Introduction
Il fattore di trascrizione ubiquitariamente e costitutivamente espresso Interferone (IFN) Fattore di regolamentazione 3 (IRF3) è fondamentale per la prima linea di difesa contro i patogeni principalmente attraverso l'induzione di Interferone beta, ma anche attraverso l'induzione della chemochina (CC motivo) ligando 5 (CCL5 ) e diverse proteine antivirali tra cui proteine IFN-indotta con tetratricopeptide ripete IFIT1 / 2/3 1-3. Attivazione IRF3 è stata riportata a seguito dell'infezione da numerosi virus, o l'esposizione ad acido polyinosinic-policitidilico (poli I: C) o lipopolisaccaride (LPS) 4. È importante sottolineare che i virus più studiati sono evoluti meccanismi per eludere la risposta IRF3-mediata, e quindi sfuggire l'host difesa immunitaria innata 5. Pertanto, il monitoraggio di attivazione IRF3 è di grande importanza per comprendere i meccanismi molecolari del innata difesa ospite antivirale, ma anche di individuare la strategia utilizzata dai virus per contrastare questa risposta.
ent "> Molti rapporti pubblicati però fornire solo un'analisi limitata di attivazione IRF3 eseguito dal monitoraggio dell'induzione gene IRF3-bersaglio (IFNB1 e IFIT1) e / o luciferasi giornalista test gene accoppiato a bassa risoluzione di sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS PAGE) analisi delle IRF3. Tuttavia, numerosi studi biochimici, analisi del comportamento dei vari mutanti IRF3 e delucidazione struttura cristallina IRF3 6-11 hanno contribuito a stabilire che IRF3 è sottoposto ad una serie complessa di sequenziali modificazioni post-traduzionali dalla fosforilazione a più siti. L'insieme di fosforilazione coinvolti nell'attivazione IRF3 sembra essere dipendente dalla stimolo e più probabile del tipo di cellula. In cellule non infettate, IRF3 coesiste come specie non fosforilata e ipofosforilata contenente phosphoresidues, tra Thr135 e Ser173, in 1 -198 aa regione N-terminale 6,12-14. L'accumulo di questo ipofosforilata form di IRF3 è indotta da induttori di stress, fattori di crescita e che danneggiano il DNA agenti 6. La fosforilazione di residui Ser / Thr alla regione C-terminale della IRF3 contenente il dominio di transattivazione viene attivato dopo l'attivazione da parte di virus, poli I: C o LPS in un tipo cellulare dipendente manner 15-17. C-terminale fosforilazione di IRF3 coinvolge non meno di 7 siti phosphoacceptor distinte organizzate in due gruppi principali, Ser385 / Ser386 e Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, che ogni contribuiscono all'attivazione IRF3 attraverso dimerizzazione, nucleare accumulazione, l'associazione con il CREB proteine -binding (CBP) / coattivatori p300, legame con IFN risposta elemento sensibile (ISRE) sequenze consenso e transattivazione di geni bersaglio 9,10,17-19 DNA. La fosforilazione di Thr390 è anche pensato per contribuire alla virale IRF3 attivazione 20. Spettrometria di massa analisi dei IRF3 hanno dimostrato che Ser386, Thr390, Ser396 e Ser402 residui sono direttamente phosphorylatcato per l'inibitore di chinasi kB ε (IKKε) / TANK-binding chinasi 1 (TBK1) chinasi 9,10. È anche necessario fosforilazione ai residui C-terminale per la terminazione di attivazione IRF3 attraverso polyubiquitination e proteasoma-mediata degradazione 10. Questo processo è anche dipendente dalla fosforilazione in Ser339, che è necessaria per l'assunzione della isomerasi Pin1 propile 10,11. Specie IRF3 contenenti almeno fosfo-Ser339 / 386/396 residui sono considerati forme iperfosforilata. L'esatta sequenza e la funzione di ogni sito rimane una questione di discussione 10,21. E 'ormai chiaro che IRF3 attivato non rappresenta uno stato omogeneo, ma che diverse specie che presentano caratteristiche di fosforilazione attivati o dimerizzazione distinti esiste 10,22.Per fornire una comprensione completa di attivazione IRF3 in risposta a patogeni specifici, è quindi necessario characterize che delle specie attivati sono indotti. Induzione di geni bersaglio IRF3, IFNB1 e IFIT1, ha dimostrato di fornire una lettura-out affidabile per l'attivazione IRF3. Tuttavia, il monitoraggio espressione di questi geni non fa distinzioni tra i diversi stati di attivazione del IRF3. Un'analisi completa di stati di attivazione IRF3 in un ambiente particolare si basa sulla caratterizzazione dettagliata della sua fosforilazione e dimerization stato di 10. Fosforilata (modulo I), ipofosforilata (modulo II) e iperfosforilata (forme III e IV) forme IRF3 6,18,23 può essere risolto con successo dalla mobilità ridotta ad alta risoluzione analisi SDS-PAGE. Specie IRF3 monomeri e dimeri possono essere efficacemente identificati con analisi nativo-PAGE. Questi approcci sono notevolmente migliorate quando usato in combinazione con gli anticorpi diretti contro phosphospecific siti IRF3 phosphoacceptor distinte.
