Introduction
在无处不在和组成性表达的转录因子，干扰素（IFN）调节因子3（IRF3）是防御病原体的第一道防线主要是通过IFNβ的诱导是关键，也可通过诱导趋化因子（CC基序）配体5（CCL5 ）和几个抗病毒蛋白，包括干扰素诱导蛋白与tetratricopeptide重复IFIT1 / 2/3 1-3。 IRF3活化已经报道以下感染与众多的病毒，或暴露于聚肌胞苷酸（聚I：C）或脂多糖（LPS）4。重要的是，研究得最多的病毒已经进化机制以逃避IRF3介导的反应，从而逃避宿主先天免疫防御5。因此，监控IRF3的激活是非常重要的，了解先天抗病毒宿主防御的分子机制，而且要确定使用病毒来抵消这种应对策略。
ENT“>许多公开的报道然而提供通过IRF3靶基因诱导的监视（IFNB1和IFIT1）进行IRF3活化和/或萤光素酶报告基因检测耦合到低分辨率十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的仅有限分析（SDS- PAGE）IRF3的分析，然而，大量的生化研究，各种IRF3突变体和IRF3晶体结构6-11的阐明的行为的分析有助于确定该IRF3是在经受了一组连续的翻译后修饰复合物磷酸化多个站点，设置的磷酸化参与IRF3活化似乎依赖于刺激，最有可能在细胞类型，在未感染的细胞，IRF3共存含有phosphoresidues，包括Thr135和Ser173非磷酸化和低磷酸物种，在1 -198氨基酸N-末端区域6,12-14。这种低磷酸的F积累IRF3的ORM由应力诱导剂，生长因子和DNA损伤剂6诱导。丝氨酸/苏氨酸残基在含有激活域IRF3的C末端区域的磷酸化触发由病毒以下激活，聚I：C或脂多糖以细胞类型依赖性15-17。 IRF3的C末端的磷酸化涉及组织在两个主要簇，Ser385 / Ser386和Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405不低于7不同磷酸受体位点，每一个有助于IRF3活化通过二聚化，核积累，与CREB关联结合蛋白（CBP）/ P300共激活因子，DNA结合干扰素敏感反应元件（ISRE）共有序列和靶基因9,10,17-19的转录。 Thr390的磷酸化也被认为有助于病毒诱发IRF3激活20。 IRF3的质谱分析表明，Ser386，Thr390，Ser396和Ser402残基直接phosphorylat由κB激酶ε抑制剂（IKKε）ED / TANK结合激酶1（TBK1）激酶9,10。 也需要通过泛素化和蛋白酶体介导的降解10终止IRF3活化的磷酸化的C末端残基。这个过程也依赖于磷酸化的Ser339，这是必要的丙基异构酶的Pin1 10,11的募集。至少含有磷酸化Ser339 /三百九十六分之三百八十六残留IRF3的物种被认为是过度磷酸化形式。每个站点的确切序列和功能保持的讨论10,21的问题。这是现在很清楚，激活IRF3并不代表均匀状态，但不同的活性粒子表现出明显的磷酸化或二聚化特征存在10,22。提供IRF3活化的完整理解响应于特定的病原体，因此，有必要为characterize该活性物质种类的被诱导。诱导IRF3的靶基因，IFNB1和IFIT1，已被证明是提供了可靠的读出了IRF3激活。然而，监测这些基因的表达不IRF3的不同的激活状态之间进行区分。对IRF3的激活状态在一个特定的环境进行综合分析依赖于它的磷酸化和二聚化状态10的详细特征。磷酸化（I型），低磷酸（II型）和过度磷酸化（形式III和IV）IRF3形式6,18,23可以成功地通过减少流动性高的分辨率SDS-PAGE分析解决。单体和二聚体IRF3种可以有效地确定本地-PAGE分析。组合使用用针对不同IRF3磷酸受体位点磷酸化特异性抗体时，这些方法都大大提高。
