Introduction
De alomtegenwoordig en constitutief uitgedrukt transcriptiefactor Interferon (IFN) Regulatory Factor 3 (IRF3) is van cruciaal belang voor de eerste verdedigingslinie tegen pathogenen voornamelijk door de inductie van IFNβ, maar ook door de inductie van de chemokine (CC-motief) ligand 5 (CCL5 ) en verscheidene antivirale eiwitten zoals IFN geïnduceerde eiwitten met tetratricopeptide herhaalt IFIT1 / 2/3 1-3. IRF3 activering werd gemeld na infectie met verschillende virussen, of blootstelling aan polyinosinic-polycytidylic acid (poly I: C) of lipopolysaccharide (LPS) 4. Belangrijker is, hebben de meeste bestudeerde virussen mechanismen ontwikkeld om de IRF3 gemedieerde respons te omzeilen, en daardoor ontsnappen aan de gastheer aangeboren afweer 5. Zo bewaken IRF3 activatie van groot belang te begrijpen van de moleculaire mechanismen van het aangeboren antivirale afweer, maar ook voor de door deze virussen reactie tegen strategie identificeren.
ent "> Veel gepubliceerde rapporten geven echter slechts een beperkte analyse van IRF3 activatie uitgevoerd door het volgen van IRF3-doelgen inductie (IFNB1 en IFIT1) en / of luciferase reportergen assay gekoppeld met lage resolutie natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS- PAGE) analyse van IRF3. evenwel talrijke biochemische studies, analyse van het gedrag van verschillende IRF3 mutanten en opheldering van IRF3 kristalstructuur 6-11 hebben bijgedragen IRF3 vast is onderworpen aan een complexe reeks opeenvolgende posttranslationele modificaties door fosforylatie bij meerdere plaatsen. De set van fosforylatie betrokken IRF3 activering wordt afhankelijk van de stimulus en hoogstwaarschijnlijk het celtype zijn. In niet-geïnfecteerde cellen, IRF3 coëxisteert als niet-gefosforyleerde en gehypofosforyleerde bevattende soorten phosphoresidues, waaronder Thr135 en Ser173, de 1 -198 aa N-terminale gebied 6,12-14. Ophoping van deze gehypofosforyleerde form van IRF3 wordt geïnduceerd door stress inducers, groeifactoren en DNA-beschadigende middelen 6. Fosforylering van Ser / Thr residuen aan het C-terminale gebied van IRF3 met het transactiveringsdomein wordt geactiveerd na activering door virussen, poly I: C of LPS in een celtype afhankelijke wijze 15-17. C-terminale fosforylering van IRF3 impliceert niet minder dan 7 verschillende phosphoacceptor locaties georganiseerd in twee clusters, Ser385 / Ser386 en Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, die elk bijdragen aan IRF3 activering door middel van dimerisatie, nucleaire accumulatie, associatie met het CREB -bindende eiwit (CBP) / p300 coactivatoren, DNA-bindende gevoelige respons element (ISRE) consensus sequenties en transactivatie van target genen 9,10,17-19 IFN. Fosforylering van Thr390 is ook gedacht om bij te dragen aan-virus-geïnduceerde IRF3 activering 20. Massaspectrometrie analyses van IRF3 hebben aangetoond dat Ser386, Thr390, Ser396 en Ser402 resten direct fosforylatieed door de remmer van KB-kinase ε (IKKε) /-TANK bindend kinase 1 (TBK1) kinasen 9,10. Fosforylering van het C-eindstandige resten is ook vereist voor beëindiging van IRF3 activering door middel polyubiquitinatie en proteasoom-afhankelijke afbraak 10. Deze werkwijze is ook afhankelijk van de fosforylatie van Ser339, die nodig is voor het aantrekken van de propyl isomerase Pin1 10,11. IRF3 species met tenminste fosfo-Ser339 / 386/396 residu's worden beschouwd gehyperfosforyleerd vormen. De exacte volgorde en de functie van elke site blijft een onderwerp van discussie 10,21. Het is nu duidelijk dat geactiveerd IRF3 vormt geen homogene staat, maar dat de verschillende geactiveerde soorten vertonen duidelijke fosforylering of dimerisatie kenmerken bestaan 10,22.Om een volledig begrip van IRF3 activering mogelijk in antwoord op specifieke pathogenen, is het dus noodzakelijk om characterize welke de geactiveerde species worden opgewekt. Inductie van IRF3 target genen, IFNB1 en IFIT1, heeft zich bewezen als een betrouwbare uitlezing voor IRF3 activering mogelijk maken. De controle expressie van deze genen geen onderscheid maakt tussen verschillende toestanden van activering IRF3. Een uitgebreide analyse van IRF3 activering staten in een bepaalde instelling is gebaseerd op de gedetailleerde karakterisering van de fosforylering en dimerisatie-status 10. Gefosforyleerde (formulier I), gehypofosforyleerde (vorm II) en hypergefosforyleerde (vormen III en IV) IRF3 vormen 6,18,23 succes kan worden opgelost door een verminderde mobiliteit in hoge-resolutie SDS-PAGE analyse. Monomeer en dimeer IRF3 soorten kunnen efficiënt worden geïdentificeerd door native-PAGE analyse. Deze benaderingen zijn sterk verbeterd bij gebruik in combinatie met fosfospecifiek antilichamen gericht tegen verschillende IRF3 phosphoacceptor sites.
