Introduction
El factor de transcripción expresado doquier y constitutivamente interferón (IFN) Factor de Regulación 3 (IRF3) es fundamental para la primera línea de defensa contra los patógenos, principalmente a través de la inducción de IFNß, pero también a través de la inducción de la quimiocina (motivo CC) ligando 5 (CCL5 ) y varias proteínas antivirales incluyendo la proteína inducida por IFN con tetratricopeptide repite IFIT1 / 2/3 a 1-3. Activación IRF3 ha sido reportado después de la infección con numerosos virus, o la exposición a ácido poliinosínico policitidílico (poli I: C) o lipopolisacárido (LPS) 4. Es importante destacar que los virus más estudiadas han desarrollado mecanismos para evadir la respuesta mediada por IRF3, y por lo tanto escapar de la defensa inmune innata 5 host. Por lo tanto, el seguimiento de la activación IRF3 es de gran importancia para comprender los mecanismos moleculares de la defensa del huésped antiviral innata, sino también para identificar la estrategia usada por los virus para contrarrestar esta respuesta.
ent "> Muchos informes publicados sin embargo proporcionan sólo un análisis limitado de la activación IRF3 realizado por el seguimiento de la inducción de genes IRF3-objetivo (IFNB1 y IFIT1) y / o ensayo de gen informador de luciferasa acoplado a electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de baja resolución de sodio (SDS- PAGE) análisis de IRF3. Sin embargo, numerosos estudios bioquímicos, el análisis del comportamiento de los diversos mutantes IRF3 y elucidación de la estructura cristalina IRF3 6 a 11 han contribuido a establecer que IRF3 se somete a un complejo conjunto de modificaciones post-traduccionales secuenciales por fosforilación en múltiples sitios. El conjunto de fosforilación implicado en la activación IRF3 parece ser dependiente del estímulo y lo más probable en el tipo de célula. En las células no infectadas, IRF3 coexiste como especies no fosforilados y hypophosphorylated que contiene phosphoresidues, incluyendo Thr135 y Ser173, en el 1 -198 aa región N-terminal 6,12-14. La acumulación de este f hipofosforiladaorm de IRF3 es inducida por inductores de estrés, factores de crecimiento y agentes que dañan el ADN 6. La fosforilación de residuos de Ser / Thr en la región C-terminal de IRF3 que contiene el dominio de transactivación se desencadena después de la activación por virus, poli I: C o LPS en un tipo de célula de manera dependiente 15-17 de. Fosforilación C-terminal de IRF3 implica no menos de 7 sitios phosphoacceptor distintos organizados en dos grupos principales, Ser385 / Ser386 y Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, que cada contribuir a la activación IRF3 a través de la dimerización, la acumulación nuclear, asociación con la CREB -la proteína de unión (CBP) / coactivadores p300, la unión a IFN elemento de respuesta sensible (ISRE) secuencias consenso y transactivación de los genes diana 9,10,17-19 ADN. La fosforilación de Thr390 también se cree que contribuyen a la activación inducida por el virus IRF3-20. Los análisis de espectrometría de masas de IRF3 han demostrado que los residuos Ser386, Thr390, Ser396 y Ser402 son directamente phosphorylatcado por el inhibidor de quinasa kappa B ε (IKKε) / unión TANQUE-quinasa 1 (TBK1) quinasas 9,10. La fosforilación en los residuos C-terminal también es necesaria para la terminación de la activación a través de IRF3 polyubiquitination y la degradación mediada por proteasoma-10. Este proceso es también dependiente de la fosforilación en Ser339, que es necesaria para la contratación de la isomerasa Pin1 propilo 10,11. Especies IRF3 que contienen al menos fosfo-Ser339 / 386/396 residuos se consideran formas hiperfosforilada. La secuencia exacta y la función de cada sitio sigue siendo un tema de discusión 10,21. Ahora está claro que IRF3 activado no representa un estado homogéneo, pero existe esa especie activados diferentes expositoras de fosforilación o dimerización características distintas 10,22.Para proporcionar una comprensión completa de la activación IRF3 en respuesta a patógenos específicos, lo que es necesario a characterize cuál de las especies activadas son inducidos. La inducción de genes diana IRF3, IFNB1 y IFIT1, ha demostrado proporcionar una lectura fiable para la activación IRF3. Sin embargo, el seguimiento expresión de estos genes no distingue entre los diferentes estados de activación de IRF3. Un análisis completo de estados de activación IRF3 en un ambiente particular, se basa en la caracterización detallada de su fosforilación y dimerización estado 10. No fosforilada (formulario I), hypophosphorylated (forma II) y hiperfosforilada (formas III y IV) formas IRF3 6,18,23 se puede resolver con éxito por la movilidad reducida en alta resolución de análisis de SDS-PAGE. Especies monoméricas y diméricas IRF3 se pueden identificar de manera eficiente por análisis de PAGE nativa. Estos enfoques se mejoran en gran medida cuando se utiliza en combinación con anticuerpos fosfoespecíficos dirigidos contra sitios phosphoacceptor IRF3 distintas.