标准协议允许的分辨率差蛋白质不允许不同IRF3磷酸化形式有效分离。在这里，我们详细描述了一种方法来实现的最高分辨率监视使用SDS-PAGE连接到本地-PAGE结合免疫使用完全和磷酸化抗体不同的病毒激活IRF3品种的诱导，在体内不同的激活之间的歧视IRF3的形式是基于它们在SDS-PAGE观察到的迁移率的变化进行的。此外，IRF3单体和二聚物可以通过非变性电泳加以区别。与免疫印迹这两个互补技术的结合被证明是一个负担得起的和敏感的方式来获取所有必要的信息IRF3的磷酸化介导的激活的全面分析。
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Protocol
注：该协议是这里描述使用感染了仙台病毒（SeV载体）A549细胞。然而，该协议用 于SDS-PAGE和变性PAGE也与迄今测试的所有人类和小鼠细胞类型，与各种IRF3活化刺激9,15,19,24,25刺激特别骨髓细胞。
1.感染A549细胞
- 维持A549细胞在培养中有15厘米板在37℃/ 5％CO 2在20毫升含10％热灭活的胎牛血清（HI-FBS）和1％L-谷氨酰胺的F12K /火腿培养基（完全F12K /火腿中）。
注：所有用于细胞培养和处理的溶液必须是无菌的。 - 在感染前24小时，吸出培养基，并用10毫升蒸馏水磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）在室温洗细胞。
- 加入1毫升0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液，以每块板以覆盖细胞和在37℃下3分钟。
- 只要第停止孵育E细胞开始从平板上通过轻轻敲击板用一只手分离。通过加入10ml每板预热完成的F12K /火腿介质灭活胰蛋白酶，将细胞转移到15ml锥形管中。
- 离心在350×g离心3分钟，在RT。除去上清液和重悬细胞沉淀于8ml完全F12K /火腿介质以得到一种均一的单细胞悬浮液。
- 计数使用血球细胞。种子细胞以每60毫米平板1×10 6个细胞在4毫升预热的完整的F12K /火腿介质的密度。孵育20 - 24小时，在37℃/ 5％CO 2，在20 - 24小时，将细胞形成90％汇合单层（这对应于1.5×10 6个细胞）。
- 除去培养基并用2ml无血清的F12K /火腿培养基（SFM）洗细胞。加入2毫升按每60kg毫米的钢板新鲜SFM。
- 在冰上和旋涡解冻仙台病毒（SeV载体）（存储等分在-80℃）的等分试样简要。
- 稀日病毒在预热SFM获得60 HAU / 100微升。通过上下吹打轻轻混合，并添加100微升每平板稀释病毒在40 HAU / 10 6个细胞进行感染。不要在非感染的对照板添加病毒。
- 孵育细胞在培养箱中在37℃/ 5％CO 2。用手搅动板3或4次，或使用自动轨道或摇床上直接在培养箱放置，感染的第一个小时期间。
- 在2小时后感染，加入2毫升含有20％的HI-FBS，以获得10％的HI-FBS的最终浓度的F12K /火腿培养基。
- 孵育细胞在培养箱中在37℃/ 5％CO 2的额外的1个，4个和7小时达到3,6，和9小时的总感染倍。在所有这些时间点，继续执行步骤2.1。
2.制备的全细胞提取物（WCE）
- 取出感染的媒介。通过刮除在1ml收获细胞冰冷的D-PBS和的细胞悬浮液转移到预冷的1.5毫升离心管中。
- 沉淀细胞离心16000 xg离心在4℃下20秒，小心地倒出的D-PBS的所有痕迹。
注：在此步骤中，将细胞沉淀，可直接进行蛋白质提取或快速冷冻在液氮或干冰/乙醇浴中并储存在-80℃直至溶解。 - 制备含有50mM HEPES pH 7.4的，150 mM氯化钠，5mM的EDTA，10％甘油和1％的Nonidet P-40的去离子水中的溶解缓冲液（DDH 2 O的）。即席添加蛋白酶（1μg/ ml的亮抑酶肽和2微克/ ml抑肽酶）和磷酸酶抑制剂（5mM的氟化钠，1mM的活化的原钒酸钠，2mM的磷酸对硝基苯酯和10mMβ甘油pH7.5）中。