Standaardprotocollen maken een slechte resolutie vaneiwitten die efficiënte scheiding van verschillende IRF3 gefosforyleerde vormen niet toestaat. Hier hebben we in vivo onderscheid tussen de verschillende geactiveerd in detail beschrijven een procedure om de hoogste resolutie bereiken de inductie van afzonderlijke-virus geactiveerd IRF3 soort, volgens SDS-PAGE gekoppeld met natieve PAGE in combinatie met immunoblot gebruikt totaal fosfospecifiek antilichamen te controleren. vormen van IRF3 wordt uitgevoerd op basis van hun mobiliteit verschuivingen waargenomen op SDS-PAGE. Bovendien kan IRF3 monomeer en dimeer worden onderscheiden door niet-denaturerende elektroforese. De combinatie van deze twee complementaire technieken met immunoblot blijkt een betaalbare en gevoelige benadering van alle nodige informatie voor een volledige analyse van fosforylering gemedieerde activering van IRF3 verwerven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het protocol wordt hier beschreven met behulp van A549 cellen geïnfecteerd met Sendai-virus (SeV). Echter, het protocol voor SDS-PAGE en inheemse PAGE werkt ook met alle menselijke en muizen celtypen dusver getest, met name myeloïde cellen gestimuleerd met diverse IRF3 activerende stimuli 9,15,19,24,25.
1. Infectie van A549 Cells
- Handhaaf A549 cellen in kweek in een 15 cm plaat bij 37 ° C / 5% CO 2 in 20 ml F12K / Ham medium dat 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HI-FBS) en 1% L-glutamine (compleet F12K / Ham gemiddeld).
OPMERKING: Alle gebruikt voor celkweek en behandelingen oplossingen moeten steriel zijn. - Op 24 uur voor de infectie, zuig het medium en spoelen van de cellen met 10 ml gedestilleerd fosfaat gebufferde zoutoplossing (D-PBS) bij kamertemperatuur.
- Voeg 1 ml van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing aan elke plaat om de cellen te bedekken en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 min.
- Stop de incubatie zodra the cellen beginnen te los te maken van de plaat door zachtjes de plaat tikken met één hand. Inactivatie van het trypsine door toevoeging van 10 ml van voorverwarmd compleet F12K / Ham medium per plaat en overbrengen van de cellen naar een 15 ml conische buis.
- Centrifugeren bij 350 g gedurende 3 min bij RT. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 8 ml compleet F12K / Ham medium tot een homogene enkele celsuspensie te verkrijgen.
- Tel de cellen met een hemocytometer. Zaad de cellen bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen per 60 mm plaat 4 ml voorverwarmd compleet F12K / Ham medium. Incubeer gedurende 20 - 24 uur bij 37 ° C / 5% CO 2. Na 20 - 24 uur, de cellen vormen een confluente monolaag 90% (dit komt overeen met 1,5 x 10 6 cellen).
- Verwijder het medium en spoelen van de cellen met 2 ml serumvrij F12K / Ham medium (SFM). Voeg 2 ml vers SFM per 60 mm plaat.
- Dooi een hoeveelheid van Sendai virus (SeV) (opgeslagen in porties bij -80 ° C) op ijs en vortex kort.
- Verdunnen the virus in voorverwarmde SFM tot 60 HAU / 100 ui te verkrijgen. Meng door op en neer pipetteren zacht en voeg 100 ul verdunde virusoplossing per plaat om de infectie te voeren op 40 HAU / 10 6 cellen. Do virus toe te voegen in de niet-geïnfecteerde stuurplaat.
- Incubeer de cellen in de incubator bij 37 ° C / 5% CO 2. Schud de platen met de hand 3 of 4 keer, of een automatisch orbitale of rocking shaker direct geplaatst in de incubator gedurende het eerste uur van de infectie.
- Op 2 uur na infectie, voeg 2 ml F12K / Ham medium dat 20% HI-FBS tot een uiteindelijke concentratie van 10% HI-FBS verkrijgen.
- Incubeer de cellen in de incubator bij 37 ° C / 5% CO 2 tegen 1, 4 en 7 uur tot totaal infectie keer bereiken van 3, 6 en 9 uur, respectievelijk. Op elk van deze tijdstippen, ga dan naar stap 2.1.
2. Voorbereiding van de volledige celextracten (WCE)
- Verwijder het infectiemedium. Oogst de cellen door schrapen in 1 mlijskoude D-PBS en breng de celsuspensie op een vooraf gekoelde 1,5 ml centrifugebuis.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 sec en zorgvuldig decanteer alle sporen van D-PBS.