Protocolos estándar permiten una pobre resolución deproteínas que no permite la separación eficiente de los distintos IRF3 formas fosforiladas. Aquí se describe en detalle un procedimiento para lograr la más alta resolución para monitorizar la inducción de especies IRF3 virus activado por distintos utilizando SDS-PAGE acoplado a-PAGE nativa en combinación con inmunoblot utilizando anticuerpos totales y fosfoespecíficos. In vivo discriminación entre las diferentes activado formas de IRF3 se realiza sobre la base de sus turnos de movilidad observados en SDS-PAGE. Además, IRF3 monómero y el dímero se pueden distinguir por electroforesis no desnaturalizantes. La combinación de estas dos técnicas complementarias con inmunoblot resulta ser un enfoque accesible y sensible a adquirir toda la información necesaria para un análisis completo de la activación de la fosforilación mediada por IRF3.
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Protocol
NOTA: El protocolo se describe aquí usando células A549 infectadas con el virus Sendai (VSe). Sin embargo, el protocolo para SDS-PAGE y PAGE nativa también trabaja con todos los tipos de células humanas y murinas probado hasta ahora, en particular células mieloides estimuladas con diferentes 9,15,19,24,25 estímulos IRF3 activador.
1. Infección de células A549
- Mantener las células A549 en cultivo en una placa de 15 cm a 37 ° C / 5% de CO 2 en 20 ml F12K medio / Ham que contenía 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (HI-FBS) y 1% de L-glutamina (F12K completa / Jamón medio).
NOTA: Todas las soluciones utilizadas para la cultura y los tratamientos de células deben ser estériles. - A las 24 h antes de la infección, aspirar el medio y se lavan las células con 10 ml de agua destilada salina tamponada con fosfato (D-PBS) a TA.
- Añadir 1 ml de solución de tripsina-EDTA 0,25% a cada placa para cubrir las células y se incuba a 37 ° C durante 3 min.
- Detener la incubación tan pronto como sea ªcélulas electrónicos empiezan a desprenderse de la placa tocando suavemente la placa con una mano. Inactivar la tripsina mediante la adición de 10 ml de medio F12K / jamón completa pre-calentado por placa y transferir las células a un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar a 350 xg durante 3 min a TA. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 8 ml de medio F12K / jamón completa para obtener una suspensión de células individuales homogénea.
- Contar las células utilizando un hemocitómetro. Semilla las células a una densidad de 1 x 10 6 células por placa de 60 mm en 4 ml de F12K medio / Jamón precalentado completa. Incubar durante 20 a 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2. Después de 20 a 24 h, las células forman una monocapa confluente 90% (lo que corresponde a 1,5 x 10 6 células).
- Retire el medio y se lavan las células con 2 ml de F12K libre de suero / medio Jamón (SFM). Añadir 2 ml de SFM fresco por placa de 60 mm.
- Descongelar una alícuota de virus Sendai (SEV) (almacenado en alícuotas a -80 ° C) en el hielo y agitar brevemente.
- Diluir ªe virus en precalentado SFM para obtener 60 HAU / 100 l. Mezclar pipeteando arriba y abajo suavemente y añadir 100 l de virus diluido por placa para realizar la infección en 40 HAU / 10 6 células. No agregue virus en la placa de control no infectado.
- Se incuban las células en la incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2. Agitar las placas a mano 3 o 4 veces, o utilizando un agitador orbital o balanceo automático colocado directamente en la incubadora, durante la primera hora de la infección.
- A las 2 horas después de la infección, añadir 2 ml de medio F12K / Ham que contenía 20% HI-FBS para obtener una concentración final de 10% HI-FBS.
- Se incuban las células en la incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 1, 4 y 7 horas para llegar a los tiempos totales de infección de 3, 6 y 9 horas, respectivamente. En cada uno de estos puntos de tiempo, vaya al paso 2.1.
2. Preparación de extractos de células enteras (EBB)
- Retire el medio de infección. Recoger las células por raspado en 1 mlde helado D-PBS y transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 1,5 ml pre-enfriada.
- Sedimentar las células por centrifugación a 16.000 xg a 4 ° C durante 20 segundos y decantar cuidadosamente todos los restos de D-PBS.
