgt av 2 x 5 minutter i PBS for å fullstendig fjerne spor av Tween.
- Inkuber membraner i 1 min i et volum av forsterket kjemiluminescens reagens tilstrekkelig til fullstendig å dekke membranene. Tørk membraner bruker filterpapir.
- Plasser membranene i en selvlysende bilde analysator for å visualisere immunoreaktive bånd.
- Alternativt utføre påvisning av immunoreaktive bånd med sensitive X-Ray filmer.
- Vaske membranene 3x 5 min i PBS.
MERK: På dette trinnet membranene kan holdes tørr. Hvis imidlertid ytterligere stripping er nødvendig, er det bedre å utføre strippingen før tørking membranen. Membraner kan også lagres for kortsiktig i PBS. - For membranene som ikke krever stryking mellom inkubasjon med antistoffer (se figur 1) gå direkte til trinn5.20.
- Ved stripping er nødvendig mellom antistoffer (se figur 1), inkuberes membranene i forvarmet strippeløsning inneholdende 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) og 0,7% β-merkaptoetanol i DDH 2 O ved 50 ° C i 20 minutter under jevnlig omrøring. Vaske membranene 3x 5 min i PBS.
MERK: Uro under stripping prosedyren er nøkkelen. Stripping kan utføres i en ovn hybridisering. Alternativt, stripping kan utføres ved hjelp av membraner forseglet i plastposer og nedsenket i et vannbad. I dette tilfellet er det viktig å agitere membranene 4 - 5 ganger i løpet av inkuberingen. - Inkuber membraner i 1 time ved RT eller O / N ved 4 ° C i PBS-T-melk.
- Gjenta trinn 05.12 til 05.16 i henhold til figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser en typisk immunoblot bilde av IRF3 oppdaget med IRF3 totale antistoffer og IRF3-phosphospecific antistoffer mot Ser396 og Ser398 etter oppløsningen av WCE av høyoppløselig SDS-PAGE. I ikke-stimulerte A549-celler, er IRF3 detektert som to bånd ved 50 og 53 kDa på SDS-PAGE svarende til den ikke-fosforylert (form I) og den hypofosforylerte (skjema II) arter av IRF3. Eksponering av A549 celler til SEV for 3 - 9 t resulterer i en tidsavhengig forskyvning til langsomt migrerende hyperfosforylert former III og IV, som er godt atskilt fra skjemaene I og II. De hyperfosforylert band migrerer på 55-57 kDa. Skjemaene III og IV er også spesielt immunpåvist hjelp av phosphospecific antistoffer mot Ser396 og Ser398. Den immundeteksjon av aktin tjener som en kontroll av lik belastning mellom banene. En kontroll av SeV infeksjon er vist ved akkumulering av viruset nukleokapsid protein (N), som migrerer ved 60 kDa.
I figur 3 er profilen til påvisning av IRF3 oppnådd fra WCE løst ved nativ PAGE etterfulgt av immunblot hjelp av anti-IRF3 NES-antistoffer og antistoffer mot phosphospecific Ser386 er vist. I ikke-stimulerte A549-celler, er IRF3 detektert som et enkelt bånd som svarer til den monomere form. Ved infeksjon med SeV for 3 - 9 timer, nivåene av IRF3 monomer nedgang med en samtidig oppbygging av et sakte migrerer band som tilsvarer dimer form av IRF3. De phosphospecific antistoffer mot Ser386 bare oppdage IRF3 dimer arter.
Figur 2. Påvisning av Distinkt IRF3 fosforylert Species (skjema I-IV) indusert av SeV Infeksjon i A549-celler. A549 celler ble forlatt infisert eller infisert med SeV for indicated ganger. WCE ble analysert ved høy-oppløsning SDS-PAGE etterfulgt av immunblot (IB) ved anvendelse av anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) og anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) phosphospecific-antistoffer og anti -IRF3 full lengde protein antistoffer. Infeksjonen ble overvåket ved bruk av anti-SEV-antistoffer (nukleokapsidet N proteinet er vist). Anti-aktin antistoffer ble brukt som en lasting kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Overvåking av Fosforylert / dimerisert IRF3 Induksjon av SeV i A549-celler. A549-celler ble igjen uinfiserte eller infisert med SeV i de angitte tidsrom. WCE ble løst ved innfødt-PAGE og avslørt av immunoblot hjelp av anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) phosphospecific antistoffer og anti-IRF3-NES Antibodies. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen Vi beskriver her består av en kombinasjon av høy oppløsning og SDS-PAGE og native-PAGE koblet til bruken av flere phosphospecific antistoffer for å skille monomere / dimere og phosphoforms I-IV av IRF3. Hensiktsmessig påvisning av disse IRF3 artene er nødvendig for å fullstendig karakterisering IRF3 aktivering i en bestemt innstilling. For eksempel, LPS stimulering av aktiverte makrofager fører til dannelse av dimer, Ser396 / 398 fosforylert IRF3 som oppviser en hypofosforylerte (skjema II), men ikke hyperfosforylert (skjema III og IV), mønster i SDS-PAGE 15. Bruke den beskrevne protokollen, kan denne profilen skilles fra virus-indusert hyperfosforylert former som krever ekstra Ser339 fosforylering i tillegg til Ser386 og Ser396 fosforylering 10. Viktigst av alt gir dette også diskriminere mellom Ser396 fosforylerte arter som ikke utviser dimerization, men er transkripsjonelt aktiv 10. Importantly, må det bemerkes at skjemaet I-IV mønster av IRF3 phosphoforms påført menneske IRF3. Murine IRF3 oppviser ikke et tilsvarende mønster og dermed aktivering av IRF3 er karakterisert kun ved bruk av phosphospecific antistoffer i immunblot etter SDS-PAGE og ved naturlig-PAGE.