注：无抑制剂的裂解缓冲液可以储存于4℃。对于原钒酸钠激活特定协议的具体试剂/ Equipme的表中描述NT。 - 重悬在70微升裂解缓冲液的细胞沉淀。通常，裂解物浓度将约为2微克/微升。
- 冰上孵育20分钟。闪冻裂解物温育在液氮浴中15秒。解冻溶胞产物在室温下，直到它完全熔化并涡旋10秒。重复冷冻/融化/涡流循环3次。
- 可替代地，1分钟进行在乙醇/干冰浴冷冻步骤。
- 离心机在16000 xg离心在4℃下20分钟。将上清液转移（对应于WCE）到一个新的预冷的1.5毫升离心管中。置于冰上的WCE在任何时候。
- 量化使用与所述裂解缓冲液如布拉德福德基于蛋白测定26兼容的任何蛋白质定量过程的蛋白质。
通过SDS-PAGE高分辨率3.分辨率WCE的
- 准备3变性电泳凝胶。
- 为检测IRF3形式，倒入至少16厘米长度的两个凝胶为7.5％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺组成的分离凝胶（37.5：1），375毫摩尔Tris-盐酸pH值8.8（RT），0.1％十二烷基硫酸钠（SDS ），1％过硫酸铵和0.1％TEMED在DDH 2 O的和4％丙烯酰胺构成的积层凝胶，62.5毫的Tris-HCl pH 6.8的（RT），0.05％SDS，1％过硫酸铵和0.1％TEMED在双蒸2 O.
警告！丙烯酰胺，TEMED和SDS是有毒和/或有刺激性。戴防护手套，并在通风橱操作。 - 为SeV载体蛋白的检测，倒最少8.5厘米长，类似于在3.1.1中描述，不同之处在于在分离凝胶含有12％丙烯酰胺凝胶的特性之一的凝胶。
- 为检测IRF3形式，倒入至少16厘米长度的两个凝胶为7.5％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺组成的分离凝胶（37.5：1），375毫摩尔Tris-盐酸pH值8.8（RT），0.1％十二烷基硫酸钠（SDS ），1％过硫酸铵和0.1％TEMED在DDH 2 O的和4％丙烯酰胺构成的积层凝胶，62.5毫的Tris-HCl pH 6.8的（RT），0.05％SDS，1％过硫酸铵和0.1％TEMED在双蒸2 O.
- 通过加入1变性在步骤2.6中得到的WCE：4（V / V）5×上样缓冲液（125毫摩尔Tris-盐酸pH为6.8（RT），10％的SDS，20％（P / V）甘油，0.0005％溴酚蓝和接着在100℃加热25％β巯基乙醇在DDH 2 O的）下进行10分钟。快速离心管，以降低形成在盖的缩合。
警告！ β巯基乙醇是由吸入有毒。戴防护手套，并在通风橱操作。 - 安装在迁移装置中的凝胶。填充运行含有25mM Tris碱，0.1％SDS和192毫甘氨酸在蒸馏水（DH 2 O）的缓冲器中的上和下腔室。
- 负载14微升分子量标准在每16个厘米凝胶的一个孔和7微升分子量标准中的8.5厘米凝胶的一个孔中。变性WCE的负载30微克（其制备如步骤3.2中所述）中为IRF3形式检测步骤3.1.1制备的两种凝胶的每孔。负载8 - 变性WCE的10微克（其制备如步骤3.2中所述），每孔在为SeV的分析步骤3.1.2制备的凝胶。
- 运行的凝胶在30 mA的恒定电流，直到迁移前沿到达凝胶的底部。
注：迁移一般持续approximately 3小时为16厘米凝胶和45分钟为一个8.5厘米的凝胶。 - 继续进行到转印到硝酸纤维素膜上（步骤5）。
IRF3二聚本地人-PAGE 4.分析
注：此方法最初是由一群T.藤田博士27的描述。
- 制备的上（ - ）和下（+），腔室电泳缓冲液。上部腔室缓冲液由25mM的Tris-盐酸pH值8.4（RT），192毫甘氨酸和1％脱氧胆酸钠（DOC）中的双蒸2 O.下部腔室缓冲液含有25mM的Tris-盐酸pH值8.4（RT）和192毫甘氨酸在双蒸2 O.
