Protocol
Uttalande av forskningsetik: Alla försök med djur som beskrivs häri omfattas av de regler och föreskrifter i UNC kommittén för djurs Care och NIH standarder för vård och användning av försöksdjur.
1. Beredning och plätering av dissocierade kortikal nervceller
- Avliva tidsinställda-dräktiga honor av CO 2 inandning följt av halsdislokation. Ta bort hela hjärnor från skallarna av embryonala dag 15,5 (E15.5) möss och microdissect cortex från varje halvklotet. För detaljerade instruktioner om Microdissection embryonala mus cortex se Viesselmann et al 8.
- Placera inte mer än 4 cortex i 1 ml dissekera media i en steril 1,6 ml mikrorör. Lägg 120 pl 10x trypsin och invertera röret 3 - 5 gånger för att blanda.
- Med användning av en hemocytometer, räkna celler till utsäde cellodlingsskålar. Obs: 1 kortikala hemisfären ger ca.oximately tre miljoner celler.
- För SDS-resistenta SNARE komplex biokemi analys plattan sex miljoner celler per 35 mm skål och använda två rätter per tillstånd. Obs: Detta är förenklas genom att använda 6 brunnsplattor vid en jämförelse flera villkor.
- Förgrening analyser, platt neuroner på salpetersyra tvättas cirkulära täck vid en densitet av 250.000 celler per 35 mm skål för DIC avbildning av Axon förgreningsplatta vid en densitet av 150.000. Dessa densiteter undvika överbeläggning och förenkla analysen.
- För levande celler TIRF mikroskopi, resuspendera två miljoner neuroner per transfektion i nucleofection lösning vid RT.
- Tillsätt 100 pl av cellsuspensionen till mikrorör innehållande 10 ^ g av VAMP2-pHlourin expressionsplasmid och elektroporera med en Nucleofector enligt tillverkarens protokoll 9.
- Efter transfektioner omedelbart tillsätt 500 pl trypsin släcka media, ta bort avstängning från kyvetten och platt celler vid en hålamångfalden av 400.000 celler per 35 mm PDL-belagt glas nedre skålen.
- Plattan alla kortikala neuroner i 2 ml serumfritt medium.
2. SNARE Complex Formation analys
Obs: SDS-resistenta SNARE-komplex bearbetades och analyserades som ursprungligen beskrevs 10 med de ändringar som anges nedan. För validerade alternativa antikroppar mot de som används här, se avsnittet material.
- Stimulera E15.5 kortikala neuroner 2 dagar in vitro (DIV) med 250 ng / ml netrin-1 eller simulerad kontroll för en timme före lys.
- Före bearbetning av prov, kyler centrifug till 4 ° C, och ställa vattenbadtemperatur till 37 ° C, och värmeblock till 100 ° C.
- Ta bort cell rätter från inkubatorn och placera på is.
- Aspirera media från celler, ersätt med ~ 2 ml iskall Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) försiktigt 2 gånger för 1-2 min per tvätt.
- För denna analys, använda 2 brunnar per dirition.
- Aspirera PBS från den första brunnen av ett tillstånd och ersätt med 250 pl homogeniseringsbuffert. Låt på is under 5 min, och sedan använda en cell lyftaren, homogenisera cellerna på is.
- Aspirera PBS från nästa brunn i samma skick och lägga den nyligen homogeniserad blandning till brunnen. Detta kommer att öka proteinkoncentrationerna. Upprepa för alla förhållanden.
- Efter avslutad, pipett homogeniserades lösningen till en i förväg kyld 1,6 ml mikrorör på is och tillsätt 20% TritonX-100 för att nå en slutlig koncentration av 1% TritonX-100. Finfördela blanda 10 gånger med 1000 l pipett och samtidigt minimera bubblor.
