Introduction
Den ubiquitously och konstitutivt uttryckt transkriptionsfaktor Interferon (IFN) reglerande faktor 3 (IRF3) är avgörande för den första försvarslinjen mot patogener huvudsakligen genom induktion av IFNp, men också genom induktion av kemokin (CC motiv) ligand 5 (CCL5 ) och flera antivirala proteiner inkluderande IFN-inducerat protein med tetratricopeptide upprepar IFIT1 / 2 / tre från 1 till 3. IRF3 aktivering har rapporterats efter infektion med många virus, eller exponering för polyinosinic-polycytidylsyra (poly I: C) eller lipopolysackarid (LPS) 4. Viktigt har mest studerade virus utvecklat mekanismer för att kringgå IRF3-medierat svar, och därigenom undgå värdens medfödda immunförsvaret 5. Således, övervakning IRF3 aktivering är av stor betydelse för att förstå de molekylära mekanismerna i det medfödda antivirala värdförsvaret, men också för att identifiera den strategi som används av virus för att motverka denna respons.
ent "> Många publicerade rapporter ger dock endast en begränsad analys av IRF3 aktivering utförs av övervakningen av IRF3-målgen induktion (IFNB1 och IFIT1) och / eller luciferas reportergenanalys kopplad till låg upplösning natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS- PAGE) -analys av IRF3. emellertid talrika biokemiska studier, analys av beteendet hos olika IRF3 mutanter och belysning av IRF3 kristallstruktur 6-11 har bidragit till att visa att IRF3 utsätts för en komplex uppsättning av sekventiella posttranslationella modifieringar av fosforylering vid multipla ställen. Uppsättningen av fosforylering involverad i IRF3 aktivering tycks vara beroende av stimulus och troligen på celltypen. I oinfekterade celler, samexisterar IRF3 som icke-fosforylerade och hypofosforylerade arter innehållande phosphoresidues, inklusive Thr135 och Ser173, i en -198 aa N-terminal region 6,12-14. Ansamling av denna hypofosforylerade form av IRF3 induceras genom spännings inducerare, tillväxtfaktorer och DNA-skadande medel 6. Fosforylering av Ser / Thr-rester vid C-terminala regionen av IRF3 innehållande transaktiveringsdomänen utlöses efter aktivering av virus, poly-I: C eller LPS i en cell-typ beroende sätt 15-17. C-terminal fosforylering av IRF3 innebär inte mindre än 7 olika phosphoacceptor platser organiserad i två huvudsakliga grupper, Ser385 / Ser386 och Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, att varje bidrar till IRF3 aktivering genom dimerisering, kärnackumulering, tillsammans med CREB -bindande protein (CBP) / P300 samaktivatorer, DNA-bindning till IFN känsliga svarselement (ISRE) konsensussekvenser och trans av målgener 9,10,17-19. Fosforylering av Thr390 är också tänkt att bidra till virusinducerad IRF3 aktivering 20. Masspektrometri analyser av IRF3 har visat att Ser386, Thr390, Ser396 och Ser402-resterna direkt phosphorylated av hämmare av KB-kinas ε (IKKε) / TANK-bindande kinas 1 (TBK1) kinaser 9,10. Fosforylering vid de C-terminala rester krävs också för terminering av IRF3 aktiveras via polyubiquitinering och proteasom-medierad nedbrytning 10. Denna process är också beroende av fosforylering vid Ser339, vilket är nödvändigt för rekrytering av propyl isomeras Pin1 10,11. IRF3 arter som innehåller åtminstone fosfor-Ser339 / 386/396 rester anses hyperfosforylerat former. Den exakta sekvensen och funktion på varje plats är fortfarande en fråga för diskussion 10,21. Det är nu klart att aktivt IRF3 inte utgör ett homogent tillstånd, men att olika aktiverade arter som uppvisar tydliga fosforylering eller dimeriseringsegenskaper existerar 10,22.För att ge en fullständig förståelse av IRF3 aktivering som svar på specifika patogener, är det således nödvändigt att characterize vilken av de aktiverade ämnen induceras. Induktion av IRF3 målgener, IFNB1 och IFIT1, har visat sig ge en tillförlitlig avläsning för IRF3 aktivering. Men övervakning uttryck av dessa gener skiljer inte mellan olika aktiveringstillstånd IRF3. En omfattande analys av IRF3 aktiveringstillstånd i en viss miljö bygger på detaljerad beskrivning av dess fosforylering och dimeriseringsstatus 10. Ofosforylerad (formulär I), hypofosforylerade (blankett II) och hyperfosforylerat (formulär III och IV) IRF3 former 6,18,23 framgångsrikt kan lösas genom nedsatt rörlighet i hög upplösning SDS-PAGE-analys. Monomera och dimera IRF3 arter kan effektivt identifieras genom nativ-PAGE-analys. Dessa tillvägagångssätt är starkt förbättrad vid användning i kombination med fosfospecifik antikroppar riktade mot distinkta IRF3 phosphoacceptor sajter.