Oppnåelse av en høy oppløsning separasjon av de forskjellige arter av fosforylerte IRF3 ved SDS-PAGE krever bestemte parametere. For riktig oppløsning, er det svært viktig å bruke gels som har en minimumslengde på 16 cm. Selv med denne lengden av separasjons gel, er det nøkkel å la overføringen fremre nå bunnen av gelen for å få en passende separering av de forskjellige IRF3 former. Dessuten må stable gel strekker seg til minst 1 cm under kam for å oppnå veldefinerte bånd. Dette er viktig, ettersom hyperfosforylert former IRF3 migrere svært nær hverandre. Dårlig fokuserte band vil føre til mangel på skille mellom phosphorylated danner svekke deres respektive kvantifisering. I tillegg er konsentrasjonen av ammonium persulfat og TEMED variere fra en SDS-PAGE-protokollen til en annen. Variasjoner i disse konsentrasjonene fra det som er angitt her ble funnet å signifikant svekke oppløsningen i separasjon av de IRF3 arter.
Påvisning av IRF3 dimerdannelse gjennom mors-PAGE ble opprinnelig beskrevet av gruppen av Dr. T. Fujita. Denne protokollen bruker buffer inneholdende DOC som muliggjør dissosiasjon av IRF3 dimer fra CBP / P300 27. Det er sterkt anbefalt å gå videre til mors-PAGE umiddelbart etter cellelysis som lagring av WCE ved -80 ° C ble funnet å resultere i en betydelig endring av IRF3 monomer / dimer ratio. I tillegg er det meget viktig at pH-verdien av de øvre og nedre kammer buffere blir justert til pH 8,4 ved romtemperatur, og ikke ved 4 ° C, for etter blanding alle komponenter oppnå riktig adskillelse av monomeren vs dimer. En separasjongel med en minimumslengde på 8,5 cm gjør at passende separasjon av IRF3 monomer og dimer. Den ideelle volum av prøven pluss ladningsbuffer er rundt 8 ul av en 5 mm, i tillegg til oppløsningen er bedre når volumet er holdt på et minimum. Derfor er det viktig å bruke den laveste volumet av lyseringsbuffer for å oppnå WCE med en høy konsentrasjon. Det bør imidlertid tas hensyn til at effektiv proteinekstraksjon krever lysering i det minste 5 ganger volumet av cellepelleten. Hvis volumet av prøvene overskrider grensen som er angitt ovenfor, vil dette resultere i dårlig oppløsning av monomer / dimer. Dette kan løses ved å tilsette en stable gel inneholdende 4% akrylamid, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 1% ammoniumpersulfat og 0,1% TEMED i DDH 2 O. Det er veldig viktig å laste prøvene uten å forstyrre banding. Last langsomt med en gel-lasting spiss nær bunnen av brønnen gir meget gode resultater.
Her beskriver vi in vivo DeteDette skjer fosforyleringsnivå på bestemte rester bruker tilgjengelige phosphospecific antistoffer mot Ser386 9, Ser396 19 og Ser398 15. Bruken av IRF3 mutanter og massespektroskopi-analyser har bekreftet at disse rester er fosforylert ved virusinfeksjon eller overekspresjon av IKKε / TBK1 kinaser, og er kritisk for IRF3 aktivering 6,9,10,19,21. Immunodeteksjonsprosedyren av fosfor-Ser396, fosfor-Ser398 og total IRF3 etter SDS-PAGE krever bruk av to identiske gels (figur 1). Faktisk er betydelig tap av følsomhet observert når phosphospecific antistoffer blir brukt etter stripping av membranen. Derfor er det sterkt anbefalt å bruke phosphospecific antistoffer først. Legg merke til at alternative primære og sekundære antistoffer kan også fungere, men de spesifikke fortynninger og sekvens av bruk bør optimaliseres. For IRF3 analysen, er 30 mikrogram av WCE hensiktsmessig å oppnå en betydelig påvisning av IRF3fosforylering av immunoblot hjelp de angitte antistoffer når du bruker 4 mm bredde brønner. Selv om det i mange celletyper infisert med ulike virus 30 ug ble funnet å være hensiktsmessig, kan denne mengde må økes, avhengig av celletype og stimulering. Det er foretrukket å bruke friske ekstrakter for SDS-PAGE, men påvisningen av IRF3 fosforylering ved hjelp av phosphospecific antistoffene som er beskrevet i denne artikkelen er stabil nok til å tillate en runde med lagring av WCE ved -80 ° C før analyse. Konsentrasjonene av fosfatase-inhibitorer er beskrevet her, ble funnet å være tilstrekkelig ved bruk av A549-celler. Høyere konsentrasjoner ble ikke funnet å gi bedre resultater. Men kanskje disse konsentrasjonene må økes når studere IRF3 aktivering i celletyper som viser høyere fosfatase