NOTA: En este paso, el sedimento celular puede estar directamente sometió a una extracción de proteínas o-flash congelado en nitrógeno líquido o baño de hielo / etanol seco y se almacenaron a -80 ° C hasta que la lisis. - Preparar el tampón de lisis que contiene 50 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 10% de glicerol y 1% Nonidet P-40 en agua desionizada (ddH 2 O). Añadir extemporáneamente proteasa (1 mg / ml de leupeptina y / ml de aprotinina 2 g) inhibidores de la fosfatasa y (fluoruro de sodio 5 mM, 1 mM activa ortovanadato de sodio, 2 mM p-nitrofenil fosfato y 10 mM β-glicerofosfato pH 7,5).
NOTA: El tampón de lisis sin inhibidores se puede almacenar a 4 ° C. Un protocolo específico para la activación de ortovanadato de sodio se describe en la Tabla de reactivos específicos / EquipmeNuevo Testamento. - Resuspender el sedimento celular en 70 l de tampón de lisis. Típicamente la concentración lisado será de alrededor de 2 mg / l.
- Incubar en hielo durante 20 min. Flash congelar el lisado por incubación en un baño de nitrógeno líquido durante 15 seg. Descongele el lisado a temperatura ambiente hasta que se derrita por completo y agitar durante 10 segundos. Repita el deshielo ciclo de congelación / / vórtice 3 veces.
- Alternativamente, lleve a cabo la etapa de congelación en un / baño de hielo seco de etanol durante 1 min.
- Centrifugar a 16.000 xga 4 ° C durante 20 min. Transferir el sobrenadante (correspondiente a la WCE) a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml pre-enfriada. Mantenga el EBB en hielo en todo momento.
- Cuantificar proteínas utilizando cualquier procedimiento de cuantificación de proteínas compatible con el tampón de lisis tal como a base de Bradford ensayo de proteínas 26.
3. Resolución del EBB por Alta Resolución SDS-PAGE
- Prepare tres desnaturalización geles de electroforesis.
- Para la detección deFormas IRF3, vierta dos geles de un mínimo de 16 cm de longitud con un gel de separación compuesta de 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS ), persulfato de 1% de amonio y 0,1% TEMED en ddH 2 O y un gel de apilamiento compuesta de 4% de acrilamida, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, persulfato de amonio 1% y 0,1% TEMED en ddH 2 O.
¡Precaución! La acrilamida, TEMED y SDS son tóxicos y / o irritantes. Use guantes de protección y manipular bajo una campana de humos. - Para la detección de las proteínas SeV, vierta una gel de un mínimo de 8,5 cm de longitud con características similares al gel se describe en 3.1.1, excepto que el gel de separación contiene 12% de acrilamida.
- Para la detección deFormas IRF3, vierta dos geles de un mínimo de 16 cm de longitud con un gel de separación compuesta de 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS ), persulfato de 1% de amonio y 0,1% TEMED en ddH 2 O y un gel de apilamiento compuesta de 4% de acrilamida, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, persulfato de amonio 1% y 0,1% TEMED en ddH 2 O.
- Desnaturalizar la WCE obtenido en la etapa 2.6 mediante la adición de 1: 4 (v / v) de tampón 5x de carga (Tris-HCl 125 mM pH 6,8 (RT), 10% de SDS, 20% (v /) de glicerol p, 0,0005% de azul de bromofenol y 25% β-mercaptoetanol en ddH 2 O) seguido de calentamiento a 100 °C durante 10 min. Vuelta rápida de los tubos para reducir la condensación que se forma en la tapa.
¡Precaución! β-mercaptoetanol es tóxico por inhalación. Use guantes de protección y manipular bajo una campana de humos. - Montar los geles en el aparato de la migración. Llenar las cámaras superior e inferior con el funcionamiento de tampón que contiene 25 mM Tris-base, 0,1% SDS y glicina 192 mM en agua destilada (dH 2 O).
- Cargar 14 l de patrón de peso molecular en un pocillo de cada gel 16 cm y 7 l de patrón de peso molecular en un pocillo del gel 8,5 cm. Cargar 30 g de WCE desnaturalizado (preparado como se describe en el paso 3.2) por pocillo de los dos geles preparados en la etapa 3.1.1 para la detección de formas IRF3. Carga de 8 - 10 g de WCE desnaturalizado (preparado como se describe en el paso 3.2) por pocillo en el gel preparado en la etapa 3.1.2 para el análisis de SeV.
- Ejecutar los geles a 30 mA de corriente constante hasta que el frente de migración alcanza la parte inferior del gel.
NOTA: La migración suele durar approximately 3 h para un gel de 16 cm y 45 min para un gel de 8,5 cm. - Proceder a la transferencia a membranas de nitrocelulosa (paso 5).