Standardprotokoll tillåta en dålig upplösning avproteiner som inte tillåter effektiv separation av distinkta IRF3 fosforylerade former. Här beskriver vi i detalj ett förfarande för att uppnå den högsta upplösningen för att övervaka induktion distinkta virus aktiverat IRF3 som använder SDS-PAGE kopplad till nativ-PAGE i kombination med immunoblot med användning av totalt och fosfospecifik antikroppar. In vivo diskriminering mellan de olika aktiverade former av IRF3 utförs baserat på deras rörlighetsskiftningar som observerats på SDS-PAGE. Dessutom kan IRF3 monomer och dimer särskiljas genom icke-denaturering elektrofores. Kombinationen av dessa två kompletterande tekniker med immunoblot visar sig vara ett prisvärt och känslig metod för att skaffa all information som behövs för en fullständig analys av fosforylering-medierad aktivering av IRF3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Protokollet beskrivs här med användning av A549-celler infekterade med Sendai-virus (SeV). Men protokollet för SDS-PAGE och naturlig PAGE fungerar även med alla celltyper humana och murina testats hittills, i synnerhet myeloida celler stimulerade med olika IRF3 aktiverande stimuli 9,15,19,24,25.
1. Infektion av A549-celler
- Behåll A549-celler i odling i en 15 cm platta vid 37 ° C / 5% CO2 i 20 ml F12K / Ham-medium innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (HI-FBS) och 1% L-glutamin (komplett F12K / Ham-medium).
OBS: Alla de lösningar som använts för cellodling och behandlingar måste vara sterila. - Vid 24 h före infektionen, aspirera mediet och tvätta cellerna med 10 ml destillerat fosfatbuffrad saltlösning (D-PBS) vid rumstemperatur.
- Tillsätt 1 ml 0,25% trypsin-EDTA-lösning till varje platta för att täcka cellerna och inkubera vid 37 ° C under 3 minuter.
- Stoppa inkubationen så snart the celler börjar att lossna från plattan genom mjukt knacka plattan med en hand. Inaktivera trypsin genom tillsats av 10 ml av förvärmd komplett F12K / Ham medium per platta och överföra celler till en 15 ml koniska rör.
- Centrifugera vid 350 xg under 3 min vid RT. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i 8 ml komplett F12K / Ham-medium för att erhålla en homogen enda cellsuspension.
- Räkna cellerna med användning av en hemocytometer. Seed cellerna vid en densitet av 1 x 10 6 celler per 60 mm platta i 4 ml förvärmd komplett F12K / Ham-medium. Inkubera i 20 - 24 h vid 37 ° C / 5% CO 2. Efter 20 - 24 timmar, cellerna bildar en 90% sammanhängande monoskikt (detta motsvarar 1,5 X 10 6 celler).
- Avlägsna mediet och tvätta cellerna med 2 ml serumfritt F12K / Ham-medium (SFM). Tillsätt 2 ml färskt SFM per 60 mm platta.
- Tina en alikvot av Sendai-virus (SeV) (lagrad i alikvoter vid -80 ° C) på is och vortexa kort stund.
- Späd the virus i förvärmd SFM för att erhålla 60 HAU / 100 pl. Blanda genom att pipettera upp och ned mjukt och tillsätt 100 pl utspätt virus per platta att utföra infektion vid 40 HAU / 10 6 celler. Tillsätt inte virus i den icke-infekterade kontrollplatta.
- Inkubera cellerna i inkubator vid 37 ° C / 5% CO2. Skaka plattorna för hand 3 eller 4 gånger, eller med en automatisk orbital eller gunga skakapparat placeras direkt i inkubatorn, under den första timmen för infektion.
- Vid 2 h efter infektion, tillsätt 2 ml av F12K / Hams medium innehållande 20% HI-FBS för att erhålla en slutlig koncentration av 10% HI-FBS.
- Inkubera cellerna i inkubator vid 37 ° C / 5% CO2 under ytterligare 1, 4 och 7 timmar att nå totala infektionstider på 3, 6 och 9 timmar, respektive. Vid vart och ett av dessa tidpunkter, gå vidare till steg 2.1.
2. Beredning av Helcellextrakt (WCE)
- Ta bort infektionen mediet. Skörda cellerna genom skrapning i 1 mliskall D-PBS och överför cellsuspensionen till en i förväg kyld 1,5 ml centrifugrör.