Opmerking: In deze stap kan de celpellet direct worden onderworpen aan proteïne extractie of snel bevroren in vloeibare stikstof of droog ijs / ethanol bad en bij -80 ° C totdat lysis. - Bereid de lysis buffer bevattende 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% glycerol en 1% Nonidet P-40 in gedeïoniseerd water (DDH 2 O). Extemporarily voeg protease (1 ug / ml leupeptine en 2 ug / ml aprotinine) en fosfataseremmers (5 mM natriumfluoride, 1 mM geactiveerde natriumorthovanadaat, 2 mM p-nitrofenylfosfaat en 10 mM β-glycerofosfaat pH 7,5).
Opmerking: De lysisbuffer zonder remmers kunnen bij 4 ° C bewaard. Een specifiek protocol voor het activeren van natriumorthovanadaat wordt beschreven in de tabel van specifieke reagentia / Equipment. - Resuspendeer de celpellet in 70 ul lysisbuffer. Typisch de lysaat concentratie ongeveer 2 ug / ul zijn.
- Incubeer op ijs gedurende 20 min. Flash-bevriezen het lysaat door incubatie in een vloeibaar stikstof bad gedurende 15 sec. Ontdooi het lysaat bij KT totdat deze volledig gesmolten en vortex gedurende 10 seconden. Herhaal de vries / dooi / vortex cyclus 3 keer.
- Als alternatief, het uitvoeren van de bevriezing stap in een ethanol / droog ijsbad gedurende 1 min.
- Centrifugeer bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 min. Breng de bovenstaande vloeistof (overeenkomend met de WCE) om een nieuwe voorgekoelde 1,5 ml centrifugebuis. Houd de WCE op ijs te allen tijde.
- Kwantificeren eiwitten met elke eiwit kwantificatie procedure verenigbaar met de lysisbuffer zoals Bradford-assay 26 eiwitten.
3. Resolutie van WCE door met hoge resolutie SDS-PAGE
- Bereid drie denaturerende elektroforese gels.
- Voor de detectie vanIRF3 vormen, giet twee gels van minimaal 16 cm lang met een scheiding gel bestaande uit 7,5% acrylamide / bisacrylamide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS ), 1% ammoniumpersulfaat en 0,1% TEMED in DDH 2 O en stapelgel bestaande uit 4% acrylamide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% ammoniumpersulfaat en 0,1% TEMED in DDH 2 O.
Voorzichtigheid! Acrylamide, TEMED en SDS zijn giftig en / of irriterend. Draag beschermende handschoenen en manipuleren onder een zuurkast. - Voor de detectie van SeV eiwitten, giet een gel van ten minste 8,5 cm lengte met soortgelijke beschreven in 3.1.1, behalve dat de scheiding gel bevat 12% acrylamide gel kenmerken.
- Voor de detectie vanIRF3 vormen, giet twee gels van minimaal 16 cm lang met een scheiding gel bestaande uit 7,5% acrylamide / bisacrylamide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS ), 1% ammoniumpersulfaat en 0,1% TEMED in DDH 2 O en stapelgel bestaande uit 4% acrylamide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% ammoniumpersulfaat en 0,1% TEMED in DDH 2 O.
- Denatureren de WCE verkregen in stap 2.6 door toevoeging van 1: 4 (v / v) 5x laadbuffer (125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p / v) glycerol, 0,0005% broomfenolblauw en 25% β-mercaptoethanol in DDH 2 O), gevolgd door verwarming bij 100 °C gedurende 10 min. Snelle draai de buizen naar beneden de condensatie die zich vormt in de dop brengen.
Voorzichtigheid! β-mercaptoethanol toxisch bij inademing. Draag beschermende handschoenen en manipuleren onder een zuurkast. - Monteer de gels in de migratie apparaat. Vul het bovenste en onderste kamers met lopende buffer bevattende 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS en 192 mM glycine in gedestilleerd water (dH 2 O).
- Belasting 14 pi molecuulgewichtstandaard in een putje van elk 16 cm gel en 7 ui molecuulgewichtstandaard in een putje van 8,5 cm gel. Belasting 30 ug gedenatureerd WCE (bereid zoals beschreven in stap 3,2) per putje van de twee gels bereid in stap 3.1.1 IRF3 vormen detecteren. Load 8 - 10 ug gedenatureerd WCE (bereid zoals beschreven in stap 3.2) per well op bereid in stap 3.1.2 voor SeV-analyse gel.
- Voer de gels bij 30 mA constante stroom totdat de migratie achterkant onderkant van de gel bereikt.
OPMERKING: Migratie duurt meestal approximately 3 uur voor een 16 cm gel en 45 min bij 8,5 cm gel. - Ga verder met de overdracht naar nitrocellulose membranen (stap 5).
4. Analyse van IRF3 Dimerisatie van Native-PAGE
LET OP: Deze methode werd oorspronkelijk beschreven door de groep van Dr. T. Fujita 27.