4. Análisis de IRF3 Dimerización por Native PAGE
NOTA: Este método fue descrito originalmente por el grupo del Dr. T. Fujita 27.
- Preparar los superiores (-) e inferior (+) tampones de electroforesis cámara. El tampón de cámara superior consta de 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), glicina 192 mM y 1% desoxicolato de sodio (DOC) en ddH 2 O. El tampón de cámara inferior contiene 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) y 192 mM glicina en ddH 2 O.
NOTA: Los tampones superior e inferior de la cámara de electroforesis se pueden almacenar a 4 ° C hasta su uso. Sin embargo, asegúrese de que están pre-calentado a temperatura ambiente antes de realizar la electroforesis. - Verter un gel no desnaturalizante de resolución de un mínimo de 8,5 cm de longitud que contiene 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% municiónpersulfato nio y 0,1% TEMED en ddH 2 O.
- Pre-correr el gel a 40 mA de corriente constante durante 30 minutos en hielo. Pulse el aparato en funcionamiento en el hielo aproximadamente al nivel del tampón de electroforesis cámara baja. Es importante que el gel no está en el hielo.
- Durante la pre-carrera, mezclar WCE mantuvo en hielo con 2x-PAGE nativa tampón de carga 1: 1 (v / v) que contiene 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% de glicerol y 0,1% de azul de bromofenol en ddH 2 O.
- Carga de 8 - 10 g WCE (preparado como se describe en el paso 4.4) inmediatamente al final de la pre-carrera.
- Correr el gel a 25 mA de corriente constante en el hielo, como se describe anteriormente para la pre-carrera, hasta que el frente de migración alcanza la parte inferior del gel (aproximadamente 40 min).
5. Análisis de inmunotransferencia IRF3 Especies
- Preparar el tampón de transferencia que contiene 25 mM Tris-Base y glicina 192 mM en ddH 2 O. Refrigere el tampón de transferencia a 4 ° C antes de su uso.
- Seco tres piezas de membrana de nitrocelulosa cortan a un tamaño ligeramente mayor que los geles en una caja de plástico / vidrio que contiene el tampón de transferencia. Indicar la orientación de la membrana mediante la reducción de una esquina. El tampón de transferencia puede ser reutilizado 3 veces. Almacene el tampón a 4 ° C entre usos.
- Uncast los geles (SDS-PAGE y-PAGE nativa) y cortar una esquina de cada gel para la orientación adecuada.
- Para-PAGE nativa, incubar el gel a temperatura ambiente con agitación suave durante al menos 30 min en el tampón de SDS-PAGE corriente para eliminar el DOC antes de transferir a la memoria tampón de transferencia.
- Incubar los geles (SDS-PAGE y-PAGE nativa) en el tampón de transferencia durante 5 - 10 min.
- Montar un sándwich de transferencia por gel en un casete de transferencia con la membrana hacia el electrodo positivo (papel pista / filtro de espuma / membrana / gel / filtro de papel / almohadilla de espuma). Tenga cuidado de eliminar todas las burbujas entre las capas del sandwich.
- Realizar la transferencia como se recomienda by el fabricante para el aparato de transferencia utilizado.
NOTA: Realice todas las incubaciones y lavados en los próximos pasos sobre una plataforma de agitación oscilante u orbital. - Al final del tiempo de transferencia, las membranas se incuban durante 15 min en la solución de fijación que contienen ácido acético 7%, etanol al 40% y 3% de glicerol en ddH 2 O. Lave las membranas 3x 5 min en PBS (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na 2 HPO 4 y 1,8 mM KH 2 PO 4 en dH 2 O).
¡Precaución! El ácido acético es tóxico, irritante e inflamable. Use guantes de protección y manipular bajo la campana de humos.
NOTA: La solución de fijación se puede reutilizar varias veces. - Para la membrana-PAGE nativa vaya directamente al paso 5.11.
- Enjuagar las tres membranas SDS-PAGE rápidamente en dH 2 O antes de incubarlos durante 1 min en solución Ponceau roja que contiene 6,57 mM rojo Ponceau y ácido acético al 1% en ddH 2 O.
NOTA: La solución ponceau rojo puede ser r eused varias veces. - Enjuague las membranas en dH 2 O hasta que el fondo es lo suficientemente blanca para ver las bandas de proteínas teñidas de rojo. Tenga en cuenta los marcadores con un lápiz y cortar el exceso de membrana que rodea las proteínas. Destain las membranas mediante incubación durante 5 min en PBS con agitación.
- Se incuban las membranas durante 1 hora a RT o O / N a 4 ° C en la solución de bloqueo (PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y la leche en polvo al 5% sin grasa (PBS-T-leche). Lavar las membranas 3x 5 min en PBS-T.