- Pellets cellerna genom centrifugering vid 16.000 xg vid 4 ° C under 20 sek och försiktigt dekan alla spår av D-PBS.
OBS: I detta steg, kan cellpelleten direkt underkastas proteinextraktion eller flash frystes i flytande kväve eller torr is / etanol-bad och lagrades vid -80 ° C tills lys. - Förbered lysbuffert innehållande 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% glycerol och 1% Nonidet P-40 i avjoniserat vatten (DDH 2 O). Extemporarily lägga proteas (1 | ig / ml leupeptin och 2 pg / ml aprotinin) och fosfatasinhibitorer (5 mM natriumfluorid, 1 mM aktiverade natriumortovanadat, 2 mM p-nitrofenylfosfat och 10 mM β-glycerofosfat pH 7,5).
OBS: lysbuffert utan inhibitorer kan lagras vid 4 ° C. Ett specifikt protokoll för aktivering av natriumortovanadat beskrivs i Tabell över specifika reagenser / Equipment. - Resuspendera cellpelleten i 70 | il lysbuffert. Typiskt lysatet koncentrationen kommer att vara runt 2 mikrogram / l.
- Inkubera på is under 20 minuter. Flash-frysa lysatet genom inkubering i en bad med flytande kväve under 15 sekunder. Tina lysatet vid RT tills den är helt smält och vortexblanda i 10 sek. Upprepa frys / tö / virvel cykel 3 gånger.
- Alternativt utför frysningssteget i en etanol / torr isbad under 1 minut.
- Centrifugera vid 16 tusen xg vid 4 ° C under 20 minuter. Överför supernatanten (motsvarande WCE) i ett annat i förväg kyld 1,5 ml centrifugrör. Håll WCE på is hela tiden.
- Kvantifiera proteiner med användning av något protein kvantifiering förfarande är förenligt med lysbufferten såsom Bradford-baserade proteinanalys 26.
3. Beslut av WCE av högupplöst SDS-PAGE
- Förbered tre denature elektroforesgeler.
- För detektering avIRF3 former, häll två geler på minst 16 cm längd med en separation gel bestående av 7,5% akrylamid / bis-akrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% ammoniumpersulfat och 0,1% TEMED i DDH 2 O och en staplingsgel sammansatt av 4% akrylamid, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% ammoniumpersulfat och 0,1% TEMED i DDH 2 O.
Försiktighet! Akrylamid, TEMED och SDS är giftiga och / eller irriterande. Skyddshandskar och manipulera i ett dragskåp. - För detektion av SeV proteiner, häll en gel på minst 8,5 cm längd med liknande egenskaper som gelén som beskrivs i 3.1.1, förutom att separations gel innehåller 12% akrylamid.
- För detektering avIRF3 former, häll två geler på minst 16 cm längd med en separation gel bestående av 7,5% akrylamid / bis-akrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% ammoniumpersulfat och 0,1% TEMED i DDH 2 O och en staplingsgel sammansatt av 4% akrylamid, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% ammoniumpersulfat och 0,1% TEMED i DDH 2 O.
- Denaturera WCE erhållits i steg 2,6 genom tillsats av 1: 4 (volym / volym) 5x laddningsbuffert (125 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p / volym) glycerol, 0,0005% bromfenolblått och 25% β-merkaptoetanol i DDH 2 O) följt av upphettning vid 100 °C i 10 minuter. Snabbcentrifuge rören för att få ner kondens som bildas i locket.
Försiktighet! β-merkaptoetanol är giftig vid inandning. Skyddshandskar och manipulera i ett dragskåp. - Montera geler i migrationsapparaten. Fyll övre och undre kammare med rinnande buffert innehållande 25 mM Tris-bas, 0,1% SDS och 192 mM glycin i destillerat vatten (dH 2 O).
- Last 14 il molekylvikt standard i en brunn i varje 16 cm gel och 7 il molekylvikt standard i en brunn på 8,5 cm gel. Belastning 30 ug av denaturerat WCE (framställd såsom beskrivs i steg 3,2) per brunn av de två gelerna som framställts i steg 3.1.1 för IRF3 former detektering. Belastning åtta - tio ug av denaturerat WCE (framställd såsom beskrivs i steg 3,2) per brunn på gelén som framställts i steg 3.1.2 för SeV-analys.
- Kör geler vid 30 mA konstant ström till dess att migrations front når botten av gelén.
OBS: Migration varar vanligtvis approximabart 3 h under en 16 cm gel och 45 min för en 8,5 cm gel. - Gå vidare till överföring till nitrocellulosamembran (steg 5).