注：上，下腔室电泳缓冲液可以储存在4℃直至使用。但是，请确保它们预温至室温进行电泳之前。 - 倾至少含有7.5％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）8.5厘米长的非变性分离胶，375毫的Tris-HCl pH值8.8（RT）下，1％的弹药鎓过硫酸盐和0.1％TEMED在双蒸2 O.
- 运行前在40mA的恒定电流将凝胶在冰上30分钟。按运行装置成冰大约到下室电泳缓冲液的水平。重要的是，该凝胶是不是在冰上。
- 在预运行，混合WCE保持在冰上用2×天然-PAGE上样缓冲液1：1（体积/体积）含125毫摩尔Tris-盐酸pH为6.8（RT），30％甘油和0.1％溴酚蓝在双蒸2 O.
- 负载8 - 10微克WCE（如在步骤4.4中所述制备）在紧接在预运行结束。
- 运行凝胶在冰上25毫安恒定电流，如上述的预运行，直到迁移前沿到达凝胶（约40分钟）的底部。
IRF3种5.免疫印迹分析
- 制备含25毫米的Tris-Base和192毫米甘氨酸双蒸2 O传输缓冲区在冷藏，使用前4℃下传输缓冲区。
- 湿三块硝酸纤维素膜切成大小小于在包含转移缓冲液的塑料/玻璃盒凝胶稍大。表明该膜的通过切割一个角的取向。传送缓冲器可重复使用3次。存储缓冲区，在4℃使用C之间。
- Uncast凝胶（SDS-PAGE和天然-PAGE）和切断每个凝胶正确方向的一个角。
- 对于本机-PAGE在室温下孵育凝胶温和搅拌，在SDS-PAGE电泳缓冲液的至少30分钟传送到传送缓冲器之前移除的DOC。
- 孵育在转移缓冲液的凝胶（SDS-PAGE和天然-PAGE）中5 - 10分钟。
- 装入每凝胶转印三明治与朝向正极（泡沫垫/滤纸/膜/凝胶/滤纸/泡沫垫）的膜的转印带盒。小心删除所有气泡夹心层之间。
- 执行转移的建议by中的制造商所用的传送装置。
注：执行摇动或轨道振荡平台在接下来的步骤中所有的孵育和洗涤。 - 在转移时间结束时，孵育所述膜为含有双蒸2 O 7％乙酸，40％乙醇和3％甘油中固定溶液15分钟洗涤该膜在PBS 3×5分钟（137毫摩尔NaCl，2.7毫米氯化钾，10.2毫的 Na 2 HPO 4和1.8毫KH 2 PO 4在卫生署2 O）。
警告！醋酸是有毒，有刺激性，易燃。戴防护手套和通风橱下操作。
注：固定溶液可以重复使用多次。 - 对于本地-PAGE膜直接进行步骤5.11。
- 在含在双蒸2 O 6.57毫红色丽春红和1％乙酸红色丽春红溶液孵育他们1分钟前在的dh 2 O快速冲洗三SDS-PAGE上的膜
注：红色的丽春解决方案可为R eused数次。 - 在冲洗卫生署2 O膜，直至背景是白色的，足以看出染红蛋白带。注意用铅笔标记和切口周边蛋白质的过量膜。脱色膜温育5分钟的PBS下搅拌。
- 在室温下孵育或O / N的膜1小时，在4℃下在封闭溶液（含0.05％吐温20和5％脱脂干牛奶的PBS（PBS-T-牛奶）洗涤膜3×5分钟在PBS-T。
注：PBS-T中洗涤是可选的，并且仅施加稀释在含有5％牛血清白蛋白（PBS-T-BSA）（ 图1和表1）在下一步骤PBS-T抗体时严格要求。 - 根据顺序在图1和表1详细描述与第一抗体孵育的四个膜（由SDS-PAGE和天然-PAGE）。在PBS-T进行5×5分钟洗涤。