Protocolli standard consentono una scarsa risoluzione diproteine che non consentono la separazione efficiente di IRF3 distinte forme fosforilate. Qui, descriviamo in dettaglio una procedura per realizzare la massima risoluzione per monitorare l'induzione di distinte specie IRF3 virus attivato mediante SDS-PAGE accoppiato ad nativo-PAGE in combinazione con immunoblot utilizzando anticorpi totali e phosphospecific. In vivo discriminazione tra i diversi attivato forme di IRF3 viene eseguita sulla base dei loro spostamenti mobilità osservati su SDS-PAGE. Inoltre, IRF3 monomero e dimero si distinguono per elettroforesi non denaturante. La combinazione di queste due tecniche complementari con immunoblot dimostra di essere un approccio accessibile e sensibile per acquisire tutte le informazioni necessarie per una completa analisi di attivazione fosforilazione mediata di IRF3.
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Protocol
NOTA: Il protocollo è descritto qui utilizzando cellule A549 infettate con il virus di Sendai (SeV). Tuttavia, il protocollo per SDS-PAGE e PAGE nativo funziona anche con tutti i tipi di cellule umane e murine testati finora, in particolare le cellule mieloidi stimolate con vari-IRF3 attivando 9,15,19,24,25 stimoli.
1. L'infezione di cellule A549
- Mantenere cellule A549 in coltura in una piastra 15 cm a 37 ° C / 5% di CO 2 in 20 ml F12K / mezzo Ham contenente il 10% di siero inattivato al calore fetale bovino (HI-FBS) e 1% di L-glutammina (completo F12K / Prosciutto di media).
NOTA: Tutte le soluzioni usate per la cultura e trattamenti con le cellule devono essere sterili. - A 24 ore prima dell'infezione, aspirare il terreno e lavare le cellule con 10 ml di acqua distillata tampone fosfato salino (PBS-D) a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA soluzione per ciascuna piastra per coprire le cellule e incubare a 37 ° C per 3 min.
- Fermare l'incubazione non appena thcellule e cominciano a staccarsi dalla piastra delicatamente toccando il piatto con una sola mano. Inattivare i tripsina aggiungendo 10 ml di completo F12K / Ham medio preriscaldato per piastra e trasferire le cellule in una provetta da 15 ml.
- Centrifugare a 350 xg per 3 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 8 ml di completo F12K / Ham mezzo per ottenere una sospensione omogenea di cellule singole.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Seme le cellule ad una densità di 1 x 10 6 cellule per piastra 60 mm in 4 ml di completo F12K / Ham medio pre-riscaldato. Incubare per 20 - 24 ore a 37 ° C / 5% CO 2. Dopo 20 - 24 ore, le cellule formano un monostrato confluente 90% (che corrisponde a 1,5 x 10 6 cellule).
- Rimuovere il supporto e lavare le cellule con 2 ml di F12K privo di siero / medio Ham (SFM). Aggiungere 2 ml di SFM fresca per 60 millimetri piatto.
- Scongelare una aliquota di Sendai virus (SeV) (conservato in aliquote a -80 ° C) su ghiaccio e vortex brevemente.
- Diluire °e virus in pre-riscaldato SFM per ottenere 60 HAU / 100 ml. Mescolare pipettando su e giù dolcemente e aggiungere 100 ml di virus diluito per piastra per eseguire l'infezione a 40 unità di agglutinazione / 10 6 cellule. Non aggiungere virus nella piastra di controllo non infetto.
- Incubare le cellule in incubatore a 37 ° C / 5% di CO 2. Agitare le piastre manualmente 3 o 4 volte, o utilizzando un agitatore orbitale o dondolo automatico collocato direttamente in incubatrice, durante la prima ora di infezione.
- A 2 ore dopo l'infezione, aggiungere 2 ml di F12K / Cam mezzo contenente 20% di HI-FBS per ottenere una concentrazione finale di 10% HI-FBS.
- Incubare le cellule in incubatore a 37 ° C / 5% di CO 2 per un ulteriore 1, 4 e 7 ore per raggiungere tempi totali infezione di 3, 6 e 9 ore, rispettivamente. In ciascuno di questi punti di tempo, procedere al punto 2.1.
2. Preparazione di estratti cellulari Whole (WCE)
- Rimuovere il supporto infezione. Raccogliere le cellule raschiando in 1 mldi ghiacciata D-PBS e trasferire la sospensione cellulare in un pre-raffreddata 1,5 ml provetta da centrifuga.
- Agglomerare le cellule per centrifugazione a 16.000 xg a 4 ° C per 20 sec e decantare accuratamente ogni traccia di D-PBS.