aktivitetsnivå. Viktigere, fosforyleringen av IRF3 og de underliggende mekanismene er fortsatt langt fra å bli forstått. Derfor er en fullstendig panel av Ser / Thr- og Tyr-fosfatasehibitors brukes til å blokkere mulige ennå uncharacterized aktiviteter som kan påvirke påvisning av IRF3 fosforylering, dimerisasjon og degradering. For påvisning av IRF3 monomer og dimer etter at de fleste virusinfeksjoner og i de fleste celletyper, 8 - ble 10 ug WCE funnet å være tilstrekkelig. Imidlertid kan større mengder proteiner være nødvendig for stimulering aktivering IRF3 mindre effektivt. De phosphospecific antistoffer mot Ser386 brukt i denne studien er anbefalt å bli brukt i native-PAGE som følsomheten i denaturerende SDS-PAGE er meget svak. Videre er fosforylering ved Ser386 foreslått å korrelere med den dimere form av IRF3 9, og dermed gjøre bruk av disse antistoffene i native-PAGE en hensiktsmessig strategi for å bekrefte dette konseptet i en bestemt innstilling. Av notatet, alternative antistoffer er tilgjengelig fra ulike selskaper og er hevdet å effektivt oppdage phospho-Ser386 etter SDS-PAGE. Phosphospecific antistoffer mot Ser396 har også vært effektivt used å oppdage IRF3 fosforylering etter mors-PAGE 20. Viktigere, Ser402 i den C-terminale klynge av phosphoacceptor områder ble også funnet å være viktig for IRF3 aktivering og fosforylering av Ser402 ble observert ved massespektrometri-analyse av IKKε / TBK1-fosforylert IRF3 10,21,28. Men til tross for to forskjellige forsøk (NG, upubliserte), ingen phosphospecific antistoffer er for tiden tilgjengelig for å følge fosforylering av denne spesifikke rester in vivo. Merk at phosphospecific antistoffer mot Thr157 og Ser339 har også blitt beskrevet 11,13. Disse ytterligere phosphospecific antistoffene kan bli brukt i en fremgangsmåte med høy oppløsning SDS-PAGE i likhet med det som er beskrevet her. I dette tilfelle vil ytterligere store SDS-PAGE-geler være nødvendig for hvert antistoff og behandlet på samme måte som gel # 2 (figur 1). Så vidt vi vet ingen phosphospecific antistoffer mot Ser173 eller Thr390 ennå ikke er beskrevet,men de kan enkelt legges til protokollen beskrevet her en gang de blir tilgjengelige 14,20.
IRF3 aktiviteten avsluttes av proteasom-mediert degradering av hyperfosforylert former 11,17. Protokollen er beskrevet her tillater også overvåkning av IRF3 degradering når den kinetiske stimulering er forlenget og er koblet til anvendelse av proteasomhemmere (MG132, laktacystin eller bortezomid). Vanligvis, i A549-celler infisert med SeV ved 40 HAU / 10 celler 6, begynner IRF3 fosforylering så snart som to timer etter infeksjon og SeV IRF3 degradering begynner etter 12 timer. Proteasome-mediert degradering vil bli avsluttet fra den observerte reduksjon av skjemaer III og IV nivåer på sene tidspunkter som er reversert i forhold med proteasomhemmere. Dette vil også oversette på mors-PAGE i en reduksjon av IRF3 dimer nivåer som er gjenvunnet på proteasominhibitor behandling 29. Viktigere, den høyoppløselige Technique presenteres her muliggjør å skille mellom nedbrytningsprosessen og en mangel på aktivering. Faktisk, både nedbrytning og mangelen på aktivering av IRF3 resultat i fravær av deteksjon av dimer / fosfo-Ser386 / 396. Men mangelen på aktivering er forbundet med påvisningen av IRF3 monomer og av former I og II, mens disse IRF3 artene ikke blir oppdaget når IRF3 degraderes 30.
Immunoutfelling kombinert med massespektrometri basert analyse er en metode for valg å påvise in vivo-fosforylering av IRF3 på forskjellige steder. Denne teknikken ble brukt til å bekrefte fosforylering av IRF3 på Ser173, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 og Ser402 rester 10,20,21. Imidlertid er massespektrometri ikke ennå en rimelig / benchside teknikk som lett kan brukes til daglig analyse av IRF3 aktivering etter flere stimuleringer på ulike tidspunkter. Derfor er fremgangsmåten som er beskrevet her ved hjelp av SDS-PAGE koblet med nativ-PAGE i kombinasjon med immunoblot bruker totalt og phosphospecific antistoffer utgjør en praktisk, rimelig og sensitiv tilnærming til å oppdage alle definerte former for Actived IRF3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
- Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