图1的序列的免疫印迹分析的的概略说明，以检测各种IRF3磷酸和单体/二聚体形式中需要的各SDS-PAGE和天然-PAGE凝胶。应用于从免疫印迹程序中的每个凝胶所得的膜的抗体的具体顺序进行说明。注意，抗肌动蛋白抗体用于第一至确保在应用任何其他特异性抗体前，样品的相等的加载。交替序列，用抗肌动蛋白抗体的抗 - 磷酸抗体IRF3之后被应用，也适用。剥离用于抗肌动蛋白和抗西弗抗体，或抗磷酸化IRF3因为重叠的信号大小的抗IRF3抗体之间。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 一抗 | 稀释 | 稀释缓冲液 | 孵化 | 二抗 | 评论 |
| 抗肌动蛋白 | 1 / 10,000 | PBS-T-BSA | 在室温15分钟 | 抗小鼠 | 使用SDS-PAGE后， 稀释antibodyies可重复使用好几次，如果保存在4℃下在0.02％的叠氮化钠的存在。 |
| 抗IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N在4℃ | 抗兔 | 本地-PAGE后使用。 这是不建议重用稀释的抗体 |
| 抗IRF3-P-Ser396 | 1 / 10,000 | PBS-T-BSA | O / N在4℃ | SDS-PAGE后使用。 这是不建议重用稀释的抗体反IRF3-P-396也可自Cell Signaling。最佳稀释被定义为1 / 1,000此抗体，但也可以大量之间变化。 | |
| 抗IRF3-P-Ser398 | 1 / 10,000 | PBS-T-BSA | O / N在4℃ | 抗兔 | SDS-PAGE后使用。这是不建议重用稀释的抗体 |
| 反IRF3全长 | 1/7500 | PBS-T-乳 | 3小时在室温 | 抗兔 | SDS-PAGE后使用。抗IRF3全长抗体可用于后天然-PAGE上，但它是较不敏感的检测单体。稀释抗体可以重复使用多次，如果储存在4℃下在0.02％的叠氮化钠的存在。 |
| 抗IRF3-NE小号 | 0.5微克/毫升 | PBS-T-乳 | 3小时在室温 | 抗兔 | 本地-PAGE后使用。稀释antibodyies可重复使用好几次，如果保存在4℃下在0.02％的叠氮化钠的存在。 |
| 反西弗 | 1/14000 | PBS-T-BSA | 3小时在室温 | 抗兔 | SDS-PAGE后使用。稀释antibodyies可重复使用好几次，如果保存在4℃下在0.02％的叠氮化钠的存在。 |
| 注 ：稀释和缓冲器用于HRP偶联的第二抗体需要，因为它从一个不同的公司到另一个进行优化。 | |||||
用在免疫印迹过程表1.抗体的规格。
- 孵育与辣根过氧化物酶膜（HRP）的缀合，如图1和表1详细描述的二次抗体。洗涤膜5×5分钟的PBS-T，然后在PBS中2倍5分钟以充分除去吐温的痕迹。
- 孵育膜1分钟在增强的化学发光试剂足以完全覆盖所述膜的一个体积。干燥使用滤纸膜。
- 将膜在一个发光图像分析仪以可视化的免疫反应条带。
- 另外，执行使用敏感的X光片的免疫反应带的检测。
- 洗3×5分钟的PBS膜。
注：在此步骤中的膜可以保持干燥。但是，如果需要进一步剥离，最好是干燥该膜之前执行剥离。膜也可以被存储为短期于PBS中。 - 对于不要求与抗体孵育之间剥离膜（ 见图 1）直接转到步骤5.20。
- 当需要剥离抗体（ 见图 1），孵育该膜在含有2％的SDS，62.5毫的Tris-HCl pH 6.8的（RT）和0.7％β巯基乙醇在DDH 2 O的预热的剥离溶液，在50℃之间根据常规搅拌20分钟。洗3×5分钟的PBS膜。
