Protocol
研究倫理の声明 ：本明細書に詳述動物に関わる全ての実験は、動物管理上および実験動物の管理と使用のためのNIHの基準にルールやUNC委員会の規制の対象となっています。
1.準備と解離皮質ニューロンのメッキ
- 頸椎脱臼に続いてCO 2吸入によって時限妊娠雌を安楽死させます。各半球から胎生15.5（E15.5）マウスと顕微解剖皮質の頭蓋骨から全脳を削除してください。マウス胎児皮質の顕微解剖に関する詳細な手順についてはViesselmann ら 8を参照してください。
- 滅菌1.6ミリリットルマイクロチューブに解剖培地1mlには4つ以上の皮質を置きません。 10倍のトリプシンの120μlを添加して、チューブを3反転 - 混合するために5回。
- 血球計数器を用いて、細胞を細胞培養皿に播種するために数えます。注：1皮質半球が提供するAPPRoximately300万細胞。
- SDS耐性SNARE複雑な生化学アッセイのために、35mmディッシュあたり600万細胞をプレーし、条件ごとに2つの皿を利用しています。注：これは、複数の条件を比較する場合、6ウェルプレートを使用することによって簡略化されます。
- 分岐アッセイのために、硝酸のプレートニューロン150,000の密度で軸索分岐プレートのDICイメージングのために、35mmディッシュ当たり250,000細胞の密度で、円形のカバースリップを洗浄しました。これらの密度が過密状態を回避し、分析を簡素化します。
- 生細胞TIRF顕微鏡検査のために、室温でヌクレオ溶液中にトランスフェクションあたり200万ニューロンを再懸濁します。
- メーカープロトコル9に記載のヌクレオとVAMP2-pHlourin発現プラスミドおよびエレクトロポレーションの10μgのを含むマイクロチューブに100μlの細胞懸濁液を追加します。
- トランスフェクションは、すぐにトリプシン焼入れメディアの500μlのを追加した後、書斎でキュベットやプレートの細胞からサスペンションを削除35ミリメートルPDLでコーティングされたガラスボトムディッシュ40万セルのsity。
- プレート無血清培地2ml中のすべての皮質ニューロン。
2. SNARE複合体形成アッセイ
注：SDS耐性SNARE複合体を処理し、元々以下に詳述する変更を加えて10に記載のように分析しました。ここで使用されるものに検証代替抗体について、材料のセクションを参照してください。
- E15.5皮質ニューロンを溶解の前に1時間250 ngの/ mlのネトリン-1または偽制御を用いたin vitro（DIV）で 2日間を刺激します。
- 処理サンプルを、37℃に4℃に冷却し、遠心分離し、設定した水浴温度、100℃に加熱ブロックの前に。
- インキュベーターから細胞皿を削除し、氷上に置きます。
- 吸引細胞からの培地、〜2ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1のためのやさしく2回交換してください - 洗浄あたり2分。
- このアッセイのためには、condにつき2つのウェルを使用ition。
- 条件の最初のウェルから吸引し、PBSおよび250μlの均質化緩衝液と交換してください。氷上で5分間のままにして、[セルリフターを使用して、氷上で細胞を均質化。
- 同じ条件の次のウェルからPBSを吸引し、ウェルに最近均質化し、混合物を追加します。これは、タンパク質濃度を増加させます。すべての条件のために繰り返します。
- 完了時に、ピペットは氷上で予め冷却した1.6 mlのマイクロチューブに溶液を均質化し、1％トリトンX-100の最終濃度に達するように、20％トリトンX-100を加えます。気泡を最小限に抑えながら、1,000μlのピペットで10回混合粉砕します。
- タンパク質を可溶化するために2分間氷上でチューブをインキュベートします。非可溶化物質をペレット化するためのインキュベーション、4℃で6010 RCFで10分間遠心分離に続いて。氷の上に新しいチルド1.6ミリリットルチューブに溶解物上清を移動します。