- Inkubera rören på is under 2 min för att solubilisera proteiner. Efter inkubation centrifugera i 10 min vid 6010 RCF vid 4 ° C för att pelletera icke-solubiliserade materialet. Flytta lysat supernatanten i ny kyld 1,6 ml rör på is.
- Utför koncentrationsanalyser protein med hjälp av Bradford-analys 11 och späd proverna till ett final proteinkoncentration av 3-5 mg / ml med kvarvarande homogeniseringsbuffert kompletterad med 1% TritonX-100 och 5x provbuffert som kompletterats med B-Mercaptethanol (BME).
- Dela varje experimentellt prov jämnt i 2 rör. Inkubera ett prov vid 37 ° C under 30 min (SNARE-komplex), och den andra vid 100 ° C under 30 min (SNARE monomerer). Vänd rören intermittent för att hålla prover i lösning.
- Frysa proverna vid -20 ° C tills den ska separera via SDS-PAGE. Före kör proven via elektrofores med användning av standardtekniker, återkokning tidigare kokt prov under 5 min vid 100 ° C, men tina 37 ° C prover vid RT.
- Kör dubbletter av proverna (30 - 40 mikrogram protein per prov) på både en 8% och 15% gel; den 8% ger utmärkt separation av komplexet, under det att 15% används för att kvantifiera SNARE protein monomerer (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18kDa, syntaxin-1 ~ 35kd). Behåll strömkällan vid 70 V tills färgen linjen är genom STACking gel och ökning spänningen till 90V. Kör geler tills färgen rinner av.
- Att bevara monomerer, överföra proteiner till 0,2 | am nitrocellulosamembran på is med användning av kall överföringsbuffert med 20% metanol (MeOH) tillsattes, vid 70 V under 45 min.
- Torrt membran i en täckt skål under 2 h till O / N vid RT (O / N ger de bästa resultaten).
- Block SNARE komplexa membran i 10% bovint serumalbumin (BSA) under 1 h vid RT.
- Förbereda primära antikroppar (som känner igen specifika SNARE komplexa komponenter) vid en utspädning av 1: 1000 och sond O / N vid 4 ° C på en roterande skakanordning.
- Skölj blottarna i Tris-buffrad saltlösning plus 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 gånger under 5 min vardera.
- Förbered fluorescerande sekundära antikroppslösningar vid en utspädning av 1: 20.000 i 1% BSA i TBS-T och prob för en timme, täckt vid RT. Upprepa steg 2.12.1 efter 1 tim.
- Bild blöts på en fluorescerande scanning maskin utrustad med programpaket och kvantifiera både SNARE protein complex (immunoreaktiva band över 40 kDa) och monomer band (immunoreaktiva band vid 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa för SNAP-25, VAMP2 och syntaxin-1 respektive) med hjälp av tillverkarens instruktioner för att rita rektangulära ROI.
3. Imaging exocytisk händelser via TIRF Mikroskopi
Obs: Detta protokoll kräver special mikroskopi utrustning inklusive en miljökammare för att upprätthålla temperatur, luftfuktighet och CO 2, en inverterad TIRF mikroskop utrustat med en epifluorescent belysning, en hög förstoring / hög numerisk apertur (NA) TIRF mål, en automatiserad XYZ skede och en känslig Charge Coupled Device (CCD) detektor. Detta protokoll använder en helautomatisk inverterat mikroskop utrustat med en 100x 1.49NA TIRF målet en solid state 491 nm laser och en elektron Multiplying CCD (EM-CCD). All utrustning styrs av avbildning och laserstyrprogram. Före början avbildningsprotokoll strömmen på invonmental kammare, scen, lampa, dator och kamera.
- Välj mål inom bildprogram. När målet är på plats, fäst den objektiva värmaren runt kragen.
- Bekräftar att målet sänks helt innan säkra scenen inkubatorn i scenen platsen. Häll destillerat vatten i scenen inkubatorn inlopp jämnt för att förhindra spill.