NOTA: A questo punto, il pellet cellulare può essere direttamente sottoposto ad estrazione proteina o congelati rapidamente in azoto liquido o ghiaccio secco / bagno di etanolo e conservato a -80 ° C fino lisi. - Preparare il tampone di lisi contenente 50 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 10% glicerolo e 1% Nonidet P-40 in acqua deionizzata (DDH 2 O). Estemporaneamente aggiungere proteasi (1 mg / ml leupeptina e 2 mg / ml aprotinina) e fosfatasi inibitori (fluoruro di sodio 5 mM, 1 mM attivato orthovanadate sodio, 2 mM p-nitrofenil fosfato e 10 mM β-glicerofosfato pH 7,5).
NOTA: Il tampone di lisi senza inibitori può essere conservato a 4 ° C. Un protocollo specifico per l'attivazione di orthovanadate sodio è descritto nella tabella di Reagenti Specifici / Equipment. - Risospendere il pellet di cellule in 70 ml di tampone di lisi. In genere la concentrazione lisato sarà di circa 2 mg / mL.
- Incubare in ghiaccio per 20 min. Flash-congelare il lisato mediante incubazione in un bagno di azoto liquido per 15 secondi. Scongelare il lisato a RT finché non è completamente fuso e vortex per 10 sec. Ripetere il congelamento / scongelamento / ciclo vortex per 3 volte.
- In alternativa, eseguire la fase di congelamento in un / bagno di ghiaccio secco di etanolo per 1 min.
- Centrifugare a 16.000 xga 4 ° C per 20 min. Trasferire il surnatante (corrispondente al WCE) in un pre-raffreddata 1,5 ml provetta da centrifuga. Tenere il WCE su ghiaccio in ogni momento.
- Quantificare le proteine utilizzando qualsiasi procedura di quantificazione di proteine compatibile con il tampone di lisi, come a base di Metodo di Bradford 26.
3. Risoluzione del WCE per alta risoluzione SDS-PAGE
- Preparare tre denaturazione gel elettroforesi.
- Per la rilevazione diForme IRF3, versare due gel di almeno 16 cm di lunghezza con un gel di separazione composto 7,5% acrilammide / bis-acrilammide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% sodio dodecil solfato (SDS ), 1% persolfato di ammonio e 0,1% TEMED in DDH 2 O e un gel di impilamento composto 4% acrilammide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% persolfato di ammonio e 0,1% TEMED in DDH 2 O.
Attenzione! Acrilamide, TEMED e SDS sono tossici e / o irritanti. Indossare guanti protettivi e manipolare sotto una cappa aspirante. - Per la rilevazione di proteine Sev, versare un gel di un minimo di 8,5 cm di lunghezza con caratteristiche simili al gel descritto in 3.1.1, tranne che il gel di separazione contiene il 12% di acrilammide.
- Per la rilevazione diForme IRF3, versare due gel di almeno 16 cm di lunghezza con un gel di separazione composto 7,5% acrilammide / bis-acrilammide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% sodio dodecil solfato (SDS ), 1% persolfato di ammonio e 0,1% TEMED in DDH 2 O e un gel di impilamento composto 4% acrilammide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% persolfato di ammonio e 0,1% TEMED in DDH 2 O.
- Denaturare WCE ottenuto nel passaggio 2,6 aggiungendo 1: 4 (v / v) di tampone 5x carico (125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), il 10% SDS, 20% (p / v) di glicerolo, 0,0005% blu di bromofenolo e 25% β-mercaptoetanolo in DDH 2 O) e successivamente riscaldati a 100 °C per 10 min. Giro veloce i tubi per far cadere la condensa che si forma nel tappo.
Attenzione! β-mercaptoetanolo è tossico per inalazione. Indossare guanti protettivi e manipolare sotto una cappa aspirante. - Montare i gel nell'apparato migrazione. Riempire le camere superiori e inferiori con corsa tampone contenente 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS e glicina 192 mM in acqua distillata (dH 2 O).
- Carico di 14 ml di standard di peso molecolare in un pozzetto di ogni gel 16 centimetri e 7 ml di standard di peso molecolare in un pozzetto del gel 8,5 centimetri. Carico 30 mg di WCE denaturato (preparato come descritto al punto 3.2) per pozzetto dei due gel previste al punto 3.1.1 per il rilevamento di forme IRF3. Carico 8-10 mg di WCE denaturato (preparato come descritto al punto 3.2) per bene sul gel preparato al punto 3.1.2 per l'analisi SeV.
- Eseguire il gel al 30 mA corrente costante fino al fronte migrazione raggiunge il fondo del gel.
NOTA: La migrazione in genere dura approssitamente 3 ore per un gel 16 centimetri e 45 minuti per un gel 8,5 centimetri. - Procedere al trasferimento su membrane di nitrocellulosa (fase 5).