- Bradfordアッセイ11を使用して、タンパク質濃度分析を行い、FINAにサンプルを希釈します1％トリトンX-100およびB-メルカプトエタノール（BME）を補充した5×試料緩衝液を補充した均質化緩衝液を残りとmlの5ミリグラム/ - 3のLタンパク質濃度。
- 2チューブに均等に各実験サンプルを分割します。 30分（SNAREモノマー）を100℃で1 30分間37℃でサンプル（SNARE複合体）、および他のインキュベート。溶液中でサンプルを維持するために断続的にチューブを反転。
- SDS-PAGEを介して分離する準備ができるまで-20℃でサンプルを凍結します。 100℃で5分間煮沸し、以前のサンプルリボイル、標準的な技術を用いて、電気泳動を介してサンプルを実行する前に、ただし室温で37°Cのサンプルを解凍。
- サンプル（30 - サンプルあたり40μgのタンパク質）の複製を実行し、8％、15％ゲルの両方で。 15％がSNAREタンパク質モノマー（SNAP-25〜25kDa、VAMP2〜18kDa、シンタキシン-1〜35kDa）を定量化するために使用されるのに対し、8％は、複合体の理想的な分離を提供します。染料ラインがSTAC経由になるまで70 Vで電源を維持します王ゲルと90Vに電圧を増加させます。色素がオフに実行されるまでゲルを実行します。
- モノマーを維持するために、45分間70 Vで、20％のメタノール（MeOH）で追加されたとコールド転送バッファを使用して氷の上に0.2μmのニトロセルロース膜にタンパク質を移します。
- 室温でO / N（O / Nが最良の結果を提供します）に2時間覆われた皿の中で乾燥した膜。
- RTで1時間、10％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックSNARE複合膜。
- ロータリーシェーカー上で4℃で1,000プローブO / N：1の希釈で（特定のSNARE複合体の構成要素を認識する）一次抗体を準備します。
- トリス緩衝生理食塩水+ 0.1％のTween-20（TBS-T）で5分間3回ずつでブロットを洗浄します。
- RTで覆われて1時間、のためのTBS-Tとプローブ20,000 1％のBSA：1の希釈で蛍光二次抗体溶液を準備します。 1時間後に繰り返し、ステップ2.12.1。
- 蛍光スキャニングマシン上の画像ブロットは、ソフトウェアスイートを搭載し、SNAREタンパク質の共同の両方を定量化矩形のROIを描画するための製造元の指示を使用して（それぞれ25キロダルトン、18キロダルトン、SNAP-25、VAMP2のための35キロダルトンでの免疫反応性バンドとシンタキシン-1、）mplex（40kDaの上記免疫反応性バンド）とモノマーバンド。
TIRF顕微鏡を介した3イメージングエキソサイトーシスのイベント
注：このプロトコルは、温度、湿度、CO 2を維持するための環境室を含む特殊な顕微鏡装置、落射蛍光照明を装備した倒立TIRF顕微鏡、高倍率/高開口数（NA）TIRF対物、自動化されたXYZステージを必要とし、敏感な電荷結合素子（CCD）検出器。このプロトコルは、100×1.49NA TIRF目的ソリッドステート491 nmのレーザー、電子増倍CCD（EM-CCD）を搭載した完全自動化倒立顕微鏡を使用しています。すべての装置は、撮像及びレーザ制御ソフトウェアにより制御されます。開始前にENVIR上の撮影プロトコルのパワーonmental室、ステージ、ランプ、コンピュータ、およびカメラ。
- イメージングソフトウェア内で目的を選択します。目的が配置されると、襟周り客観ヒーターを固定します。
- その目的は、ステージスロットにステージインキュベーターを固定する前に完全に低下させることを確認します。流出を防ぐために均等にステージインキュベーターインレットに蒸留水を注ぎます。
- インキュベーションシステムの電源をオンにします。 CO 2タンクにバルブを開き、圧力を製造者の指示に従ってシステムに適していることを確認します。チャンバーを5％CO 2、37℃に到達するためにいくつかの時間を許可します。イメージング皿を追加する前に、客観的に水の凝縮を避けるために、インキュベーターで、空の皿を置きます。
- レーザ光源の電源をオンにします。