- Slå på inkubationen systemet. Öppna ventilen till den CO 2 tanken och bekräfta trycket är lämpligt för systemet enligt tillverkarens instruktioner. Tillåta kammaren lite tid att nå 5% CO2 och 37 ° C. Före tillsats av avbildnings skålen, placera en tom skålen i inkubatorn för att undvika vattenkondens på målet.
- Slå på laserkällan.
- Öppen scen inkubator och lägga immersionsolja till linsen. Placera provet i kuvös och stabilisera med stabilitets armar eller en maträtt vikt. Höja målet tills oljan kommer i kontakt med botten av provet. Switch till transmitterat ljus belysning och hitta neuronal fokalplanet genom okularen.
- Starta laser programvara och ansluta till laserstyrprogram. Set belysning att widefield och välj mål som används (100X 1,49 NA TIRF rekommenderas). Ställ brytningsindex av provet (celler ~ 1,38). Justera laserintensiteten genom att avmarkera "TTL" för 491 nm laser. Justera reglaget till 100 sedan föra den tillbaka ner till ett värde mellan 20-40%. Kontrollera igen "TTL".
- Fokus på prov igen i genomlysning belysning. Gå till bildprogram och välj 491 nm laserbelysning och öppen slutare. Finjustera fokus för lasern på taket och centrera punkten till mitten av den slutna membranområdet med kondensorn bort. Placera kondensorn upp och ned på den optiska bänken, så att inte repa linsen.
- Byt kondensorn och gå till TIRF programvara och ställa penetrationsdjup (PD) till 110 nm. Växla från widefield belysningen till TIRF Illumnering läge för avbildning.
- Hitta VAMP2-phluorin uttryckande celler genom okularen använder widefield epifluorescence med epifluorescent ljuskälla.
- Justera avbildningsparametrar (exponeringstid, förstärkning och lasereffekt) för att maximera signal-brusförhållande och dynamiskt omfång med hjälp av den minimala exponeringstiden och laser intensitet för att minska fotoblekning och fototoxicitet (t.ex. exponering mellan 50-100 ms, med en 15-30 vinna på 30% maximal lasereffekt).
- Ställ kontinuerlig autofokus per cell. Skaffa en Timelapse bilden med förvärv inträffar varje 0,5 sekund under 5 minuter. För netrin-1 stimulerade tillstånd, tillsätt 500 ng / ml netrin-1 till skål med celler i en huv med laminärt flöde och tillbaka skålen till inkubatorn under 1 timme före avbildning.
- För att kvantifiera frekvensen av exocytiska händelser normaliserades per cell området och tid, öppna bildstaplar i ImageJ genom att dra filen till fönstret eller gå till Arkiv> Öppna> Filename (Figur0; 2A Inset 1).
- För att ta bort en stabil fluorescerande signaler som inte representerar vesikelfusion händelser, skapa en genomsnittlig z projektion av hela stapeln med Image> Stack> Z-Project> Projektions typ: medelintensitet. Subtrahera detta medelvärde bild från varje bild i timelapse med hjälp av Process> Bildräknare> Bild1: din stack Operation: Subtrahera Image2 nyskapade genomsnittliga z projektion. Detta understryker exocytiska händelser (Figur 2A Infällda 2-3).
- Räkna exocytiska fusion händelser genom ögat. Exocytiska händelser definieras som uppkomsten av en diffraktionsbegränsad fluorescenssignal, som snabbt diffunderar som VAMP2-phluorin diffunderar inuti plasmamembranet (figur 2A Inset 6).
- Använd kommandot Threshold för att markera den första bilden med Image> Adjust> Tröskel> justera reglaget tills hela cellen är tröskeln markerad (Figur 2A Inset 7-8).
- enligt AnaLyze väljer SetMeasurements och kontrollera området och visningsetiketten. Välj tröskel cellulära området med hjälp staven spårning verktyget och tryck på "m" för att mäta (figur 2A Inset 7-8).