4. Analisi dei IRF3 dimerizzazione da Native-PAGE
Nota: questo metodo è stato originariamente descritto dal gruppo del Dr. T. Fujita 27.
- Preparare i superiori (-) e inferiore (+) buffer di elettroforesi camera. Il buffer camera superiore è costituito da 25 mM Tris-HCl pH 8.4 (RT), glicina 192 mM e 1% sodio desossicolato (DOC) in DDH 2 O. Il buffer camera inferiore contiene 25 mM Tris-HCl pH 8.4 (RT) e 192 mM glicina in DDH 2 O.
NOTA: La camera di buffer di elettroforesi superiori ed inferiori possono essere conservati a 4 ° C fino al momento dell'uso. Tuttavia, assicurarsi che siano pre-riscaldato a RT prima di eseguire la elettroforesi. - Versare un gel non denaturante risoluzione di un minimo di 8.5 cm di lunghezza, contenente 7,5% di acrilammide / bis-acrilammide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% ammonio persolfato e 0,1% TEMED in DDH 2 O.
- Pre-eseguire il gel a 40 mA corrente costante per 30 min in ghiaccio. Premere il funzionamento dell'apparato nel ghiaccio approssimativamente al livello del buffer elettroforesi camera inferiore. È importante che il gel non è nel ghiaccio.
- Durante la pre-corsa, mix WCE tenuti in ghiaccio con 2x nativo-PAGE tampone di caricamento 1: 1 (v / v) contenente 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), il 30% di glicerolo e 0,1% blu di bromofenolo in DDH 2 O.
- Carico 8 - 10 mcg WCE (preparato come descritto al punto 4.4) immediatamente al termine della pre-corsa.
- Eseguire il gel a 25 mA corrente costante sul ghiaccio, come descritto sopra per il pre-corsa, finché il fronte migrazione raggiunge il fondo del gel (circa 40 min).
5. Immunoblot analisi di IRF3 specie
- Preparare il buffer di trasferimento contenente 25 mM Tris-Base e 192 mM glicina in DDH 2 O. Refrigerare il buffer di trasferimento a 4 ° C prima dell'uso.
- Wet tre pezzi di membrana di nitrocellulosa tagliato a dimensioni leggermente più grandi dei gel in una scatola di plastica / vetro contenente il buffer di trasferimento. Indicare l'orientamento della membrana tagliando un angolo. Il buffer di trasferimento può essere riutilizzata per 3 volte. Conservare il tampone a 4 ° C tra usi.
- Non convertito i gel (SDS-PAGE e nativo-PAGE) e tagliare un angolo di ogni gel per l'orientamento corretto.
- Per nativo-PAGE, incubare il gel a RT in agitazione per almeno 30 min nel buffer SDS-PAGE corrente per eliminare la DOC prima del trasferimento al buffer di trasferimento.
- Incubare i gel (SDS-PAGE e nativo-PAGE) nel buffer di trasferimento per 5 - 10 minuti.
- Montare un panino trasferimento al gel in una cassetta di trasferimento con la membrana verso l'elettrodo positivo (carta pad / filtro antipolline / membrana / gel / carta da filtro / tappetino in gomma). Fate attenzione a rimuovere tutte le bolle tra gli strati del sandwich.
- Eseguire il trasferimento come consigliato by il produttore per il dispositivo di trasferimento utilizzato.
NOTA: Eseguire tutte le incubazioni e lavaggi nei prossimi passi su una piattaforma di scuotimento a dondolo o orbitale. - Al termine del tempo di trasferimento, incubare le membrane per 15 min in soluzione di fissaggio contenenti acido acetico 7%, 40% etanolo e 3% glicerolo in DDH 2 O. Lavare le membrane 3x 5 minuti in PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10,2 mm Na 2 HPO 4 e 1,8 mm KH 2 PO 4 in dH 2 O).
Attenzione! L'acido acetico è tossico, irritante e infiammabile. Indossare guanti protettivi e manipolare sotto la cappa.
NOTA: La soluzione di fissaggio può essere riutilizzato più volte. - Per la membrana nativo-PAGE passare direttamente al punto 5.11.
- Risciacquare le tre membrane SDS-PAGE rapidamente in dH 2 O prima incubazione per 1 min in soluzione contenente 6,57 ponceau rosso mM ponceau rosso e 1% di acido acetico in DDH 2 O.
NOTA: La soluzione ponceau rosso può essere r eused più volte. - Sciacquare le membrane in dH 2 O fino a quando lo sfondo è bianco abbastanza per vedere le bande di proteine colorate in rosso. Nota i marcatori con una matita e tagliare la membrana in eccesso intorno alle proteine. Decolorare le membrane di incubazione per 5 min in PBS sotto agitazione.
- Incubare le membrane per 1 ora a RT o O / N a 4 ° C in soluzione di bloccaggio (PBS contenente 0,05% di Tween 20 e latte in polvere 5% non grasso (PBS-T-latte). Lavare le membrane 3x 5 min in PBS-T.