NOTA: El lavado PBS-T es opcional y sólo estrictamente necesario al aplicar anticuerpos diluidos en PBS-T que contiene 5% de albúmina de suero bovino (PBS-T-BSA) (Figura 1 y Tabla 1) en el próximo paso. - Incubar las cuatro membranas (desde SDS-PAGE y-PAGE nativa) con los anticuerpos primarios de acuerdo con el orden secuencial detalla en la Figura 1 y en la Tabla 1. Realizar 5x 5 min lavados en PBS-T.
Figura 1. Secuencia de análisis inmunoblot. El esquema describe los geles de SDS-PAGE y-PAGE nativa individuales requeridas para detectar las diversas formas fosforiladas y monoméricos / dimérica IRF3. El orden específico de anticuerpos aplicadas a la membrana resultante de cada gel en el procedimiento de inmunotransferencia se describe. Tenga en cuenta que los anticuerpos anti-actina se utilizó por primera vez para asegurar la igualdad de carga de las muestras antes de aplicar cualquier otra anticuerpos específicos. La secuencia alterna, con anticuerpos anti-actina se aplica después de los anticuerpos anti-fosfo-IRF3, también funciona. Stripping se utiliza entre anti-actina y anticuerpos anti-SEV o entre anticuerpos anti-IRF3 debido a las dimensiones de las señales superpuestas anti-fosfo-IRF3 y. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Los anticuerpos primarios | Dilución | Tampón de dilución | Incubación | Los anticuerpos secundarios | Comentarios |
| Anti-actina | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | 15 min a RT | Anti-ratón | Utilizar después de SDS-PAGE Antibodyies diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica. |
| Anti-IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N a 4 ° C | Anti-conejo | Utilizar después Nativo-PAGE. No se recomienda volver a utilizar el anticuerpo diluido |
| Anti-IRF3-P-Ser396 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N a 4 ° C | Utilice después de SDS-PAGE. No se recomienda volver a utilizar el diluyó anticuerpo anti-IRF3-P-396 también está disponible de señalización celular. Dilución óptima se definió como 1 / 1.000 para este anticuerpo, pero puede variar entre los lotes. | |
| Anti-IRF3-P-Ser398 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N a 4 ° C | Anti-conejo | Utilice después de SDS-PAGE. No se recomienda volver a utilizar el anticuerpo diluido |
| Longitud completa anti-IRF3 | 1 / 7.500 | PBS-T-leche | 3 h a RT | Anti-conejo | Utilice después de SDS-PAGE. El anticuerpo anti-IRF3 de longitud completa se puede utilizar después-PAGE nativa, pero es menos sensible para detectar el monómero. Anticuerpos diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica. |
| Anti-IRF3-NES | 0,5 g / ml | PBS-T-leche | 3 h a RT | Anti-conejo | Utilizar después Nativo-PAGE. Antibodyies diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica. |
| Anti-SEV | 1 / 14.000 | PBS-T-BSA | 3 h a RT | Anti-conejo | Utilice después de SDS-PAGE. Antibodyies diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica. |
| NOTA: Dilución y tampón utilizado para anticuerpos secundarios acoplados a HRP necesitan ser optimizado, ya que varía de una compañía a la otra. | |||||
Tabla 1. Especificaciones de los anticuerpos utilizados en el procedimiento de inmunotransferencia.
- Se incuban las membranas con la peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios como se detalla en la Figura 1 y en la Tabla 1. Lavar las membranas 5x 5 min en PBS-T, seguido por 2x 5 min en PBS para eliminar totalmente las trazas de Tween.
- Se incuban las membranas durante 1 min en un volumen de reactivo de quimioluminiscencia mejorada suficiente para cubrir la totalidad de las membranas. Secar las membranas utilizando papel de filtro.
- Coloque las membranas en un analizador de imágenes luminiscentes para visualizar las bandas inmunorreactivas.
- Alternativamente, realice la detección de bandas inmunorreactivas utilizando películas X-Ray sensibles.
- Lave las membranas 3x 5 min en PBS.
NOTA: En este paso las membranas pueden mantenerse seco. Sin embargo, si se requiere más de desmontaje, es mejor llevar a cabo la extracción antes de secar la membrana. Las membranas también se pueden almacenar a corto plazo en PBS. - Para las membranas que no requieren separación entre la incubación con anticuerpos (véase la Figura 1) vaya directamente al paso5.20.
- Cuando se requiere separación entre los anticuerpos (ver Figura 1), incubar las membranas en pre calentado solución de decapado que contiene SDS al 2%, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) y el 0,7% β-mercaptoetanol en ddH2O a 50 ° C durante 20 min con agitación regular. Lave las membranas 3x 5 min en PBS.