- Överföra både exocytiska fusions händelser räkna, mätningar cellområdet och förfluten imaging tid till ett kalkylblad beräkna antal exocytisk händelser / mm2 / tid (Figur 2A Inset 9).
4. Differential Interference Contrast (DIC) Timelapse mikroskopi av Axon Branching
Obs: En komplett protokoll och demonstration för en allmän riktlinje för DIC imaging finns 12. Även om detta protokoll använder DIC, kan andra transmitterat ljus mikroskopi metoder användas för samma ändamål (till exempel: faskontrast).
- Vid två DIV, att placera glasbotten imaging skål innehållande otransfekterade neuroner i förvärmda klimatkammare upprätthålla en fuktig ENVironment med 5% CO2 och 37 ° C. Använda ett mikroskop utrustat med en 60X Plan-Apochromat, 1,4 NA DIC objektiv och hög NA kondensor för bästa bildkvalitet och upplösning.
- Justera fokalplanet att hitta nervceller genom okularen genomfallande ljus belysning.
- Använda multi området förvärvsfunktion bildbehandlingsprogram, hitta och rädda XYZ platser på minst 6 celler. Placera scenen så att nervceller av intresse passning inom synfältet för bästa resultat.
- Stimulera med 250 ng / ml netrin-1 och tryck på "start multi område förvärv". Sekventiellt förvärva bilder vid varje position var 20 sekund under 24 timmar, pausa förvärv och fokusering som behövs.
- Granska bilderna i bildbehandlingsprogram som använder Apps> granska Multi Dimensional Data> öppna filnamn. Identifiera stabila axon grenar (20 um lång) som bildas under avbildning session. Använd linjen ritverktyget för att mäta en stableaxon Branch från basen vid axonet till spetsen för att säkerställa 20 um längd examen uppfylls.
- I ett kalkylblad, registrera ramnumret efter netrin stimulering när membran utsprång inleda i områden där grenar senare bildar liksom ramnumret efter netrin stimulering när begynnande grenar når 20 um i längd.
- Multiplicera antalet bildrutor mellan utsprånget och grenbildning med 20 sekunder för att beräkna bildandet tiden per gren.
5. toxin manipulationer och Fast Cell Immunofluoresence
- Vid 2 DIV, behandla neuroner i experimentella förhållanden med 250 ng / ml netrin-1 och / eller 10 nM botulinum A-toxin (Bonta), som klyver SNARE protein SNAP25 och effektivt inhiberar SNARE medierad exocytos 13, plus 250 ng / ml netrin- 1. Lämna en uppsättning av obehandlade neuroner som kontrollgrupp.
VARNING: Bonta kräver användning av ögon- och andningsskydd när framställning och användninglösningar. Behåll alla förorenade material som biologiskt riskmaterial och autoklav så snart som möjligt. - Vid 3 DIV (24 timmar efter behandling) Aspirera media, och omedelbart ersätta med åtminstone 1 ml PHEM fix (se tabell 1 för detaljer) värms till 37 ° C. Inkubera i 20 minuter i mörker vid RT.
- Skölj 3x med PBS (för framtida bruk tätning med parafilm och förvara vid 4 ° C).
- Place täckglas i mörker, befuktad färgningskammaren och permeabilisera cellmembranen under 10 minuter i färskt utspätt 0,2% TritonX-100 i PBS (framställd av 10% TritonX-100 stock).
- Ta permeabilization lösning och skölj med 50 pl 1 x med PBS. Block för 30 min i ~ 50 | il 10% bovint serumalbumin i PBS (BSA-PBS), eller 10% Kokt Donkey Serum i PBS vid RT.
- Skölj med 1x PBS igen. Inkubera täckglas i 50 | il primär antikropp (1: 1000 βIII tubulin, för att bekräfta neuronal identitet) i 1% BSA-PBS under 1 h vid RT, i mörkret.