NOTA: Il lavaggio PBS-T è facoltativo e solo strettamente necessario quando si applica anticorpi diluiti in PBS-T contenente il 5% di albumina di siero bovino (PBS-T-BSA) (Figura 1 e Tabella 1) nel passaggio successivo. - Incubare le quattro membrane (da SDS-PAGE e nativo-PAGE) con gli anticorpi primari secondo l'ordine sequenziale descritto nella figura 1 e nella tabella 1. Eseguire 5x 5 min lavaggi in PBS-T.
Figura 1. Sequenza di analisi immunoblot. Lo schema descrive le singole SDS-PAGE e nativo-PAGE gel necessari per rilevare le varie forme fosforilate e monomeriche / dimerica IRF3. L'ordine specifico di anticorpi applicate alla membrana risultante da ogni gel nella procedura immunoblot è descritta. Si noti che gli anticorpi anti-actina sono utilizzati prima di garantire parità di caricamento dei campioni prima applicare altri anticorpi specifici. La sequenza alternata, con anticorpi anti-actina applicata dopo gli anticorpi anti-fosfo-IRF3, funziona anche. Spogliarello viene utilizzato tra anti-actina e anticorpi anti-Sev, o tra anti-fosfo-IRF3 e gli anticorpi anti-IRF3 a causa delle dimensioni dei segnali di sovrapposizione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Gli anticorpi primari | Diluizione | Tampone di diluizione | Incubazione | Anticorpi secondari | Commenti |
| Anti-actina | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | 15 min a temperatura ambiente | Anti-topo | Utilizzare dopo SDS-PAGE Antibodyies diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservato a 4 ° C in presenza di 0,02% di sodio azide. |
| Anti-IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N a 4 ° C | Anti-coniglio | Utilizzare dopo Native-PAGE. Si raccomanda di non riutilizzare l'anticorpo diluito |
| Anti-IRF3-P-Ser396 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N a 4 ° C | Utilizzare dopo SDS-PAGE. Si raccomanda di non riutilizzare il diluito anticorpi anti-IRF3-P-396 è disponibile da Cell Signaling anche. Diluizione ottimale è stata definita come 1 / 1.000 per questo anticorpo, ma può variare tra i lotti. | |
| Anti-IRF3-P-Ser398 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N a 4 ° C | Anti-coniglio | Utilizzare dopo SDS-PAGE. Si raccomanda di non riutilizzare l'anticorpo diluito |
| Anti-IRF3 lunghezza | 1 / 7.500 | PBS-T latte | 3 ore a temperatura ambiente | Anti-coniglio | Utilizzare dopo SDS-PAGE. Anti-IRF3 anticorpo piena lunghezza può essere utilizzato dopo nativo-PAGE, ma è meno sensibile per rilevare il monomero. Anticorpi diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservato a 4 ° C in presenza di 0,02% di sodio azide. |
| Anti-IRF3-NES | 0,5 mg / ml | PBS-T latte | 3 ore a temperatura ambiente | Anti-coniglio | Utilizzare dopo Native-PAGE. Antibodyies diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservato a 4 ° C in presenza di 0,02% di sodio azide. |
| Anti-SeV | 1 / 14.000 | PBS-T-BSA | 3 ore a temperatura ambiente | Anti-coniglio | Utilizzare dopo SDS-PAGE. Antibodyies diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservato a 4 ° C in presenza di 0,02% di sodio azide. |
| NOTA: diluizione e buffer utilizzato per anticorpi secondari HRP-accoppiati devono essere ottimizzati in quanto varia da una compagnia all'altra. | |||||
Tabella 1. Specifiche di anticorpi utilizzati nella Procedura Immunoblotting.
- Incubare le membrane con la perossidasi di rafano (HRP) coniugata anticorpi secondari come specificato nella figura 1 e nella tabella 1. Lavare le membrane 5x 5 min in PBS-T, seguito da 2x 5 min in PBS per rimuovere completamente le tracce di Tween.
- Incubare le membrane per 1 min in un volume di reagente chemiluminescenza potenziata sufficiente a coprire completamente le membrane. Essiccare le membrane con carta da filtro.
- Collocare le membrane in un analizzatore di immagini luminescenti per visualizzare le bande immunoreattive.
- In alternativa, effettuare il rilevamento di bande immunoreattive utilizzando radiografie sensibili.
- Lavare le membrane 3x 5 minuti in PBS.
NOTA: A questo punto le membrane possono essere mantenuti asciutti. Tuttavia, se è necessario un ulteriore strippaggio, è preferibile eseguire la spellatura prima di asciugare la membrana. Le membrane possono anche essere memorizzati per breve termine in PBS. - Per le membrane che non richiedono strippaggio tra incubazione con anticorpi (vedi Figura 1) passare direttamente al punto5.20.