4. Analys av IRF3 Dimerisering av Native-PAGE
OBS: Denna metod beskrevs ursprungligen av gruppen av Dr. T. Fujita 27.
- Förbered övre (-) och nedre (+) kammarelektrobuffertar. Den övre kammaren bufferten består av 25 mM Tris-HCI pH 8,4 (RT), 192 mM glycin och 1% natriumdeoxikolat (DOC) i DDH 2 O. Den nedre kammaren buffert innehåller 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) och 192 mM glycin i DDH 2 O.
OBS: De övre och nedre kammarelektroforesbuffertar kan lagras vid 4 ° C fram till användning. Men se till att de förvärmas till RT innan du utför elektrofores. - Häll en icke-denaturer upplösande gel på minst 8,5 cm lång som innehöll 7,5% akrylamid / bis-akrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% ammonium persulfat och 0,1% TEMED i DDH 2 O.
- Pre-run gelen vid 40 mA konstant ström under 30 minuter på is. Tryck driften apparaten i isen ungefär till nivån för den undre kammaren elektroforesbuffert. Det är viktigt att gelén inte är i isen.
- Under förlöpstiden, blanda WCE hölls på is med 2x nativ-PAGE-laddningsbuffert 1: 1 (volym / volym) innehållande 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% glycerol och 0,1% bromfenolblått i DDH 2 O.
- Belastning åtta - tio jig WCE (framställd såsom beskrivs i steg 4,4) omedelbart vid slutet av pre-körningen.
- Kör gelen vid 25 mA konstant ström på is, såsom beskrivits ovan för pre-run, tills migrerings front når botten av gelén (cirka 40 min).
5. Immunoblot analys av IRF3 arter
- Förbered överföringsbuffert innehållande 25 mM Tris-bas och 192 mM glycin i DDH 2 O. Refrigerate överföringsbuffert vid 4 ° C före användning.
- Wet tre bitar av nitrocellulosamembran skärs till en storlek som är något större än geler i en plast / glaslåda som innehåller överföringsbufferten. Indikerar orienteringen av membranet genom att skära ett hörn. Överföringsbufferten kan återanvändas 3 gånger. Förvara buffert vid 4 ° C mellan användningarna.
- Uncast gelerna (SDS-PAGE och nativ-PAGE) och skär ett hörn av varje gel för korrekt orientering.
- För nativ-PAGE, inkubera gelén vid RT under försiktig omrörning under minst 30 min i SDS-PAGE-rinnande buffert för att avlägsna DOC före överföring till överföringsbufferten.
- Inkubera geler (SDS-PAGE och nativ-PAGE) i överföringsbuffert under fem - 10 min.
- Montera en överförings smörgås per gel i en överföringskassett med membranet mot den positiva elektroden (skum pad / filterpapper / membran / gel / filterpapper / skum pad). Var noga med att ta bort alla bubblor i mellan skikten i smörgås.
- Utför överföring som rekommenderade By tillverkaren för överföringsapparaten används.
OBS: Utför alla inkubationer och tvättar i nästa steg på en gungande eller orbital skaka plattform. - Vid slutet av överföringstiden, inkubera membranen i 15 min i fixeringslösning innehållande 7% ättiksyra, 40% etanol och 3% glycerol i DDH 2 O. Tvätta membranen 3x 5 min i PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na 2 HPO 4 och 1,8 mM KH 2 PO 4 i dH 2 O).
Försiktighet! Ättiksyra är giftiga, irriterande och brandfarligt. Skyddshandskar och manipulera under dragskåp.
OBS! Fixeringslösning kan återanvändas flera gånger. - För infödda PAGE membran gå direkt till steg 5.11.
- Skölj tre SDS-PAGE-membran snabbt i dH 2 O innan inkubera dem under en minut i rött ponceau lösning innehållande 6,57 mM röd ponceau och 1% ättiksyra i DDH 2 O.
OBS: Den röda ponceau lösningen kan vara r eused flera gånger. - Skölj membranen i dH 2 O tills bakgrunden är vit nog att se proteinbanden färgade i rött. Notera markörerna med en penna och skär den överskjutande membranet runt proteinerna. Avfärgning membranen genom inkubering under 5 minuter i PBS under omröring.
- Inkubera membran för en timme vid RT eller O / N vid 4 ° C i blockeringslösning (PBS innehållande 0,05% Tween 20 och 5% icke-fet torrmjölk (PBS-T-mjölk). Tvätta membranen 3x 5 min i PBS-T.