NOTA: La agitación durante el procedimiento de extracción es la clave. Excluyendo se puede realizar en un horno de hibridación. Alternativamente, desprendimiento se puede realizar utilizando membranas selladas en bolsas de plástico y se sumerge en un baño de agua. En este caso, es importante para agitar las membranas 4 - 5 veces durante la incubación. - Se incuban las membranas durante 1 hora a RT o O / N a 4 ° C en PBS-T-leche.
- Repetir los pasos 5.12 a 5,16 según la figura 1.
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Representative Results
La figura 2 muestra una imagen típica de inmunoblot IRF3 detectado con anticuerpos totales IRF3 y anticuerpos IRF3-phosphospecific contra Ser396 y Ser398 después de la resolución del EBB por la alta resolución de SDS-PAGE. En las células A549 no estimuladas, IRF3 se detecta como dos bandas a 50 y 53 kDa en el SDS-PAGE correspondiente a la no fosforilada (forma I) y el hypophosphorylated (forma II) especies de IRF3. La exposición de células A549 a Sev por 3 - 9 resultados hr en un cambio dependiente del tiempo de migrar lentamente formas hiperfosforilada III y IV, que son también distinguen de las formas I y II. Las bandas hiperfosforilada migran a 55-57 kDa. Las formas III y IV también se immunodetected específicamente utilizando los anticuerpos fosfoespecíficos contra Ser396 y Ser398. La inmunodetección de actina sirve como control de carga igual entre los carriles. Un control de la infección de SeV se muestra por la acumulación de la nucleocápside del virus protein (N), que migra a 60 kDa.
En la Figura 3, el perfil de la detección de IRF3 obtiene a partir de WCE resuelta por PAGE natural seguido de inmunotransferencia usando anticuerpos anti-IRF3-NES y anticuerpos fosfoespecíficos contra Ser386 se muestra. En las células A549 no estimuladas, IRF3 se detecta como una sola banda correspondiente a la forma monomérica. Tras la infección con VSe de 3-9 horas, los niveles de IRF3 monómero con una disminución concomitante de la acumulación de una banda de migración lentamente que corresponde a la forma dimérica de IRF3. Los anticuerpos contra phosphospecific Ser386 sólo detectan especies dímero IRF3.
Figura 2. Detección de IRF3 Distinto fosforilados Especies (formulario I-IV) inducida por VSe infección en células A549. A549 células se quedaron infectados o infectados con VSe para la índicatiempos TED. WCE se analizaron por de alta resolución SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia (IB) usando anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) y anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) anticuerpos fosfoespecíficos y anti anticuerpos proteína de longitud completa -IRF3. La infección se controló usando anticuerpos anti-SeV (la proteína de la nucleocápside N se muestra). Los anticuerpos anti-actina se utilizaron como control de carga. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Seguimiento de fosforilada / dimerizadas Inducción IRF3 por VSe en células A549. A549 células se quedaron infectados o infectados con VSe durante los tiempos indicados. WCE se resolvieron por PAGE nativa y revelado por inmunoblot utilizando anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) anticuerpos fosfoespecíficos y anti-IRF3-NES antibodies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo se describe aquí consiste en una combinación de alta resolución y SDS-PAGE-PAGE nativa acoplada a la utilización de varios anticuerpos fosfoespecíficos para distinguir el monomérica / dimérica y phosphoforms I-IV de IRF3. Detección adecuada de estas especies IRF3 es esencial para caracterizar completamente la activación IRF3 en un entorno específico. Por ejemplo, LPS estimulación de macrófagos activados conduce a la formación de dimérica, Ser396 / 398 IRF3 fosforilada que exhibe una hypophosphorylated (forma II), pero no hyperphosphorylated (forma III y IV), patrón en SDS-PAGE 15. Utilizando el protocolo descrito, este perfil se puede distinguir de las formas hiperfosforilada inducidos por virus que requieren la fosforilación de Ser339 adicional además de Ser386 y Ser396 fosforilación 10. Es importante destacar que esto también permite discriminar entre especies Ser396 fosforilados que no presentan la dimerización, pero que son transcripcionalmente activo 10. Estoyportantly, es necesario señalar que el patrón de la forma I-IV de phosphoforms IRF3 aplica a IRF3 humano. Murine IRF3 no presenta un patrón similar y por lo tanto la activación de IRF3 se caracteriza sólo por el uso de anticuerpos fosfoespecíficos en inmunotransferencia después de SDS-PAGE y por PAGE nativa.