- Utför 3x 5 min tvättar i PBS. Inkubera täck i 50 pl spektralt distinkt sekundär antikropp för tubulin (1: 400), och fluorescerande falloidin (varierar beroende på excitation: 488 phalloidin på 1: 400, 647 phalloidin på 1: 100) i 1% BSA-PBS under en timme .
- Tvätta 3x 5 min i 1x PBS och montera täck på diabilder i monterings media.
- Vakuum överskott montering media från kanterna på täckglas och tätning med genomskinligt nagellack.
- Samla Widefield epifluorescence bilder på ett inverterat mikroskop med en 40X 1.4NA mål, epifluorescent kapacitet och EM-CCD.
- analysera manuellt förgrening med ImageJ. Öppna bildstaplar i ImageJ genom att dra filen till fönstret eller gå till Arkiv> Öppna> Filename (Figur 4A infälld 1).
- Använda linje> segmenterad linje, spåra axonet, definieras som den längsta neurite som sträcker sig från soma (figur 4A infälld 2-3).
- Använda Analysera> Verktyg> ROI Manager spara axonet spårning som ett område av intresse. Spåra och spara varje Axon gren, definieras som en neurite ≥20 pm i längd. Inkludera endast primära grenar (utväxter direkt groning från axonet) i analysen (figur 4A infälld 3-4).
- Tryck på 'm' för att mäta de sparade områden av intresse, och överföra längder i pixlar till ett kalkylblad för att beräkna längden i pm.
- Dividera antalet axon grenar ≥20 pm i längd, av längden på axonet i ^ m dividerat med 100 för att få antalet axon grenar per 100 | im längd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utnyttja in vitro biokemiska tekniker för att analysera mängden av SDS-resistenta SNARE-komplex i en population av nervceller. Figur 1 visar det resulterande western blöt efter fullföljande av den SDS-resistenta SNARE-komplex analys sonde för SNAP-25, syntaxin1A och VAMP2.
TIRF mikroskopi vid basalcellmembranet ger högupplösta bilder av enskilda exocytiska fusions händelser i enskilda celler. Figur 2A visar bildanalysmetodik för att identifiera VAMP2-phluorin medie exocytiska händelser. Den infällda bilden visar en enda exocytisk händelsen som vesikelfusion inträffar och som VAMP2-phluorin diffunderar inom plasmamembranet. Figur 2B visar ett exempel på en exocytisk händelse inträffar över tiden (sekunder) i en kortikala neuron. Zoomade inlägg beteckna soma, en axon gren och en axonal tillväxt konen visar spatial användbarheten av denna analys. Cirklar betecknar enstaka exocytisk fusion händelser, som kan ses via TIRF mikroskopi.
Timelapse DIC avbildning av netrin stimulerade Axon förgrening visar tidpunkten för Axon gren bildning. Figur 3 visar bildandet av en axon filial i realtid efter netrin stimulering. Vita pilspetsar beteckna den första utskjutande från en gren webbplats. Svarta pilar anger en helt bildas, stabil gren av åtminstone 20 um mätning från huvud axon till grenspetsen. Netrin osjälvständiga ökningar i axonet förgrening inträffar efter netrin osjälvständiga ökningar i exocytisk fusion.
Fast cell immunocytokemi i kombination med farmakologisk hämning av SNARE aktivitet visar att SNARE medierad exocytos är en förutsättning för kortikal axon förgrening. Figur 4A, beskriver en stegvis process gren tracings PERFO rmed i ImageJ. Figur 4B visar representativa bilder av kortikala neuroner på 3DIV. Betingelserna är följande: obehandlade, stimulerades med 250 ng / ml netrin, eller behandlas med Bonta och 250 ng / ml netrin under 24 h.