注：在剥离过程中搅拌是关键。汽提可以在杂交炉中进行。可替代地，汽提可以使用膜在塑料袋密封并浸渍在水浴中进行。在孵育期间的5倍 - 在这种情况下，以搅动膜4是重要的。 - 孵育膜1小时，在室温或O / N在4℃下在PBS-T-牛奶。
- 根据图1重复步骤5.12到5.16。
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Representative Results
图2示出 IRF3与IRF3总抗体和IRF3-磷酸化特异性抗体对Ser396和Ser398 WCE的由高分辨率的SDS-PAGE解析之后检测出的典型的免疫印迹图像。在未刺激的A549细胞，IRF3被检测为两个频带，在50和53 kDa的在对应于所述非磷酸化（形式I）的SDS-PAGE和所述低磷酸（形式Ⅱ）IRF3的物种。曝光A549细胞以SEV为3 - 9小时导致时间依赖性移缓慢迁移过度磷酸形式III和IV，它们是从窗体井分辨I和II。在过度磷酸乐队在55-57 kDa的迁移。该形式III和IV使用抗Ser396和Ser398的磷酸化抗体还专门immunodetected。肌动蛋白的免疫检测作为车道之间相等负载的控制。的SeV感染的对照，其由病毒核衣壳p的积累rotein（N），其迁移，在60 kDa的。
在图3中，检测IRF3的轮廓从WCE母语-PAGE，随后通过免疫印迹使用抗IRF3-NES抗体和抗Ser386磷酸化特异性抗体解析得到被示出。在未刺激的A549细胞，IRF3被检测为对应于单体形式的单一条带。一旦感染SeV载体为3 - 9小时，的IRF3单体降低的水平与相应于IRF3的二聚体形式缓慢迁移带的伴随积累。对Ser386的磷酸化抗体只检测IRF3的二聚体物质。
图2.检测鲜明的IRF3磷酸化种（表I-IV）的A549细胞诱导的SeV感染。A549细胞不感染或感染的SeV的籼稻泰德时代。 WCE是由高分辨率的SDS-PAGE，接着用抗IRF3-Ser396（IRF-3-P-Ser396）免疫印迹（IB）和抗IRF3-Ser398（IRF-3-P-Ser398）磷酸化特异性抗体和抗分析-IRF3全长蛋白的抗体。使用抗SeV载体的抗体的感染监测（核衣壳N蛋白被示出）。抗肌动蛋白抗体作为装载控制。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.监测磷酸化/二聚IRF3诱导的SeV在A549细胞中。将A549细胞不感染或感染的SeV所示时间。 WCE是由本地-PAGE使用抗IRF3-Ser386（IRF-3-P-Ser386）的磷酸化抗体和抗IRF3-NES antib解决，并通过免疫印迹透露odies。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们在这里描述该协议包括耦合到几个使用磷酸化特异性抗体来区分IRF3的单体/二聚体和phosphoformsⅠ-Ⅳ高分辨率SDS-PAGE和天然-PAGE的组合。适当的检测这些IRF3的物种是必不可少的充分体现IRF3激活特定设置。例如，活化的巨噬细胞的LPS刺激导致形成二聚体，Ser396 / 398磷酸化IRF3的呈现一个低磷酸（II型），但并不过度磷酸（形式III和IV）中，图案在SDS-PAGE 15。使用所描述的协议，该信息可以从病毒诱导的需要附加Ser339的磷酸化除了Ser386和Ser396的磷酸化10过度磷酸形式区别开来。重要的是，这也允许识别Ser396磷酸化的物种时不显示二聚化，但是转录活性10之间 。林portantly，需要指出的是，IRF3 phosphoforms的形式I-IV图案应用于人类IRF3。鼠IRF3不仅通过SDS-PAGE后在免疫印迹中使用磷酸化特异性抗体，并通过本地-PAGE显示了类似的模式，因此，激活IRF3的特征在于。