- オープンステージインキュベーターやレンズにイマージョンオイルを追加します。インキュベーターでサンプルを置き、安定性の腕や皿の重量で安定化させます。油はサンプルの底部に接触するまで目的を上げます。 Switc透過光照明に時間と接眼レンズを介して神経細胞の焦点面を見つけます。
- レーザーソフトウェアを起動し、レーザ制御ソフトウェアに接続します。広視野と目的が使用されているselectする照明を設定します（100×1.49 NA TIRFが推奨されます）。試料の屈折率（〜1.38細胞）を設定します。 491 nmレーザーのための「TTL」をオフにして、レーザ強度を調整します。 40％ - 20の間の値までそれを持ち帰るその後100にスライダーを調整します。 「TTL」を再確認してください。
- 透過光照明で再びサンプルに焦点を当てています。イメージングソフトウェアに移動し、491 nmのレーザー照射とオープンシャッターを選択します。ファイン天井にレーザーの焦点を調整し、除去冷却器を備えた閉じた視野絞りの中心にポイントを中央に配置します。光学ベンチ上で逆さまに凝縮器を置き、ない傷レンズのように。
- コンデンサーを交換し、110 nmのTIRFソフトウェアと設定浸透深さ（PD）にアクセスしてください。 TIRFイルミネーションに広視野照明からの切り替えイメージングのためネーションモード。
- 落射蛍光光源と広視野落射蛍光を使用して、接眼レンズを通して発現細胞VAMP2-phluorinを探します。
- 光退色を低減するために、最小限の露光時間及びレーザ強度を使用して、ノイズ比とダイナミックレンジに信号を最大化するために、撮像パラメータ（露光時間、ゲインおよびレーザパワー）を調整し、光毒性（例：50の間に露出 - 30から15と100ミリ秒、 30％、最大レーザー出力での利得）。
- セル当たりの連続オートフォーカスを設定します。 5分ごとに0.5秒を発生買収で設定タイムラプス画像を取得。ネトリン-1の場合は層流フード内で細胞の皿に500 ngの/ mlのネトリン1を追加し、イメージングの前に1時間インキュベーターに皿を返し、条件を刺激しました。
- 、ImageJので開い画像スタック> [開く]> [ファイル名（ 図をウィンドウにファイルをドラッグするか、ファイルに行くことによって、セル領域および時間当たりに標準化エキソサイトーシス事象の頻度を定量化するために、0; 2A挿入図1）。
- 平均強度：小胞融合事象を表すものではありません安定した蛍光シグナルを削除するには、イメージ>スタック> Z-プロジェクト>投影タイプを使用してスタック全体の平均zの投影を作成します。画像1>これはプロセス>イメージ電卓を使用して、微速度撮影で各画像から画像を意味減算：あなたのスタック操作：画像2新しく作成された平均zの投影を引きます。これは、エキソサイトーシス事象（ - 3図2A挿入図2）を強調しています。
- 目でエキソサイトーシス融合イベントをカウントします。エキソサイトーシスイベントはVAMP2-phluorinが原形質膜（ 図2A挿入図6）内に拡散するように急速に拡散する回折限界の蛍光シグナルの出現として定義されます。
- 全細胞は、しきい値が（ - 8図2A挿入図7）をハイライト表示されるまでスライダーを調整>しきい値>調整>画像を使用して最初の画像を強調表示するしきい値コマンドを使用します。
- アナの下でlyze、SetMeasurementsを選択し、エリアと表示ラベルを確認してください。 （ - 8図2A挿入図7）を測定するために杖トレースツールとプレス'M'を使用して閾値処理の細胞領域を選択します。
- 両方のエキソサイトーシス融合事象カウント転送、スプレッドシートのセルの面積の測定、および経過撮像時間はエキソサイトーシスイベント/ 2 /時間の数（ 図2A挿入図9）を算出します。
4.微分干渉コントラスト（DIC）軸索分岐のタイムラプス顕微鏡
注：DICイメージングへの一般的なアプローチのための完全なプロトコルとデモは12利用可能です。このプロトコルは、DICを利用しながら、他の透過光顕微鏡法は、（例：位相コントラスト）を同じ目的のために使用することができます。