OBS: PBS-T tvätt är valfritt och endast absolut nödvändigt vid tillämpningen antikroppar utspädda i PBS-T innehållande 5% bovint serumalbumin (PBS-T-BSA) (figur 1 och tabell 1) i nästa steg. - Inkubera fyra membran (från SDS-PAGE och nativ-PAGE) med de primära antikropparna enligt den sekventiella ordning i detalj i figur 1 och tabell 1. Utför 5x 5 minuterstvättar i PBS-T.
Figur 1. Sekvens av Immunoblot Analyser. Schemat beskriver de enskilda SDS-PAGE och infödda-PAGE-geler som krävs för att upptäcka de olika IRF3 fosforylerade och mono / dimer former. Den specifika ordningen för antikroppar applicerade på membranet till följd av varje gel i immunoblot-förfarandet beskrivs. Observera att anti-aktin antikroppar används först för att säkerställa lika laddning av proverna innan några andra specifika antikroppar. Den alternativa sekvensen, med anti-aktin-antikroppar tillämpas efter anti-fosfo-IRF3 antikroppar, fungerar också. Stripp används mellan anti-aktin och anti-Sev antikroppar eller mellan anti-fosfo-IRF3 och anti-IRF3 antikroppar på grund av överlappande storleken på signalerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Primära antikroppar | Utspädning | Utspädningsbuffert | Inkubation | Sekundära antikroppar | Kommentarer |
| Anti-aktin | 1/10000 | PBS-T-BSA | 15 min vid RT | Anti-mus | Använd efter SDS-PAGE Antibodyies Utspädda kan återanvändas flera gånger om den förvaras vid 4 ° C i närvaro av 0,02% natriumazid. |
| Anti IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N vid 4 ° C | Anti-kanin | Använd efter Native-PAGE. Det rekommenderas inte att återanvända den utspädda antikroppen |
| Anti IRF3-P-Ser396 | 1/10000 | PBS-T-BSA | O / N vid 4 ° C | Använd efter SDS-PAGE. Det rekommenderas inte att återanvända den utspädda antikroppen anti-IRF3-P-396 är också tillgänglig från cellsignalering. Optimala spädn definierades som 1/1000 för denna antikropp, men kan variera mellan satser. | |
| Anti IRF3-P-Ser398 | 1/10000 | PBS-T-BSA | O / N vid 4 ° C | Anti-kanin | Använd efter SDS-PAGE. Det rekommenderas inte att återanvända den utspädda antikroppen |
| Anti IRF3 fullängds | 1/7500 | PBS-T-mjölk | 3 h vid RT | Anti-kanin | Använd efter SDS-PAGE. Anti IRF3 fullängds antikropp kan användas efter nativ-PAGE, men det är mindre känsligt för att detektera monomeren. Antikroppar Utspädda kan återanvändas flera gånger om den förvaras vid 4 ° C i närvaro av 0,02% natriumazid. |
| Anti IRF3-NES | 0,5 ^ g / ml | PBS-T-mjölk | 3 h vid RT | Anti-kanin | Använd efter Native-PAGE. Antibodyies Utspädda kan återanvändas flera gånger om den förvaras vid 4 ° C i närvaro av 0,02% natriumazid. |
| Anti-SeV | 1/14 tusen | PBS-T-BSA | 3 h vid RT | Anti-kanin | Använd efter SDS-PAGE. Antibodyies Utspädda kan återanvändas flera gånger om den förvaras vid 4 ° C i närvaro av 0,02% natriumazid. |
| OBS: Utspädning och buffert används för HRP-kopplade sekundära antikroppar behöver optimeras eftersom det varierar från ett företag till ett annat. | |||||
Tabell 1. Specifikationer för antikroppar som används i Immunoblotting ordningen.
- Inkubera membranen med pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad sekundära antikroppar, enligt beskrivningen i figur 1 och tabell 1. Tvätta membranen 5x 5 minuter i PBS-T följt av 2x 5 min i PBS för att fullständigt avlägsna spår av Tween.
- Inkubera membran för en min i en volym av förstärkt kemiluminescens reagens tillräcklig för att helt täcka membranen. Torka membranen med hjälp av filterpapper.
- Placera membranen i ett luminiscent bildanalysator för att visualisera de immunoreaktiva band.
- Alternativt, utför detektion av immunoreaktiva band med hjälp av känsliga X-Ray filmer.
- Tvätta membranen 3x 5 min i PBS.
OBS: I detta steg membranen kan hållas torr. Om emellertid ytterligare stripp krävs, är det bättre att utföra avdrivningen före torkning av membranet. Membran kan också lagras för kortsiktiga i PBS. - För membran som inte kräver strippa mellan inkubation med antikroppar (se figur 1) gå direkt till steg5,20.