- Quando è richiesto strippaggio tra anticorpi (vedi Figura 1), incubare le membrane in soluzione preriscaldata strippaggio contenente 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) e 0,7% β-mercaptoetanolo in DDH 2 O a 50 ° C per 20 minuti in agitazione regolare. Lavare le membrane 3x 5 minuti in PBS.
NOTA: Agitazione durante la procedura di stripping è la chiave. Spelatura può essere eseguita in un fornetto. In alternativa, lo strippaggio può essere eseguita utilizzando membrane sigillate in sacchetti di plastica e immersi in un bagno d'acqua. In questo caso, è importante per agitare le membrane 4 - 5 volte durante l'incubazione. - Incubare le membrane per 1 ora a RT o O / N a 4 ° C in PBS-T-latte.
- Ripetere i passaggi 5,12-5,16 di figura 1.
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Representative Results
La figura 2 mostra una tipica immagine immunoblot di IRF3 rilevato con IRF3 totale anticorpi e anticorpi IRF3-phosphospecific contro Ser396 e Ser398 dopo la risoluzione di WCE da ad alta risoluzione SDS-PAGE. Nelle cellule A549 stimolate, IRF3 viene rilevato come due bande a 50 e 53 kDa in SDS-PAGE corrispondente alla non fosforilata (modulo I) e il ipofosforilata (modulo II) specie di IRF3. L'esposizione delle cellule A549 di Sev per 3 - 9 risultati hr in uno spostamento tempo-dipendente per la migrazione lentamente forme iperfosforilata III e IV, che sono ben distinte dalle forme I e II. Le bande iperfosforilata migrano a 55-57 kDa. Le forme III e IV sono anche specificamente immunodetected utilizzando gli anticorpi contro phosphospecific Ser396 e Ser398. L'immunolocalizzazione di actina serve da controllo di parità di carico tra le corsie. Un controllo dell'infezione SeV è indicata dall'accumulo del nucleocapside del virus protein (N), che migra a 60 kDa.
Nella Figura 3, il profilo di rilevamento di IRF3 ottenuto da WCE risolto native-PAGE seguita da immunoblot con anticorpi anti-IRF3-NES e anticorpi contro phosphospecific Ser386 è mostrato. Nelle cellule A549 stimolate, IRF3 viene rilevato come una singola banda corrispondente alla forma monomerica. Dopo infezione con SeV per 3 - 9 ore, i livelli di IRF3 diminuzione monomero con un accumulo concomitante di una banda lentamente migrazione che corrisponde alla forma dimerica di IRF3. Gli anticorpi contro phosphospecific Ser386 rilevano solo specie IRF3 dimero.
Figura 2. Rilevamento di IRF3 distinta fosforilate Specie (modulo I-IV) indotto da SeV infezione in cellule A549. Le cellule A549 sono stati lasciati non infetti o infettati con SeV per la indicatempi TED. WCE sono stati analizzati da ad alta risoluzione SDS-PAGE seguita da immunoblot (IB) con anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) e anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) anticorpi phosphospecific e anti pieni di anticorpi della proteina lunghezza -IRF3. L'infezione è stata monitorata mediante anticorpi anti-Sev (la proteina nucleocapside N viene mostrata). Gli anticorpi anti-actina sono stati utilizzati come controllo di carico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Monitoraggio del Phosphorylated / dimerizzate induzione IRF3 da SeV in cellule A549. Cellule A549 sono stati lasciati non infetti o infettati con SeV per i tempi indicati. WCE sono state risolte da native-PAGE e rivelato da immunoblot utilizzando anticorpi anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) anticorpi phosphospecific e anti-IRF3-NES ANTIBodies. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo che descriviamo qui costituito da una combinazione di alta risoluzione SDS-PAGE e native-PAGE accoppiato all'utilizzo di diversi anticorpi phosphospecific distinguere il monomero / dimero e phosphoforms I-IV di IRF3. Rilevazione adeguata di queste specie IRF3 è essenziale per caratterizzare completamente attivazione IRF3 in un ambiente specifico. Per esempio, LPS stimolazione dei macrofagi attivati porta alla formazione di dimerica, Ser396 / 398 IRF3 fosforilata che presenta un ipofosforilata (modulo II), ma non iperfosforilato (forma III e IV), modello in SDS-PAGE 15. Utilizzando il protocollo descritto, questo profilo può essere distinto da forme iperfosforilata virus-indotto che richiedono ulteriore fosforilazione Ser339 oltre a Ser386 e Ser396 fosforilazione 10. È importante sottolineare che questo permette anche discriminare tra le specie Ser396 fosforilata che non presentano dimerizzazione, ma sono trascrizionalmente attivi 10. Sonoportantly, occorre notare che il modello modulo I-IV di phosphoforms IRF3 applicata alla IRF3 umana. Murine IRF3 non presenta un andamento simile e quindi l'attivazione di IRF3 è caratterizzato solo con l'uso di anticorpi phosphospecific in immunoblot dopo SDS-PAGE e nativo-PAGE.