- Bereid de bovenste (-) en onderste (+) kamer elektroforese buffers. De bovenkamer buffer bestaat uit 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), 192 mM glycine en 1% natriumdeoxycholaat (DOC) in DDH 2 O. De onderste kamer buffer bevat 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) en 192 mM glycine in DDH 2 O.
Opmerking: De bovenste en onderste kamer elektroforese buffers kunnen bij 4 ° C tot gebruik bewaard. Echter, zorg ervoor dat ze pre-opgewarmd tot RT voor het uitvoeren van de elektroforese. - Giet een niet-denaturerende gel oplossen van minimaal 8,5 cm lengte met 7,5% acrylamide / bisacrylamide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% ammonium persulfaat en 0,1% TEMED in DDH 2 O.
- Pre-run de gel bij 40 mA constante stroom gedurende 30 minuten op ijs. Druk de draaiende inrichting in het ijs bij benadering op het niveau van de onderste kamer elektroforesebuffer. Het is belangrijk dat de gel niet in het ijs.
- Tijdens de pre-run, meng WCE gehouden op ijs met 2x native-PAGE laadbuffer 1: 1 (v / v) met 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% glycerol en 0,1% broomfenolblauw in DDH 2 O.
- Load 8 - 10 ug WCE (bereid zoals beschreven in stap 4,4) onmiddellijk na afloop van de pre-run.
- Voer de gel bij 25 mA constante stroom op ijs, zoals hierboven beschreven voor de pre-run, totdat de migratie achterkant onderkant van de gel (ongeveer 40 min) bereikt.
5. Immunoblot analyse van IRF3 Species
- Bereid de overdracht buffer die 25 mM Tris-Base en 192 mM glycine in DDH 2 O. Koel de overdracht buffer bij 4 ° C vóór gebruik.
- Natte drie stukken nitrocellulosemembraan gesneden iets groter is dan de gels in een plastic / glazen kast met de overdrachtsbuffer. Geven de oriëntatie van het membraan door het snijden van een hoek. De transfer buffer kan 3 maal hergebruikt worden. Bewaar de buffer bij 4 ° C tussen toepassingen.
- Uncast de gels (SDS-PAGE en native PAGE) en knip één hoek van elke gel voor de juiste oriëntatie.
- Bij natieve PAGE, incubeer de gel bij kamertemperatuur onder zacht schudden gedurende ten minste 30 min in SDS-PAGE lopende buffer om de DOC verwijderen alvorens naar de overdrachtsbuffer.
- Incubeer de gels (SDS-PAGE en native-PAGE) in het overdrachtsbuffer gedurende 5 - 10 min.
- Monteer een transfer sandwich per gel in een transfer cassette met het membraan naar de positieve elektrode (schuim pad / filterpapier / membraan / gel / filter papier / foam pad). Wees voorzichtig om alle luchtbellen tussen de lagen van de sandwich verwijderd.
- Voer de overdracht zoals aanbevolen by de fabrikant voor de overdracht gebruikte apparatuur.
OPMERKING: Voer alle incubaties en wast in de volgende stappen op een schommelstoel of orbitale schudden platform. - Aan het einde van de overdrachtstijd, incubeer de membranen gedurende 15 min in fixatie oplossing bevattende 7% azijnzuur, 40% ethanol en 3% glycerol in DDH 2 O. Was de membranen 3 x 5 min in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na 2 HPO 4 en 1,8 mM KH 2PO 4 in dH 2 O).
Voorzichtigheid! Azijnzuur is giftig, irriterend en ontvlambaar. Draag beschermende handschoenen en manipuleren onder de zuurkast.
OPMERKING: De fixatie oplossing kan meerdere malen worden hergebruikt. - Voor de inheemse-PAGE membraan direct doorgaan naar stap 5.11.
- Snel spoelen drie SDS-PAGE membranen in dH 2 O vóór incuberen gedurende 1 min bij Ponceau rode oplossing bevattende 6,57 mM Ponceau rode en 1% azijnzuur in DDH 2 O.
OPMERKING: De rode ponceau oplossing kan r worden eused meerdere malen. - Spoel de membranen in dH 2 O, totdat de achtergrond is wit genoeg om de eiwitbanden gekleurd in het rood te zien. Let op de markeringen met een potlood en snijd de overtollige membraan rond de eiwitten. Destain de membranen door incubatie gedurende 5 min in PBS onder roeren.
- Incubeer de membranen gedurende 1 uur bij RT of O / N bij 4 ° C in de blockingbuffer (PBS met 0,05% Tween 20 en 5% magere melkpoeder (PBS-T-melk). Was de membranen 3 x 5 min in PBS-T.
Opmerking: De PBS-T wassen is optioneel en alleen strikt vereist bij het toepassen antilichamen verdund in PBS-T met 5% runderserumalbumine (PBS-T-BSA) (Figuur 1 en Tabel 1) bij de volgende stap. - Incubeer de vier membranen (van SDS-PAGE en natieve PAGE) met de primaire antilichamen volgens de volgorde beschreven in figuur 1 en tabel 1. Voer 5x 5 min wassingen in PBS-T.