Figur 1. Med SDS Resistans SNARE komplex som en kvantifierbar Metric av SNARE bildning in vitro. Ett representativt western blöt sonde för SNARE komplexa medlemmar VAMP2, Syntaxin1A och SNAP-25 och lastkontroll BIII tubulin. Båda snare proteiner i komplexa och identifierbara monomerer visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
pg "/>
Figur 2. Levande cell imaging och kvantifiering av exocytisk vesikelfusion händelser i kortikal nervceller. (A) Steg för steg beskrivning av exocytiska vesikelfusion bildanalys som det manuellt utförs med hjälp av ImageJ. (B) Infällda paneler visar en enda VAMP2-pHlourin vesikelfusion händelsen som det sker över tiden. Den andra panelen med en TIRF mikroskopi bild av en hel kortikala neuron uttrycker VAMP2-pHlourin på 2DIV. Streckad linje rutor betecknar områden av intresse som visas nedan: soma, axon gren och en axonal tillväxt kon. Cirklar med regionerna av intresse betecknar enstaka vesikelfusion händelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Långsiktig levande celler DIC Imaging avslöjar Tidpunkt för netrin-1 beroende Axon förgrening. DIC levande cell bilder av en kortikala neuron visar bildandet av axon grenar som svar på netrin stimulering. Vita pilspetsar betecknar punkter första utsprång före neurite nå 20 um i längd. Svarta pilspetsar betecknar Bonafide grenar (längd ≥20 pm). Tid betecknas timme. Min Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Fast Cell Immunofluorescens Tillsammans med toxin Hämning av Exocytos Visar att Exocytos krävs för netrin-1 Beroende Axon förgrening. (A) Sammanfattning av spårning och analyssteg för kvantifiering av axon förgrening i en netrin stimulerade kortikala neuron på 3DIV. (B) Representativa bilder av kortikala neuroner vid 3DIV av varje experimentell tillstånd: obehandlade, stimulerades med 250 ng / ml netrin, eller behandlades med 10 nM Bonta toxin plus 250 ng / ml netrin. Grönt är F-aktin (falloidin), är röd βIIItubulin. Pilar betecknar punkter axon grenar ≥20 pm i längd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | Recept |
| homogeniseringsbuffert | 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4,150 mM NaCl, 1 mM EGTA. Plus nödvändiga proteas- och fosfatasinhibitorer beroende av celltyp |
| 2x provbuffert | 60 mM Tris-HCl, pH 6,75, 5% (volym / volym) fI-merkaptoetanol, 2% (vikt / volym) SDS, 10% (vikt / volym) glycerol, 0,007% (vikt /v) bromfenolblått |
| PHEM fixativ | 60 mM PIPES pH 7,0, 25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM EGTA, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 0,12 M sackaros, 4% PFA |
| monterings Media | 20 mM TRIS pH 8,0, 0,5% N-propyl-gallat, 90% högkvalitativ glycerol, MilliQ H2O |
| 10X SDS löpbufferten | Lös upp 30,0 g Tris-bas, 144,0 g glycin och 10,0 g av SDS i 1000 ml H2O, pH 8,3. Späd till 1x. |
| 10X överföringsbuffert | Lös 30,3 g Tris för 250 mM och 144,1 g glycin för 1,92 M lösning i ett LH 2 O; (1 L 1x buffert lägga 100ml 10x lösning till 200 ml MeOH och 700 ml kall DI H2O) |
| Serum Free Media (SFM) | 50 ml: 0,5 ml L-glutamin, 1 ml B27, 48,5 ml Neurobasal media |
| Trypsin Kyla Media (TQM) | 50 ml: 0,5 ml L-glutamin, 2,5 ml FBS, 47 ml NeurobAsal Media |
| Tris-buffrad saltlösning | 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl i en LH 2 O; (För TBS-T tillsätt 1 ml Tween-20) |
Tabell 1. Lösningar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health: RO1-GM108970 (SLG) och F31-NS087837 (CW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
- Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
- Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
- Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).