实现IRF3通过SDS-PAGE的不同磷酸化的物质的高分辨率分离的需要特定的参数。适当的解决，这是非常重要的是使用具有16厘米的最小长度的凝胶。即使使用分离凝胶的这个长度，它的关键是让迁移前到达凝胶的底部来获得的不同IRF3形成一个适当的分离。另外，堆积胶必须扩展到最小的1厘米的梳子，得到明确定义的频带下面。这是重要的，因为IRF3的过度磷酸形式迁移非常接近彼此。聚焦不良的乐队将导致缺乏phosphoryla之间的区别泰德构成损害各自的量化。此外，过硫酸铵和TEMED的浓度变化从一个SDS-PAGE协议到另一个。变化在这些浓度从这里指出的那些被发现显著损害的IRF3物种分离的分辨率。
通过本机-PAGE检测IRF3二聚体的形成最初是由一群T.藤田博士的描述。该协议使用含有缓冲DOC，允许从CBP / P300 27 IRF3二聚体的解离。强烈建议细胞裂解作为存储WCE在-80℃后，立即进行原生-PAGE被发现导致IRF3单体/二聚体比例的显著改变。此外，这是非常重要的是，上，下腔室缓冲剂的pH在RT调节至pH 8.4，而不是在4℃下，混合所有组分之后获得的单体VS二聚体适当分离。的分离凝胶为8.5厘米的最小长度允许IRF3单体和二聚体的适当分离。样本加样缓冲液的理想的体积大约是8微升为一5毫米以及分辨率更好时的体积保持为最小。因此，为使用的裂解缓冲液的最低量以得到WCE有高浓度是重要的。然而，应当考虑到有效率的蛋白提取时需要溶解在至少5倍的细胞沉淀的体积帐户。如果样品的体积超过上面指出的限制，这将导致在单体/二聚体的分辨率差。这可以通过将含有4％丙烯酰胺，62.5毫的Tris-HCl pH 6.8的（RT）下，1％过硫酸铵和0.1％TEMED在双蒸2 O层叠凝胶来解决这是非常重要的加载样本，而不会干扰条纹。慢慢用凝胶加载提示接近井底加载给出了很好的效果。
在这里，我们描述了在体内 DETE利用现有的磷酸化抗体Ser386 9，Ser396 19和Ser398 15磷酸化ction在特定的残留物。使用IRF3突变体和质谱分析证实，这些残留物是在病毒感染或IKKε/ TBK1激酶过度磷酸化是IRF3激活6,9,10,19,21关键。磷酸Ser396，磷酸Ser398和总IRF3的SDS-PAGE后的免疫检测需要使用两个相同的凝胶（ 图1）。的确，显著灵敏度损失时的膜的剥离后的磷酸化抗体用于观察。因此，强烈建议您先用磷酸化抗体。需要注意的是替代第一和第二抗体也可以工作，但具体的稀释液和使用的序列应优化。对于IRF3分析，30微克WCE是适当，得到显著检测IRF3的使用指示的抗体用4-毫米宽的井时的磷酸化通过免疫印迹。尽管在感染了各种病毒许多细胞类型30微克被发现是合适的，该量可能需要取决于细胞类型和刺激增加。它是优选使用新鲜提取物的SDS-PAGE，但IRF3磷酸化使用本文中所描述的磷酸化特异性抗体的检测是足够稳定，以允许轮存储工作接触部件的在-80℃下分析之前。这里描述磷酸酶抑制剂的浓度，发现使用A549细胞时是足够的。未发现高浓度产生更好的效果。然而，这些浓度可能需要在显示出更高的磷酸酶活性水平的细胞类型研究IRF3激活时增加。