- 2 DIV、多湿のenvを維持するために、予め温めておいた環境室でトランスフェクトしていないニューロンを含む場所のガラスボトムイメージング皿で5％CO 2、37℃でironment。 60Xプラン・アポクロマート、1.4 NA DIC対物レンズと最高の画質と解像度のための高NA凝縮器を備えた顕微鏡を利用しています。
- 透過光照明を用いた接眼レンズを介して神経細胞を見つけるために、焦点面を調整します。
- イメージングソフトウェア上のマルチ領域取得機能を使用して、少なくとも6個の細胞のXYZの場所を見つけて、保存します。最良の結果を得るための視野内の関心のフィットのニューロンようにステージを配置します。
- 「多領域取得を開始」の250ng / mlのネトリン1を押して刺激します。順次、必要に応じて取得し、リフォーカスを一時停止し、24時間、それぞれの位置で20秒ごとに画像を取得します。
- 多次元データ>開いているファイル名を確認します>アプリケーションを使用して、イメージングソフトウェアで画像を確認します。イメージングセッションの間に形成安定した軸索の枝（長さ20μm）を特定します。 stableaxonのbrancを測定するために、ライン描画ツールを使用します先端に軸索の塩基からhが20μmの長の資格を満たしていることを確認します。
- 膜突起が発生期の枝の長さは20ミクロンに達したときに枝が後だけでなく、ネトリン刺激後のフレーム番号を形成する領域で開始すると、スプレッドシートでは、ネトリン刺激後のフレーム番号を記録します。
- 枝あたりの形成時間を計算するために20秒によって突起部と分岐形成との間のフレーム数を掛けます。
5.毒素操作および固定細胞の免疫蛍光
- 2 DIVで、切断するSNAREタンパク質SNAP25、250 ngの/ mlのネトリン-1および/ または10 nMのボツリヌス毒素（BONTA）と実験条件でニューロンを治療し、効果的にSNARE媒介エキソサイトーシス13、プラス250 ngの/ mlのnetrin-を阻害します1。制御条件として、未処理のニューロンの1組にしておきます。
注意：準備と使用しているときBONTAが目や呼吸保護具を使用する必要がありますソリューション。できるだけ早くバイオハザード材料、オートクレーブなど、すべての汚染物質を維持します。 - 3 DIV（24時間後の治療）培地を吸引し、直ちにPHEMの修正（詳細は表1を参照）の少なくとも1ミリリットルと交換し、37℃に温めました。室温で暗所で20分間インキュベートします。
- （4℃でパラフィルムや店舗での将来の使用のシール用）をPBSで3回洗浄します。
- 場所の暗い加湿染色チャンバ内のカバースリップと（10％トリトンX-100ストックから作られる）、PBS中の新たに希釈し、0.2％トリトンX-100で10分間、細胞膜を透過性。
- 透過性溶液を除去し、PBSで1×50μlのですすいでください。で30分間ブロック〜PBS（BSA-PBS）中の10％ウシ血清アルブミンの50μlあるいは10％を室温でPBS中にロバ血清を煮。
- 再び1×PBSですすいでください。 RTで1時間、1％BSA-PBSで：（ニューロンの身元を確認するために千βIIIチューブリン、1）一次抗体50μlの中でカバースリップをインキュベート、 暗闇で。
- PBS中で3×5分の洗浄を行います。チューブリン（1：400）のためのスペクトル的に別個の二次抗体50μlのカバースリップをインキュベートし、蛍光ファロイジン（励起によって異なります：100 1で488ファロイジン：400、647ファロイジン1時）1時間1％BSA-PBSで。
- 1×PBSで洗浄3×5分とメディアのマウントにスライド上にカバースリップをマウントします。
- 明確なマニキュアでカバーガラスとシールの縁からメディアをマウント真空過剰。
- 40X 1.4NAの対物レンズ、落射蛍光機能とEM-CCDと倒立顕微鏡に広視野落射蛍光画像を収集します。
- 手動でのImageJを使用して分岐分析します。ウィンドウにファイルをドラッグするか、> [開く]> [ファイル名（ 図4A挿入図1）をファイルに行くことによってImageJので開く画像スタック。