- När stripp krävs mellan antikroppar (se Figur 1), inkubera membranen i förvärmda avdragningslösning innehållande 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) och 0,7% β-merkaptoetanol i DDH 2 O vid 50 ° C 20 min under regelbunden agitation. Tvätta membranen 3x 5 min i PBS.
OBS: Agitation under stripp förfarandet är nyckeln. Strippning kan utföras i en hybridiseringsugn. Alternativt, strippa kan utföras med membran förslutna i plastpåsar och nedsänkta i ett vattenbad. I detta fall är det viktigt att röra om membranen 4 - 5 gånger under inkubationen. - Inkubera membranen under 1 h vid RT eller O / N vid 4 ° C i PBS-T-mjölk.
- Upprepa steg 5,12 till 5,16 enligt figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar en typisk immun bild av IRF3 detekterades med IRF3 totala antikroppar och IRF3-fosfospecifik antikroppar mot Ser396 och Ser398 efter upplösning av WCE med högupplösande SDS-PAGE. I ostimulerade A549-celler, är IRF3 detekteras som två band vid 50 och 53 kDa på SDS-PAGE som motsvarar den icke-fosforylerade (formulär I) och hypofosforylerade (form II) arter av IRF3. Exponering av A549-celler att SEV 3 - 9 h resulterar i en tidsberoende övergången till långsamt migrera hyperfosforylerat former III och IV, som är väl skiljer sig från de former I och II. De hyperfosforylerat band migrerar på 55-57 kDa. Blanketterna III och IV är också särskilt immunodetected hjälp av fosfospecifik antikroppar mot Ser396 och Ser398. Den immunodetektering av aktin fungerar som en kontroll av samma belastning mellan banorna. En kontroll av SeV-infektion visas av ackumuleringen av viruset nukleokapsid protein (N), som migrerar vid 60 kDa.
I fig 3, profilen för detektion av IRF3 erhållen från WCE lösas genom nativ-PAGE följt av immunoblotting med användning av anti-IRF3-NES antikroppar och fosfospecifik antikroppar mot Ser386 visas. I ostimulerade A549-celler, är IRF3 detekteras som ett enda band som motsvarar den monomera formen. Vid infektion med SeV för tre - nio timmar, nivåerna av IRF3 monomer minskar med en åtföljande ackumulering av en långsamt vandrande band som motsvarar den dimera formen av IRF3. De fosfospecifik antikroppar mot Ser386 bara upptäcka IRF3 dimer arter.
Figur 2. Upptäckt av Distinkt IRF3 Fosforylerade Art (formulär I-IV) inducerad av SeV infektion i A549-celler. A549-celler lämnades oinfekterade eller infekterade med SeV för indicated gånger. WCE analyserades genom högupplösande SDS-PAGE följt av immunoblotting (IB) med användning av anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) och anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) fosfospecifik antikroppar och anti -IRF3 fullängdsprotein-antikroppar. Infektionen övervakades med användning av anti-SeV-antikroppar (nukleokapsidproteinet N-proteinet är visad). Anti-aktin antikroppar användas som lastkontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Övervakning av Fosforylerad / dimeriserad IRF3 Induktion av SeV i A549-celler. A549-celler lämnades oinfekterade eller infekterades med SeV för de angivna tiderna. WCE löstes genom nativ-PAGE och avslöjade med immunoblot med användning av anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) fosfospecifik antikroppar och anti-IRF3-NES AntibOdies. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som vi beskriver här består av en kombination av hög upplösning SDS-PAGE och nativ-PAGE kopplad till användningen av flera fosfospecifik antikroppar för att särskilja den monomera / dimera och phosphoforms I-IV i IRF3. Lämplig detektering av dessa IRF3 arter är avgörande för att fullständigt karaktärisera IRF3 aktivering i en specifik inställning. Exempelvis LPS-stimulering av aktiverade makrofager leder till bildning av dimer, Ser396 / 398 fosforylerade IRF3 som uppvisar en hypofosforylerade (form II), men inte hyperfosforylerat (formen III och IV), mönster i SDS-PAGE 15. Användning av den beskrivna protokollet, kan den här profilen skiljas från virusinducerade hyperfosforylerat former som kräver ytterligare Ser339 fosforylering förutom Ser386 och Ser396-fosforylering 10. Viktigt ger detta också diskriminera mellan Ser396 fosforylerade arter som inte uppvisar dimerisering, men är transkriptionellt aktiv 10. Importantly måste det noteras att formen I-IV mönster av IRF3 phosphoforms appliceras på mänsklig IRF3. Murin IRF3 uppvisar inte ett liknande mönster och därför aktivering av IRF3 karakteriseras endast genom användningen av fosfospecifik antikroppar i immunoblot efter SDS-PAGE och genom nativ-PAGE.