重要的是，IRF3的磷酸化和底层的机制还远未清楚。因此，丝氨酸/ Thr-和酪氨酸磷酸酶的一个完整的液晶面板hibitors用于阻止可能的可能影响的IRF3磷酸化，二聚化和降解的检测尚未未表征的活动。为检测IRF3单体和二聚体的最后病毒感染，并且在大多数的细胞类型，8 - 10微克WCE被发现是足够的。然而，可能需要更高量的蛋白质的用于刺激的效率较低激活IRF3。的磷酸化特异性抗体对Ser386本研究中使用被推荐用在天然-PAGE在变性SDS-PAGE的灵敏度是非常弱的。此外，磷酸化Ser386建议关联与IRF3 9的二聚体形式，从而使本机-PAGE使用这些抗体的一个合适的策略，以确认这个概念在一个特定的环境。值得注意的是，替代性的抗体可从各公司，并且要求保护的进行SDS-PAGE后有效地检测磷酸化Ser386。对Ser396磷酸化抗体也已经有效地üsed的原生后第 20检测IRF3的磷酸化。重要的是，Ser402磷酸受体位点的C末端集群中也被发现是IRF3活化和Ser402的磷酸化重要通过IKKε/ TBK1磷酸化IRF3 10,21,28的质谱分析进行了观察。然而，尽管两个不同的尝试（NG时，未发表），无磷酸化特异性抗体目前可遵循体内此特定残基的磷酸化。注意针对Thr157和Ser339是磷酸化特异性抗体也已经描述11,13。这些额外的磷酸化特异性抗体可以在高分辨率的SDS-PAGE类似于此处所描述的一个的过程中使用。在这种情况下，就需要为每个抗体额外大SDS-PAGE凝胶和处理的方式相同凝胶＃2（图1）。据我们所知，对Ser173或Thr390没有磷酸化抗体还没有被描述，但他们可以很容易地加入到这里所描述，一旦它们可14,20的协议。
IRF3活性通过的超磷酸形式11,17蛋白酶体介导的降解终止。这里描述的协议还允许IRF3退化的监测时的刺激的动能被延长，并耦合到使用蛋白酶体抑制剂（MG132，乳胞素或硼替佐米）的。一般地，在A549细胞感染SeV载体在40 HAU / 10 6个细胞，IRF3磷酸只要2小时后的SeV感染和IRF3降解12小时后开始启动。蛋白酶体介导的降解将从形式III和IV水平是在与蛋白酶抑制剂的条件颠倒晚的时间点所观察到的缩小结束。这也将在IRF3二聚体水平的缩减那些在蛋白酶抑制剂治疗29恢复翻译对本地-PAGE。重要的是，高清晰度TECHNI阙这里介绍的允许降解过程，缺乏活化的区分。的确，退化和在没有检测二聚体/磷酸化Ser386 / 396的缺乏活化IRF3结果。但是，缺乏活化与形式IRF3单体的检测和I和II有关，而没有检测到这些IRF3物种时IRF3降解30。
免疫沉淀加上基于质谱的分析是可以选择的方法来检测在体内磷酸化IRF3的不同位点。这个技术被用于确认IRF3在Ser173，Ser175，Ser386，Thr390，Ser396的磷酸化和Ser402残基10,20,21。然而，质谱法是尚未实惠/ benchside的技术，可以如下几种刺激在不同时间点方便地用于IRF3活化的每日分析。因此，该过程这里描述使用SDS-PAGE耦合到本地-PAGE在使用总的和磷酸化抗体免疫结合构成了实用，实惠和敏感的方法来检测所有当前定义的活化IRF3的形式。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
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