Il raggiungimento di una separazione alta risoluzione delle specie fosforilati distinte di IRF3 mediante SDS-PAGE richiede parametri specifici. Per una risoluzione adeguata, è molto importante usare gel che hanno una lunghezza minima di 16 cm. Anche con questa lunghezza di gel di separazione, è la chiave per far fronte migrazione raggiunge il fondo del gel per ottenere un'adeguata separazione delle diverse forme IRF3. Inoltre, il gel di impilamento deve estendersi ad un minimo di 1 cm sotto il pettine di ottenere bande ben definite. Questo è importante, come le forme di hyperphosphorylated IRF3 migrano molto vicini l'uno all'altro. Scarsamente fasce mirate si tradurrà in mancanza di distinzione tra phosphorylated forma compromettere la loro rispettiva quantificazione. Inoltre, la concentrazione di persolfato di ammonio e TEMED variano da un protocollo SDS-PAGE all'altro. Variazione queste concentrazioni da quelli citati è stata trovata a limitare considerevolmente la risoluzione nella separazione delle specie IRF3.
Rilevazione di formazione IRF3 dimero attraverso il nativo-PAGE è stata originariamente descritta dal gruppo del Dr. T. Fujita. Questo protocollo utilizza tampone contenente DOC che permette la dissociazione del dimero IRF3 da CBP / p300 27. Si consiglia vivamente di procedere ad nativo-PAGE subito dopo la lisi cellulare come deposito della WCE a -80 ° C è risultato provocare una significativa alterazione del rapporto IRF3 monomero / dimero. Inoltre, è molto importante che il pH dei tamponi camera superiore e inferiore viene portata a pH 8,4 a temperatura ambiente, e non a 4 ° C, dopo la miscelazione di tutti i componenti per realizzare un'adeguata separazione del monomero vs dimero. Una separazionegel con una lunghezza minima di 8,5 cm permette adeguata separazione delle IRF3 monomero e dimero. Il volume ideale di campione più tampone di caricamento è di circa 8 microlitri di 5 mm e la risoluzione è migliore quando il volume è ridotto al minimo. Pertanto, è importante utilizzare il minor volume di tampone di lisi per ottenere WCE ad alta concentrazione. Tuttavia, si deve tenere conto del fatto che l'estrazione delle proteine efficiente richiede lisi in almeno 5 volte il volume del pellet. Se il volume del campione supera il limite sopra indicato, questo comporterebbe scarsa risoluzione del monomero / dimero. Questo può essere risolto aggiungendo un gel di impilamento contenente 4% acrilamide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 1% persolfato di ammonio e 0,1% TEMED in DDH 2 O. E 'molto importante caricare i campioni senza disturbare bande. Caricamento lentamente con un gel-loading punta vicino al fondo del pozzo dà ottimi risultati.
Qui, descriviamo in vivo detection di fosforilazione di specifici residui utilizzando anticorpi phosphospecific attualmente disponibili contro Ser386 9, 19 e Ser398 Ser396 15. L'uso di mutanti IRF3 e spettrometria di massa analisi hanno confermato che questi residui sono fosforilata dopo l'infezione del virus o sovraespressione di IKKε chinasi / TBK1 e sono fondamentali per l'attivazione IRF3 6,9,10,19,21. L'immunolocalizzazione di fosfo-Ser396, fosfo-Ser398 e IRF3 totale dopo SDS-PAGE richiede l'utilizzo di due gel identici (Figura 1). Infatti, significativa perdita di sensibilità si osserva quando anticorpi phosphospecific vengono utilizzati dopo la rimozione della membrana. Pertanto, si raccomanda vivamente di utilizzare anticorpi phosphospecific prima. Si noti che gli anticorpi primari e secondari alternativi possono anche funzionare, ma le diluizioni e la sequenza di utilizzo specifici dovrebbero essere ottimizzati. Per l'analisi IRF3, 30 mg di WCE è opportuno ottenere una rilevazione significativo di IRF3fosforilazione by immunoblot utilizzando anticorpi indicati durante l'utilizzo di 4 mm di larghezza pozzi. Anche se in molti tipi di cellule infettate con diversi virus di 30 mg è risultato essere adeguata, tale importo potrebbe essere necessario aumentare a seconda del tipo di cellula e di stimolo. È preferibile utilizzare estratti freschi per SDS-PAGE, ma la rilevazione di IRF3 fosforilazione utilizzando gli anticorpi phosphospecific descritti in questo documento è abbastanza stabile da consentire un giro di stoccaggio del WCE a -80 ° C prima dell'analisi. Le concentrazioni di inibitori di fosfatasi qui descritti sono risultati essere insufficiente quando si utilizza cellule A549. Concentrazioni maggiori non sono stati trovati per ottenere risultati migliori. Tuttavia, queste concentrazioni potrebbe essere necessario aumentare quando si studia attivazione IRF3 in tipi di cellule che presentano alti livelli di attività di fosfatasi. È