Figuur 1. Sequentie van immunoblot analyses. Het schema beschrijft de individuele SDS-PAGE en natieve PAGE-gels nodig om de verschillende IRF3 gefosforyleerde en monomeer / dimeer vormen detecteren. De specifieke volgorde van antilichamen toegepast op het membraan verkregen uit elke gel in de immunoblot wordt beschreven. Merk op dat de anti-actine antilichamen eerst worden gebruikt om gelijke lading van de monsters te verzekeren voordat enige andere specifieke antilichamen. De alternatieve sequentie met anti-actine antilichamen worden toegepast na de anti-fosfo-IRF3 antilichamen, ook werkt. Strippen wordt gebruikt tussen anti-actine en anti-SeV antilichamen, of tussen anti-fosfo-IRF3 en anti-IRF3 antilichamen vanwege overlappende grootte van de signalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Primaire antilichamen | Verdunning | Verdunningsbuffer | Incubatie | Secundaire antilichamen | Opmerkingen |
| Anti-Actin | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | 15 min bij KT | Anti-muis | Gebruiken na SDS-PAGE Verdunde antibodyies kan meerdere keren worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C bij aanwezigheid van 0,02% natriumazide. |
| Anti-IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N bij 4 ° C | Anti-konijn | Gebruiken na Inheems-PAGE. Het is niet aan te raden om de verdunde antilichaam hergebruiken |
| Anti-IRF3-P-Ser396 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N bij 4 ° C | Gebruiken na SDS-PAGE. Het is niet aan te raden om opnieuw de verdunde antilichaam anti-IRF3-P-396 is ook verkrijgbaar bij Cell Signaling. Optimale verdunning werd gedefinieerd als 1 / 1.000 van dit antilichaam, maar kan variëren tussen partijen. | |
| Anti-IRF3-P-Ser398 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N bij 4 ° C | Anti-konijn | Gebruiken na SDS-PAGE. Het is niet aan te raden om de verdunde antilichaam hergebruiken |
| Anti-IRF3 volledige lengte | 1/7500 | PBS-T-melk | 3 uur bij KT | Anti-konijn | Gebruiken na SDS-PAGE. Anti-IRF3 antilichaam van volledige lengte kan worden gebruikt na natieve PAGE, maar is minder gevoelig voor de monomeer detecteren. Verdunde antilichamen kunnen meerdere malen worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C bij aanwezigheid van 0,02% natriumazide. |
| Anti-IRF3-NES | 0,5 ug / ml | PBS-T-melk | 3 uur bij KT | Anti-konijn | Gebruiken na Inheems-PAGE. Verdunde antibodyies kan meerdere keren worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C bij aanwezigheid van 0,02% natriumazide. |
| Anti-SeV | 1 / 14.000 | PBS-T-BSA | 3 uur bij KT | Anti-konijn | Gebruiken na SDS-PAGE. Verdunde antibodyies kan meerdere keren worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C bij aanwezigheid van 0,02% natriumazide. |
| OPMERKING: verdunning en buffer gebruikt voor de HRP-gekoppelde secundaire antilichamen moeten worden geoptimaliseerd als het varieert van het ene bedrijf naar het andere. | |||||
Tabel 1. Specificaties van antilichamen worden gebruikt in de Immunoblotting Procedure.
- Incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd secundaire antilichamen zoals beschreven in figuur 1 en tabel 1. Was de membranen 5x 5 min in PBS-T, vervolgens 2 x 5 min in PBS om sporen Tween volledig te verwijderen.
- Incubeer de membranen gedurende 1 min in een volume van versterkte chemiluminescentie reagens voldoende doorgronden van de membranen. Droog de membranen met filterpapier.
- Plaats de membranen in een afbeelding lichtgevende analyser aan de immunoreactieve bands visualiseren.
- Als alternatief, het uitvoeren van de detectie van immunoreactieve banden met gevoelige X-Ray films.
- Was de membranen 3x 5 min in PBS.
Opmerking: In deze stap de membranen droog kan worden gehouden. Indien verder strippen nodig is, is het beter om het strippen uitgevoerd vóór het drogen van het membraan. Membranen kunnen ook worden opgeslagen op korte termijn in PBS. - Voor de membranen die niet nodig strippen tussen incubatie met antilichamen (zie figuur 1) ga dan naar stap5.20.
- Wanneer het strippen nodig is tussen antilichamen (zie figuur 1), incubeer de membranen in voorverwarmde stripping oplossing die 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) en 0,7% β-mercaptoethanol in DDH 2 O bij 50 ° C gedurende 20 min onder regelmatig roeren. Was de membranen 3x 5 min in PBS.