- ライン>セグメント化ラインを使用すると、ソーマ（ - 3、図4Aの挿入図2）から延びる最も長い神経突起のように定義された軸索を、トレースします。
- 分析>ツール> ROI Managerを使用して、関心領域としてトレース軸索を保存します。長さの神経突起≥20μmのように定義された各軸索の枝を、トレースして保存します。分析（ - 4図4Aの挿入図3）中の（直接軸索から発芽増殖物）のみの一次枝が含まれます。
- 押して「m」は、目的の保存された領域を測定し、マイクロメートルの長さを計算するためにスプレッドシートに画素の長さを転送します。
- 100μmの長さ当たりの軸索分岐の数を取得するために、100で割ったμm単位の軸索の長さで、長さが≥20μmの軸索分岐の数を割ります。
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Representative Results
神経細胞の集団におけるSDS耐性SNARE複合体の量を測定するためにインビトロ生化学的手法に活用。 図1は、SNAP-25、syntaxin1AとVAMP2についてプローブSDS耐性SNARE複合体アッセイの完了後、得られたウエスタンブロットを示しています。
基底細胞膜にTIRF顕微鏡法は、単一のセル内の個々のエキソサイトーシス融合事象の高解像度の画像を提供する。 図2Aは、VAMP2-phluorin媒介エキソサイトーシスイベントを識別するための画像解析手法を示します。小胞の融合が起こるように挿入図は、単一のエキソサイトーシスイベントを示し、VAMP2-phluorinは、原形質膜中に拡散するように。 図2Bは、皮質ニューロンの時間（秒）に発生したエキソサイトーシスイベントの例を示しています。ズームインセットはソーマ、軸索の枝とspatiを示す軸索成長円錐を表しますこのアッセイのアル・ユーティリティ。円はTIRF顕微鏡を介して見ることができ、単一のエキソサイトーシス融合事象を、示しています。
ネトリンのタイムラプスDICイメージングは、軸索分岐が軸索分枝形成のタイミングを明らかに刺激した。 図3は、ネトリン刺激後にリアルタイムで軸索の枝の形成を示します。白矢じりは、ブランチサイトからの最初の突起を示しています。黒矢じりは、分岐先端にメイン軸索から少なくとも20μmの測定の完全に形成され、安定したブランチを示します。軸索分岐におけるネトリン依存性の増加は、エキソサイトーシス融合におけるネトリン依存性の増加を以下に発生します。
SNARE活性の薬理学的阻害と組み合わせた固定細胞の免疫細胞化学は、SNARE媒介エキソサイトーシスが分岐皮質軸索のために必須であることを示している。 図4（a）、perfo分岐追跡のステップのプロセスによってステップを概説 ImageJのでrmed。 図4Bは、3DIVで皮質ニューロンの代表的な画像を示しています。条件は、以下の通りである：未処理、250 ngの/ mlのネトリンで刺激し、またはBONTAおよび24時間250 ngの/ mlのネトリンで処理しました。
in vitroでの 定量化メトリックSNAREの形成としてSNARE複合体のSDS抵抗を使用して図1。SNARE複雑なメンバーVAMP2、Syntaxin1AおよびSNAP-25および負荷制御BIIIチューブリンをプローブ代表ウエスタンブロット。複雑かつ識別可能な単量体の両方のSNAREタンパク質が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PG "/>