importante sottolineare che la fosforilazione di IRF3 ei meccanismi sottostanti sono ancora lungi dall'essere compreso. Pertanto, un pannello completo di Ser / thr- e Tyr-fosfatasi ininibitori viene utilizzato per bloccare possibili attività ancora non caratterizzate che potrebbero influenzare il rilevamento di IRF3 fosforilazione, dimerizzazione e degrado. Per il rilevamento di IRF3 monomero e dimero dopo maggior parte delle infezioni virali e nella maggior parte dei tipi di cellule, 8 - 10 mcg WCE è risultato sufficiente. Tuttavia, la maggiore quantità di proteine può essere necessaria per la stimolazione attivazione IRF3 meno efficiente. Gli anticorpi contro phosphospecific Ser386 utilizzati in questo studio sono raccomandati per essere utilizzati in nativo PAGE come sensibilità denaturazione SDS-PAGE è molto debole. Inoltre, la fosforilazione in Ser386 propone di correlare con la forma dimerica di IRF3 9, rendendo così l'uso di questi anticorpi in nativo-PAGE una strategia appropriata per confermare questo concetto in un ambiente specifico. Da segnalare, anticorpi alternative sono disponibili da varie aziende e sono rivendicati per rilevare in modo efficiente fosfo-Ser386 dopo SDS-PAGE. Anticorpi Phosphospecific contro Ser396 sono stati anche in modo efficiente used per rilevare IRF3 fosforilazione dopo nativo-PAGE 20. È importante sottolineare che, Ser402 nel cluster C-terminale di siti phosphoacceptor è stato anche trovato ad essere importante per l'attivazione IRF3 e la fosforilazione di Ser402 è stata osservata attraverso l'analisi di spettrometria di massa IKKε / TBK1-fosforilata IRF3 10,21,28. Tuttavia, nonostante due diverse tentativi (NG, inedito), anticorpi phosphospecific sono attualmente disponibili a seguire la fosforilazione di questo residuo specifica in vivo. Si noti che gli anticorpi contro phosphospecific Thr157 e Ser339 sono stati descritti 11,13. Questi anticorpi aggiuntivi phosphospecific potrebbero essere utilizzati in un procedimento ad alta risoluzione SDS-PAGE simile a quello descritto qui. In questo caso, ulteriori ampi gel SDS-PAGE sarebbero necessari per ciascun anticorpo e trattati allo stesso modo come gel # 2 (Figura 1). A nostra conoscenza sono ancora stati descritti anticorpi phosphospecific contro Ser173 o Thr390,ma potrebbero essere facilmente aggiunte al protocollo descritto qui una volta che diventano disponibili 14,20.
Attività IRF3 è terminato da proteasoma-mediata degradazione delle forme iperfosforilata 11,17. Il protocollo qui descritto consente anche il monitoraggio di degradazione IRF3 quando la cinetica di stimolazione è prolungata ed è accoppiato con l'uso di inibitori del proteasoma (MG132, lactacistina o bortezomid). In genere, nelle cellule A549 infettate con SeV a 40 unità di agglutinazione / 10 6 cellule, IRF3 fosforilazione inizia appena 2 ore post-infezione e SeV IRF3 degradazione inizia dopo 12 ore. Degradazione proteasoma-mediata si concluderà dalla diminuzione osservata delle forme III e IV livelli in momenti in ritardo che si riverseranno negli condizioni con inibitori del proteasoma. Questo sarà anche tradurre in nativo-PAGE in una diminuzione dei livelli di dimero IRF3 che vengono recuperati in seguito al trattamento inibitore del proteosoma 29. È importante sottolineare che, ad alta risoluzione technique presentata qui permette di differenziare tra il processo di degradazione e di una mancanza di attivazione. Infatti, sia la degradazione e la mancanza di attivazione del risultato IRF3 in assenza di rilevamento di dimero / fosfo-Ser386 / 396. Tuttavia, la mancanza di attivazione è associata con la rilevazione di IRF3 monomero e di forme I e II, mentre queste specie IRF3 non vengono rilevati quando IRF3 viene degradata 30.
Immunoprecipitazione accoppiata con analisi basate spettrometria di massa è un metodo di scelta per rilevare la fosforilazione in vivo di IRF3 in siti distinti. Questa tecnica è stata utilizzata per confermare la fosforilazione di IRF3 a Ser173, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 e Ser402 residui 10,20,21. Tuttavia, la spettrometria di massa non è ancora una tecnica conveniente / benchside che può essere facilmente utilizzato per analisi giornaliera di attivazione IRF3 dopo diversi stimoli in diversi punti temporali. Pertanto, la procedura descritta qui utilizzando SDS-PAGE accoppiato nativa PAGE in combinazione con immunoblot utilizzando anticorpi totali e phosphospecific costituisce un approccio pratico, accessibile e sensibile per rilevare tutte le forme attualmente definiti di actived IRF3.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
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