Förverkligandet av en hög upplösning separation av de distinkta fosforylerade arter av IRF3 av SDS-PAGE kräver specifika parametrar. För lämplig upplösning, är det mycket viktigt att använda geler som har en minsta längd på 16 cm. Även med denna längd av separations gel, är det nyckeln till att låta migrations front når botten av gelen för att erhålla en lämplig separation av olika IRF3 former. Dessutom måste uppstaplingsgelen omfatta minst 1 cm under kammen att erhålla väldefinierade band. Detta är viktigt, eftersom de hyperfosforylerade former av IRF3 migrera mycket nära varandra. Dåligt fokuserade band kommer att resultera i brist på åtskillnad mellan phosphorylated bildar försämrar deras respektive kvantifiering. Dessutom var koncentrationen av ammoniumpersulfat och TEMED varierar från en SDS-PAGE-protokoll till ett annat. Variation i dessa koncentrationer från de som anges här konstaterades att avsevärt försämra upplösningen i separation av IRF3 arter.
Upptäckt av IRF3 dimerbildning genom infödda PAGE beskrevs ursprungligen av gruppen av Dr. T. Fujita. Detta protokoll använder buffert innehållande DOC som tillåter dissociering av IRF3 dimeren från CBP / p300 27. Det rekommenderas starkt att gå vidare till nativ-PAGE omedelbart efter cellys som lagring av WCE vid -80 ° C befanns leda till en betydande förändring av IRF3 monomer / dimer förhållande. Dessutom är det mycket viktigt att pH för de övre och nedre kammar buffertar justeras till pH 8,4 vid RT, och inte vid 4 ° C, efter blandning alla komponenter för att uppnå korrekt separation av monomeren vs dimeren. En separationgel med en minimilängd på 8,5 cm möjliggör lämplig separation av IRF3 monomer och dimer. Den idealiska volym prov plus buffert är cirka 8 | il för en 5 mm samt upplösningen är bättre när volymen hålls till ett minimum. Således är det viktigt att använda den lägsta volymen av lyseringsbuffert för att erhålla WCE med en hög koncentration. Det bör emellertid beaktas att effektiv extraktion proteinet kräver lys i åtminstone 5 gånger volymen av cellpelleten. Om volymen av proverna överskrider den gräns som anges ovan, skulle detta leda till dålig upplösning av monomeren / dimer. Detta kan lösas genom tillsats av en stapling gel innehållande 4% akrylamid, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 1% ammoniumpersulfat och 0,1% TEMED i DDH 2 O. Det är mycket viktigt att ladda proverna utan att störa banding. Laddar långsamt med en gel-laddning spetsen nära botten av brunnen ger mycket goda resultat.
Här beskriver vi in vivo deteInsatser av fosforylering vid specifika rester med användning av för närvarande tillgängliga fosfospecifik antikroppar mot Ser386 9, Ser396 19 och Ser398 15. Användningen av IRF3 mutanter och masspektrometri analyser har bekräftat att dessa rester fosforyleras vid virusinfektion eller överuttryck av IKKε / TBK1 kinaser och är avgörande för IRF3 aktiverings 6,9,10,19,21. Den immundetektion av fosfo-Ser396, fosfo-Ser398 och total IRF3 efter SDS-PAGE kräver användning av två identiska geler (Figur 1). Faktum är betydande förlust av känslighet observerades när fosfospecifik antikroppar används efter strippning av membranet. Därför är det starkt rekommenderat att använda fosfospecifik antikroppar först. Observera att alternativa primära och sekundära antikroppar också kan fungera, men de specifika späd och sekvens av användning bör optimeras. För IRF3 analys, 30 ng av WCE är lämpligt att få en betydande upptäckt av IRF3fosforylering med immunoblot med användning av de angivna antikropparna när man använder 4 mm bredd brunnar. Även om i många celltyper infekterade med olika virus 30 ug befanns vara lämpligt, kan denna mängd måste ökas beroende på celltyp och stimulering. Det är föredraget att använda färska extrakt för SDS-PAGE, men detekteringen av IRF3 fosforylering med användning av de fosfospecifik antikroppar som beskrivs i detta dokument är tillräckligt stabil för att tillåta en runda av lagring av WCE vid -80 ° C före analys. Koncentrationerna av fosfatasinhibitorer beskrivs här befanns vara tillräcklig när man använder A549-celler. Högre koncentrationer inte visat sig ge bättre resultat. Dock kan dessa koncentrationer behöva ökas när man studerar IRF3 aktivering i celltyper som uppvisar högre fosfatas