図2.ライブセルイメージングとエキソサイトーシス小胞の融合画像解析のステップ概要による皮質神経細胞におけるエキソサイトーシス小胞の融合イベントの定量。（A）ステップそれは手動のImageJを用いて行ったよう。それは時間をかけて起こるような（B）挿入図のパネルが単一VAMP2-pHlourin小胞の融合イベントを示しています。 2DIVでVAMP2-pHlourinを発現する全皮質ニューロンのTIRF顕微鏡画像をフィーチャーした第二パネル。ソーマ、軸索の枝、および軸索成長円錐：以下に示すように、点線のボックスは、関心領域を表します。関心領域の円は、単一小胞の融合事象を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.長期生細胞DICイメージングは、ネトリン刺激に応答して軸索の枝の形成を示す皮質ニューロンのネトリン1依存軸索分岐。DIC生細胞画像のタイミングを明らかに。白矢印が前に長さ20μmに達する神経突起に初期突起のポイントを示しています。黒矢印が真正枝（長さ≥20μm）を表します。時間と表記時間：分は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
エキソサイトーシスの毒素阻害と相まって図4.固定細胞の免疫蛍光は、エキソサイトーシスは、ネトリン1依存軸索分岐のために必要であることを示している。ネトリンに分岐軸索の定量化のための追跡および分析手順の（A）概要3DIVで皮質ニューロンを刺激しました。 （B）各実験条件の3DIVで皮質ニューロンの代表的な画像：未処理、250 ngの/ mlのネトリン、または10 nMのBONTA毒素を加えた250 ngの/ mlのネトリンで処理して刺激しました。グリーンは、F-アクチン（ファロイジン）である赤がβIIItubulinです。矢印は軸索の枝のポイント、長さ≥20ミクロンを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 溶液 | レシピ |
| 均質化緩衝液 | 10mMのHEPES-NaOHでpHが7.4,150 mMのNaClを、1mMのEGTA。細胞の種類に依存してプラスに必要なプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 |
| 2Xサンプルバッファー | 60mMのトリス-HCl pHは6.75、5％（v / v）のFIメルカプトエタノール、2％（w / v）のSDS、10％（w / v）のグリセロール0.007％（重量/v）のブロモフェノールブルー |
| PHEM固定液 | 60mM PIPES pHは7.0、25mMのHEPES pH7.0の、10mMのEGTAのpHは8.0、2のMgCl 2、0.12 Mスクロース、4％PFA |
| マウントメディア | 20mMトリスpH8.0の、0.5％n-プロピルガレート、90％高品質グリセリン、ミリQ H 2 O |
| ランニングバッファー10X SDS | トリス塩基の30.0グラム、グリシンの144.0グラム、およびH 2 Oの千ミリリットル、pHが8.3でSDSの10.0グラムを溶解します。 1倍に希釈します。 |
| 10X転送バッファ | 250 mMのための30.3グラムのトリスと1 LH 2 O中1.92 Mソリューションの144.1グラムのグリシンを溶解させます。 （1 Lのためのバッファー（1x）は、200ミリリットルのメタノールと700ミリリットルの冷DI H 2 Oに100ミリリットル10倍のソリューションを追加） |
| 無血清培地（SFM） | 50ミリリットル：0.5ミリリットルL-グルタミン、1ミリリットルのB27、48.5ミリリットルたNeurobasalメディア |
| トリプシン消光メディア（TQM） | 50ミリリットル：0.5ミリリットルL-グルタミン、2.5ミリリットルのFBS、47ミリリットルNeurobASALメディア |
| TRIS緩衝生理食塩水 | 50mMのトリス-Cl、pHが7.5、1 LH 2 O中の150mMのNaCl; （TBS-Tの場合は1ミリリットルのTween-20を追加） |
表1.ソリューション
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Acknowledgments
RO1-GM108970（SLG）とF31-NS087837（CW）：この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
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