OPMERKING: Roeren tijdens het strippen procedure is de sleutel. Strippen kan worden uitgevoerd in een hybridisatie oven. Alternatief strippen kan worden uitgevoerd met membranen afgesloten in plastic zakken en ondergedompeld in een waterbad. In dit geval is het belangrijk om de membranen te roeren 4 - 5 keer tijdens de incubatie. - Incubeer de membranen gedurende 1 uur bij RT of O / N bij 4 ° C in PBS-T-melk.
- Herhaal stap 5,12 tot 5,16 volgens figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een typisch beeld van immunoblot IRF3 gedetecteerd met IRF3 totale antilichamen en IRF3-fosfospecifiek antilichamen tegen Ser396 en Ser398 na resolutie van WCE door een hoge-resolutie SDS-PAGE Figuur 2 toont. In ongestimuleerde A549 cellen, wordt IRF3 gedetecteerd als twee banden op 50 en 53 kDa op SDS-PAGE die overeenkomen met de niet-gefosforyleerd (vorm I) en de gehypofosforyleerde (vorm II) soorten IRF3. Blootstelling van A549 cellen SEV voor 3-9 uur resulteert in een tijdsafhankelijke shift langzaam migrerende hypergefosforyleerd vormen III en IV, die goed onderscheiden van de vormen I en II. De hypergefosforyleerde bands migreren op 55-57 kDa. De vormen III en IV zijn ook specifiek immunologisch met de fosfospecifiek antilichamen tegen Ser396 en Ser398. De immunodetectie van actine dient als controle van gelijke belasting tussen de rijstroken. Een controle van SeV infectie wordt aangetoond door de accumulatie van het virus nucleocapside pProtein (N), die migreert bij 60 kDa.
In figuur 3 is het profiel van de detectie van IRF3 verkregen uit WCE gescheiden door natieve PAGE gevolgd door immunoblot behulp van anti-IRF3 NES-antilichamen en antilichamen tegen fosfospecifiek Ser386 weergegeven. In ongestimuleerde A549 cellen, wordt IRF3 gedetecteerd als een enkele band die overeenkomt met de monomere vorm. Na infectie met SeV voor 3-9 uur, het gehalte aan monomeer IRF3 af met een gelijktijdige accumulatie van een langzamer migrerende band die overeenkomt met de dimere vorm van IRF3. De fosfospecifiek antilichamen tegen Ser386 alleen IRF3 dimeer soorten op te sporen.
Figuur 2. Detectie van Verschillende IRF3 Gefosforyleerde Species (formulier I-IV) geïnduceerd door SeV infectie in A549-cellen. A549-cellen werden niet-geïnfecteerde links of geïnfecteerd met SeV de indicated tijden. WCE werden geanalyseerd met hoge resolutie SDS-PAGE gevolgd door immunoblot (IB) met behulp van anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) en anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) fosfospecifiek antilichamen en anti -IRF3 volledige lengte eiwit antilichamen. De infectie werd gevolgd met behulp van anti-SeV-antilichamen (het nucleocapside N eiwit wordt getoond). Anti-actine antilichamen werden gebruikt als een laad controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Controle van gefosforyleerd / gedimeriseerd IRF3 inductie van SeV in A549 cellen. A549-cellen werden ongeïnfecteerde links of geïnfecteerd met SeV gedurende de aangegeven tijden. WCE werden opgelost door native-PAGE en onthuld door immunoblot met behulp van anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) fosfospecifiek antilichamen en anti-IRF3-NES ANTIBOdies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol beschrijven we hier bestaat uit een combinatie van hoge-resolutie SDS-PAGE en natieve PAGE gekoppeld aan het gebruik van verschillende fosfospecifiek antilichamen tegen het monomeer / dimeer en phosphoforms I-IV van IRF3 onderscheiden. Geschikte detectie van deze IRF3 soort is essentieel om volledig te karakteriseren IRF3 activering in een specifieke instelling. Bijvoorbeeld, LPS stimulatie van geactiveerde macrofagen leidt tot de vorming van dimere, Ser396 / 398 gefosforyleerd IRF3 een gehypofosforyleerde (vorm II) vertoont, maar niet hypergefosforyleerd (vorm III en IV) patroon in SDS-PAGE 15. Met behulp van de beschreven protocol, kan dit profiel worden onderscheiden van virus geïnduceerde hypergefosforyleerd vormen de extra Ser339 fosforylering naast Ser386 en Ser396 fosforylering 10 vereisen. Belangrijk is dat deze ook onderscheid maakt tussen Ser396 gefosforyleerde soorten die niet vertonen dimerisatie, maar zijn transcriptioneel actief 10. Importantly, dient te worden opgemerkt dat de vorm I-IV patroon IRF3 phosphoforms toegepast op menselijke IRF3. Murine IRF3 geen soortgelijke patroon en derhalve activatie van IRF3 kenmerkt vertoont alleen het gebruik van fosfospecifiek antilichamen in immunoblot na SDS-PAGE en door natieve PAGE.