El logro de un alto separación resolución de las especies fosforiladas distintas de IRF3 por SDS-PAGE requiere parámetros específicos. Para una resolución apropiada, es muy importante utilizar geles que tienen una longitud mínima de 16 cm. Incluso con esta longitud de gel de separación, es clave para permitir que el frente de migración llegar a la parte inferior del gel para obtener una separación apropiada de las diferentes formas IRF3. Además, el gel de apilamiento debe extenderse a un mínimo de 1 cm por debajo del peine para obtener bandas bien definidas. Esto es importante, ya que las formas hiperfosforilada de IRF3 migran muy cerca uno del otro. Mal bandas enfocadas darán lugar a la falta de distinción entre phosphorylated forma menoscabar su respectiva cuantificación. Además, la concentración de persulfato amónico y TEMED varían de un protocolo de SDS-PAGE a otro. La variación en estas concentraciones de los indicados aquí se encontró a afectar significativamente la resolución en la separación de las especies IRF3.
La detección de la formación de dímeros IRF3 a través de la PAGE nativa fue descrito originalmente por el grupo del Dr. T. Fujita. Este protocolo utiliza tampón que contenía DOC que permite la disociación del dímero IRF3 de CBP / p300 27. Se recomienda proceder a-PAGE nativa inmediatamente después de la lisis celular como almacenamiento del EBB a -80 ° C, se encontró a dar lugar a una alteración significativa de la relación de monómero IRF3 / dímero. Además, es muy importante que el pH de los tampones de cámara superior e inferior se ajusta a pH 8,4 a temperatura ambiente, y no a 4 ° C, después de mezclar todos los componentes para conseguir la separación adecuada del monómero vs dímero. Una separacióngel con una longitud mínima de 8,5 cm permite la separación adecuada de monómero y dímero IRF3. El volumen ideal de la muestra más tampón de carga es de alrededor de 8 l de a 5 mm, así como la resolución es mejor cuando el volumen se mantiene al mínimo. Por lo tanto, es importante utilizar el menor volumen de tampón de lisis para obtener WCE con una alta concentración. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la extracción de proteína eficiente requiere la lisis en al menos 5 veces el volumen del sedimento celular. Si el volumen de las muestras excede el límite indicado anteriormente, esto daría lugar a una pobre resolución del monómero / dímero. Esto se puede resolver mediante la adición de un gel de apilamiento que contiene 4% de acrilamida, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), persulfato de amonio 1% y 0,1% TEMED en ddH 2 O. Es muy importante para cargar las muestras sin perturbar bandas. Cargando lentamente con una punta de carga de gel cerca de la parte inferior del pozo da muy buenos resultados.
A continuación, describimos la in vivo detección de fosforilación en residuos específicos utilizando anticuerpos fosfoespecíficos disponibles actualmente contra Ser386 9, Ser396 y Ser398 15 19. El uso de mutantes IRF3 y espectrometría de masas de análisis han confirmado que estos residuos son fosforilados después de la infección de virus o sobreexpresión de IKKε / TBK1 quinasas y son fundamentales para la activación 6,9,10,19,21 IRF3. La inmunodetección de fosfo-Ser396, fosfo-Ser398 y IRF3 total después de SDS-PAGE requiere el uso de dos geles idénticos (Figura 1). De hecho, se observa una pérdida significativa de sensibilidad cuando se usan anticuerpos fosfoespecíficos después de la extracción de la membrana. Por lo tanto, es muy recomendable usar anticuerpos fosfoespecíficos primero. Tenga en cuenta que los anticuerpos primarios y secundarios alternativos también pueden funcionar, pero las diluciones y la secuencia de uso específicos deben ser optimizados. Para el análisis IRF3, 30 g de WCE es apropiado para obtener una detección significativa de IRF3fosforilación por inmunoblot usando los anticuerpos indicados cuando se usa de 4 mm de ancho pozos. Aunque en muchos tipos de células infectadas con diversos virus se encontró 30 mg de ser el caso, podría ser necesario aumentar en función del tipo celular y la estimulación de esta cantidad. Es preferible utilizar extractos frescos para SDS-PAGE, pero la detección de IRF3 fosforilación utilizando los anticuerpos fosfoespecíficos descritos en este trabajo es lo suficientemente estable como para permitir una ronda de almacenamiento del EBB a -80 ° C antes del análisis. Se encontró que las concentraciones de inhibidores de la fosfatasa descritas aquí para ser suficiente cuando se utilizan células A549. Las concentraciones más altas no se encontraron para producir mejores resultados. Sin embargo, podría ser necesario aumentar la hora de estudiar la activación IRF3 en tipos de células que muestran los niveles de actividad de fosfatasa