aktivitetsnivåer. Viktigt är att fosforylering av IRF3 och de bakomliggande mekanismerna är fortfarande långt ifrån att bli förstådd. Därför är en fullständig panel av Ser / Thr- och Tyr-fosfatas ihibitors används för att blockera eventuella ändå okarakteriserade aktiviteter som kan påverka upptäcka IRF3 fosforylering, dimerisering och nedbrytning. För detektion av IRF3 monomer och dimer efter de flesta virusinfektioner och i de flesta celltyper, 8 - var 10 | ig WCE visat sig vara tillräcklig. Dock kan krävas större mängd proteiner för stimulering aktivera IRF3 mindre effektivt. De fosfospecifik antikroppar mot Ser386 används i denna studie rekommenderas att användas i nativ-PAGE som känsligheten i denaturerande SDS-PAGE är mycket svag. Dessutom är fosforylering vid Ser386 föreslagits att korrelera med den dimera formen av IRF3 9, vilket sålunda gör användningen av dessa antikroppar i nativ-PAGE en lämplig strategi för att bekräfta detta koncept i en specifik miljö. Notera alternativa antikroppar är tillgängliga från olika företag och påstås effektivt detektera fosfo-Ser386 efter SDS-PAGE. Fosfospecifik antikroppar mot Ser396 har också varit effektivt used att upptäcka IRF3 fosforylering efter nativ-PAGE 20. Viktigt är Ser402 i den C-terminala kluster av phosphoacceptor ställen befanns också vara viktigt för IRF3 aktivering och fosforylering av Ser402 observerades genom massanalys av IKKε / TBK1-fosforylerad IRF3 10,21,28 spektrometri. Men trots två olika försök (NG, opublicerad), inga fosfospecifik antikroppar är för närvarande tillgängliga för att följa fosforylering av denna specifik rest in vivo. Observera att fosfospecifik antikroppar mot Thr157 och Ser339 har också beskrivits 11,13. Dessa ytterligare fosfospecifik antikroppar skulle kunna användas i ett förfarande med hög upplösning av SDS-PAGE som liknar den som beskrivs här. I detta fall skulle ytterligare stora SDS-PAGE-geler krävas för varje antikropp och bearbetades på samma sätt som gel # 2 (figur 1). Till vår kännedom inga fosfospecifik antikroppar mot Ser173 eller Thr390 ännu har beskrivits,men de kan enkelt läggas till protokollet som beskrivs här när de blir tillgängliga 14,20.
IRF3 aktivitet avslutas av proteasom-medierad nedbrytning av hyperfosforylerat former 11,17. Protokollet som beskrivs här medger även övervakning av IRF3 nedbrytning när den kinetiska av stimulering är förlängd och är kopplat till användningen av proteasom-inhibitorer (MG132, lactacystin eller bortezomid). Vanligtvis i A549-celler infekterades med SeV vid 40 HAU / 10 6 celler, börjar IRF3 fosforylering så snart två timmar efter SeV infektion och IRF3 nedbrytning startar efter 12 timmar. Proteasom-medierad nedbrytning kommer att avslutas från den observerade minskningen av formulär III och IV nivåer vid sena tidpunkter som omvända vid tillstånd med proteasomhämmare. Detta kommer också att översätta på nativ-PAGE i en minskning av IRF3 dimer nivåer som återvinns vid proteasomhämmare behandling 29. Viktigt är den högupplösta tekque presenteras här kan skilja mellan nedbrytningsprocessen och en brist på aktivering. Faktum är att både nedbrytning och avsaknad av aktivering av IRF3 resultat vid frånvaro av detektering av dimer / fosfo-Ser386 / 396. Emellertid är bristen på aktivering är associerad med detekteringen av IRF3 monomer och av formerna I och II, medan dessa IRF3 arter inte detekteras när IRF3 bryts ned 30.
Immunoprecipitation i kombination med masspektrometri baserad analys är en metod för val för att detektera fosforyleringen av IRF3 in vivo vid distinkta ställen. Denna teknik användes för att bekräfta fosforyleringen av IRF3 vid Ser173, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 och Ser402 resterna 10,20,21. Men är masspektrometri ännu en prisvärd / benchside teknik som lätt kan användas för daglig analys av IRF3 aktivering efter flera stimuleringar vid olika tidpunkter. Därför beskrev proceduren här med SDS-PAGE kopplad till infödda PAGE i kombination med immunoblot med användning av totalt och fosfospecifik antikroppar utgör en praktisk, prisvärd och känslig metod för att detektera alla närvarande definierade former av actived IRF3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
- Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