Het bereiken van een hoge resolutie scheiding van de verschillende gefosforyleerde soorten IRF3 door SDS-PAGE vereist specifieke parameters. Voor passende oplossing, is het zeer belangrijk om gels die een minimale periode van 16 cm gebruikt. Zelfs met deze lengte scheiding gel, is het belangrijk te laten de migratie achterkant onderkant van de gel bereikt een passende scheiding van de verschillende vormen IRF3 verkrijgen. Ook moet de stacking gel uitstrekken tot ten minste 1 cm onder de kam aan welbepaalde banden te verkrijgen. Dit is belangrijk, omdat de hypergefosforyleerde vorm van IRF3 migreren zeer dicht bij elkaar. Slecht gerichte bands zal resulteren in een gebrek aan onderscheid tussen phosphorylated vormt afbreuk hun kwantificering. Bovendien is de concentratie ammoniumpersulfaat en TEMED verschillen van SDS-PAGE protocol naar een andere. Variatie in deze concentraties van de hier vermelde bleek aanzienlijk afbreuk de resolutie bij de scheiding van de IRF3 species.
Detectie van IRF3 dimeervorming door de native-PAGE werd oorspronkelijk beschreven door de groep van Dr. T. Fujita. Dit protocol maakt gebruik van buffer die DOC dat de dissociatie van het dimeer IRF3 van CBP / p300 27 toestaat. Het wordt sterk aanbevolen om naar natieve PAGE onmiddellijk na cellysis de opslag van de WCE bij -80 ° C bleek te resulteren in een aanzienlijke wijziging van de IRF3 monomeer / dimeer ratio. Bovendien is het zeer belangrijk dat de pH van de bovenste en onderste kamer buffers op pH 8,4 bij kamertemperatuur, en niet bij 4 ° C na mengen alle onderdelen behoorlijke het monomeer dimeer vs bereiken. Een scheidinggel met een minimale lengte van 8,5 cm maakt het mogelijk passende scheiding van IRF3 monomeer en dimeer. De ideale monstervolume plus laadbuffer ongeveer 8 ul van een 5 mm en de resolutie beter is als het volume wordt tot een minimum beperkt. Het is dus belangrijk om de laagste hoeveelheid lysis buffer om WCE te verkrijgen met een hoge concentratie. Er moet echter rekening mee dat doeltreffende lysis vereist eiwitextractie ten minste 5x het volume van de celpellet genomen. Als het volume van de monsters de bovengenoemde limiet overschrijdt, zal dit tot slechte resolutie van het monomeer / dimeer. Dit kan worden opgelost door toevoeging van een stacking gel met 4% acrylamide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 1% ammoniumpersulfaat en 0,1% TEMED in DDH 2 O. Het is zeer belangrijk om de samples zonder storende strepen. Langzaam laden met een gel-lading-punt nabij de bodem van de put geeft zeer goede resultaten.
Hier beschrijven we de in vivo Detectie van fosforylering op specifieke resten met de thans beschikbare fosfospecifiek antilichamen tegen Ser386 9, 19 Ser396 en Ser398 15. Het gebruik van IRF3 mutanten en massaspectrometrie analyses hebben bevestigd dat deze resten zijn gefosforyleerd op virusinfectie of overexpressie van IKKε / TBK1 kinases en zijn van cruciaal belang voor IRF3 activering 6,9,10,19,21. De immunodetectie fosfo-Ser396, fosfo-Ser398 en totale IRF3 na SDS-PAGE vereist het gebruik van twee identieke gels (figuur 1). Inderdaad is aanzienlijk minder gevoelig waargenomen wanneer fosfospecifiek antilichamen worden gebruikt na het strippen van de membraan. Daarom is het sterk aan te raden om fosfospecifiek antilichamen eerst gebruiken. Merk op dat alternatieve primaire en secundaire antilichamen kunnen ook werken, maar de specifieke verdunningen en de volgorde van het gebruik moet worden geoptimaliseerd. Voor IRF3 analyse 30 ug WCE geschikt is om een significante detectie van IRF3 verkrijgenfosforylering door immunoblot met de aangegeven antilichamen bij gebruik van 4 mm breed putjes. Hoewel in veel celtypen geïnfecteerd met verschillende virussen 30 ug bleek juist is, kan dit bedrag moet worden verhoogd, afhankelijk van celtype en stimulatie. Het verdient de voorkeur verse extracten gebruikt voor SDS-PAGE, maar de detectie van fosforylatie IRF3 met de fosfospecifiek antilichamen beschreven in dit document is stabiel genoeg om een ronde van opslag van de WCE bij -80 ° C voor analyse mogelijk. De concentraties van fosfataseremmers beschreven bleken voldoende te zijn bij het gebruik van A549 cellen. Hogere concentraties bleken geen betere resultaten op. Echter, deze concentraties zou moeten worden verhoogd bij het bestuderen IRF3 activering in celtypen die hogere fosfatase activiteit vertonen. Belangrijk