mayores estas concentraciones. Es importante destacar que la fosforilación de IRF3 y los mecanismos subyacentes aún están lejos de ser comprendido. Por lo tanto, un panel lleno de Ser / Thr y Tyr-fosfatasa eninhibidores se utiliza para bloquear las posibles actividades aún no caracterizados que podrían afectar la detección de la fosforilación IRF3, la dimerización y la degradación. Para la detección de monómero y dímero IRF3 después de la mayoría de las infecciones por virus y en la mayoría de tipos de células, 8 - 10 g WCE se encontró que era suficiente. Sin embargo, una mayor cantidad de proteínas podrían ser necesarias para la activación de la estimulación IRF3 menos eficientemente. Se recomiendan los anticuerpos fosfoespecíficos contra Ser386 utilizados en este estudio para ser utilizado en-PAGE nativa como la sensibilidad en la desnaturalización SDS-PAGE es muy débil. Por otra parte, se propone la fosforilación en Ser386 que se correlaciona con la forma dimérica de IRF3 9, con lo que el uso de estos anticuerpos en-PAGE nativa una estrategia apropiada para confirmar este concepto en un entorno específico. Es de destacar que los anticuerpos alternativos están disponibles en varias compañías y son reclamados para detectar de manera eficiente fosfo-Ser386 después de SDS-PAGE. Anticuerpos contra fosfoespecífico Ser396 también han sido eficientemente used para detectar fosforilación IRF3 post-PAGE nativa 20. Es importante destacar que, Ser402 en el grupo C-terminal de los sitios de phosphoacceptor también se encontró que era importante para la activación IRF3 y la fosforilación de Ser402 se observó a través de análisis de espectrometría de masa de IKKε / TBK1-fosforilados IRF3 10,21,28. Sin embargo, a pesar de dos intentos diferentes (NG, inédito), no hay anticuerpos fosfoespecíficos están disponibles actualmente para seguir la fosforilación de este residuo específico en vivo. Tenga en cuenta que los anticuerpos contra phosphospecific Thr157 y Ser339 también se han descrito 11,13. Estos anticuerpos fosfoespecíficos adicionales podrían utilizarse en un procedimiento de alta resolución de SDS-PAGE similar a la descrita aquí. En este caso, se necesitarían grandes geles SDS-PAGE adicionales para cada anticuerpo y se procesan de la misma manera como gel # 2 (Figura 1). Hasta donde sabemos todavía no se han descrito anticuerpos fosfoespecíficos contra Ser173 o Thr390,pero podrían ser fácilmente añadidos con el protocolo descrito aquí una vez que estén disponibles 14,20.
Actividad IRF3 se termina por la degradación mediada por proteasoma de formas hiperfosforilada 11,17. El protocolo aquí descrito también permite la monitorización de la degradación IRF3 cuando la cinética de la estimulación se prolonga y está acoplado al uso de inhibidores del proteasoma (MG132, lactacistina o Bortezomid). Por lo general, en las células A549 infectadas con VSe a 40 HAU / 10 6 células, la fosforilación IRF3 comienza tan pronto como 2 horas después de la infección y IRF3 VSe degradación comienza después de 12 horas. La degradación del proteasoma mediada se llegó a la conclusión de la disminución observada de las formas III y IV nivel en momentos tardíos que se invierte en condiciones con inhibidores del proteasoma. Esto también se traducirá en-PAGE nativa en una disminución de los niveles de dímero IRF3 que se recuperó tras el tratamiento inhibidor del proteasoma 29. Es importante destacar que la alta resolución técniQue presenta aquí permite diferenciar entre el proceso de degradación y la falta de activación. De hecho, tanto la degradación y la falta de activación de resultado IRF3 en ausencia de detección de dímero / fosfo-Ser386 / 396. Sin embargo, la falta de activación está asociada con la detección de monómero IRF3 y de las formas I y II, mientras que estas especies IRF3 no se detectan cuando se degrada IRF3 30.
La inmunoprecipitación junto con el análisis basado en espectrometría de masas es un método de elección para detectar la fosforilación in vivo de IRF3 en sitios distintos. Esta técnica se utilizó para confirmar la fosforilación de IRF3 en Ser173, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 y Ser402 residuos 10,20,21. Sin embargo, la espectrometría de masas aún no es una técnica asequible / Benchside que se puede utilizar fácilmente para el análisis diario de la activación IRF3 después de varios estímulos en diferentes puntos temporales. Por lo tanto, el procedimiento descrito aquí usando SDS-PAGE nativa acoplada a-PAGE en combinación con inmunoblot utilizando anticuerpos totales y phosphospecific constituye un enfoque práctico, accesible y sensible para detectar todas las formas definidas actualmente de actived IRF3.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
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