is dat de fosforylering van IRF3 en de onderliggende mechanismen zijn nog lang niet begrepen. Daarom is een volledig panel van Ser / Thr en Tyr-fosfatasehibitors gebruikt om mogelijke activiteiten nog niet gekarakteriseerd dat de detectie van IRF3 fosforylering, dimerisatie en degradatie invloed kunnen blokkeren. Voor detectie van IRF3 monomeer en dimeer nadat de meeste virusinfecties en in de meeste celtypes, 8 - 10 pg WCE werd gevonden voldoende. Echter, kunnen grotere hoeveelheid eiwitten vereist voor het activeren van stimulering IRF3 minder efficiënt. De fosfospecifiek antilichamen tegen Ser386 in deze studie wordt aanbevolen voor gebruik in natieve PAGE de gevoeligheid in denaturerende SDS-PAGE is zeer zwak. Bovendien is de fosforylering van Ser386 voorgesteld correleren met de dimere vorm van IRF3 9, waardoor het gebruik van deze antilichamen in natieve PAGE de strategie om dit concept een bepaalde instelling te bevestigen. Van de nota, alternatieve antilichamen zijn verkrijgbaar bij verschillende bedrijven en worden geclaimd om efficiënt detecteren fosfo-Ser386 na SDS-PAGE. Fosfospecifiek antilichamen tegen Ser396 ook efficiënt u beensed om IRF3 fosforylering sporen na native PAGE 20. Belangrijk Ser402 in de C-terminale groep van phosphoacceptor plaatsen werd ook gevonden belangrijk IRF3 activering en fosforylering van Ser402 werd waargenomen door massaspectrometrie analyse van IKKε /-TBK1 gefosforyleerd IRF3 10,21,28 te zijn. Ondanks twee pogingen (NG, ongepubliceerd) geen fosfospecifiek antilichamen beschikbaar om de fosforylering van deze specifieke residuen in vivo volgen. Merk op dat fosfospecifiek antilichamen tegen Thr157 en Ser339 zijn ook beschreven 11,13. Deze extra fosfospecifiek antilichamen kunnen worden gebruikt in een werkwijze van hoge-resolutie SDS-PAGE vergelijkbaar met degene beschreven. In dit geval zouden aanvullende grote SDS-PAGE gels worden voor elke antilichaam en verwerkt op dezelfde manier als gel # 2 (Figuur 1). Voor zover wij weten geen fosfospecifiek antilichamen tegen Ser173 of Thr390 zijn nog niet beschreven,maar ze kunnen gemakkelijk worden toegevoegd aan de hier beschreven zodra deze beschikbaar worden 14,20 protocol.
IRF3 activiteit wordt beëindigd door proteasoom-gemedieerde afbraak van gehyperfosforyleerd vormen 11,17. De hier beschreven protocol maakt ook de controle op IRF3 afbraak wanneer de kinetische stimulatie wordt verlengd en is gekoppeld met het gebruik van proteasoom-remmers (MG132, lactacystine of bortezomid). Kenmerkend in A549 cellen geïnfecteerd met SeV aan 40 HAU / 10 6 cellen, IRF3 fosforylatie begint zodra 2 uur na SeV infectie en IRF3 afbraak start na 12 uur. Proteasoom-gemedieerde degradatie zal uit de waargenomen vermindering van formulieren III en IV niveaus op late tijdstippen dat is omgekeerd in omstandigheden met proteasoomremmers worden gesloten. Dit zal ook vertaalt op inheemse-pagina in een vermindering van IRF3 dimeer niveaus die worden teruggewonnen bij proteasoomremmer behandeling 29. Belangrijk is dat de hoge-resolutie Technique hier gepresenteerde maakt onderscheid te maken tussen het afbraakproces en een gebrek aan activering. Inderdaad, zowel aantasting en het gebrek aan activering van IRF3 resultaat bij afwezigheid van detectie van dimeer / fosfo-Ser386 / 396. Echter, het gebrek aan activering is geassocieerd met de detectie van IRF3 monomeer en vormen I en II, terwijl deze IRF3 vissoorten worden gedetecteerd wanneer IRF3 wordt afgebroken 30.
Immunoprecipitatie gekoppeld aan massa spectrometrische analyse is een voorkeursmethode om de in vivo fosforylatie van IRF3 detecteren verschillende plaatsen. Deze techniek werd gebruikt om de fosforylering van Ser173 in IRF3, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 en Ser402 bevestigen residuen 10,20,21. Echter, massaspectrometrie nog geen betaalbaar / benchside techniek die gemakkelijk kan worden gebruikt voor de dagelijkse analyse van IRF3 activering na verschillende prikkels op verschillende tijdstippen. Daarom is de procedure hier beschreven met behulp van SDS-PAGE gekoppeld aan native-PAGE in combinatie met immunoblot met behulp van totale en fosfospecifiek antilichamen vormt een praktische, betaalbare en gevoelige benadering van alle op dit moment omschreven vormen van actived IRF3 detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
- Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
