Protocol
Declaração de ética em pesquisa: Todos os experimentos envolvendo animais aqui detalhados estão sujeitos às regras e regulamentos da Comissão UNC on Animal Care e normas do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Preparação e chapeamento de Dissociated neurônios corticais
- Eutanásia fêmeas cronometrados-grávida de inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical. Remover cérebros inteiros dos crânios dos embrionárias dias 15,5 (E15.5) ratos e microdissect córtices de cada hemisfério. Para obter instruções detalhadas sobre o microdissection do córtex embrionário do rato consulte Viesselmann et al 8.
- Coloque há mais de 4 córtices em 1 ml de meio de dissecação em um estéril 1,6 ml microtubo. Adicionar 120 ul de tripsina 10x e inverter o tubo 3 - 5 vezes para misturar.
- Usando um hemocitómetro, contagem de células para semear placas de cultura de células. Nota: 1 hemisfério cortical fornece aproxoximately três milhões de células.
- Para o ensaio de bioquímica complexo SNARE resistentes-SDS, placa de seis milhões de células por placa de 35 mm e utilizar dois pratos por condição. Nota: Este é simplificada usando placas de 6 poços ao comparar várias condições.
- Para os ensaios de ramificação, neurónios placa em ácido nítrico lavada lamelas circulares numa densidade de 250.000 células por prato de 35 mm, para DIC imagiologia de axónio ramificação em placas a uma densidade de 150.000. Estas densidades evitar a superlotação e simplificar a análise.
- Para a microscopia TIRF de células vivas, ressuspender dois milhões de neurônios por transfecção em nucleofection solução à temperatura ambiente.
- Adicionar 100 ul de suspensão de células para microtubo contendo 10 ug de VAMP2-pHlourin plasmídeo de expressão e electroporar com um Nucleofector de acordo com o protocolo do fabricante 9.
- Após transfections imediatamente adicionar 500 mL de mídia tripsina extinguir, anular a suspensão de células em cuvete e placa em um densidade de 400.000 células por 35 milímetros de vidro PDL revestido prato fundo.
- Placa de todos os neurónios corticais em 2 ml de meio isento de soro.
2. ensaio de formação de complexo SNARE
Nota: complexos SNARE resistentes-SDS foram processados e analisados como descrito originalmente 10, com as modificações a seguir indicados. Para anticorpos alternativos validados para os usados aqui, consulte a secção de materiais.
- Estimular neurônios corticais E15.5 2 dias in vitro (DIV) com 250 ml de controle ng / netrin-1 ou placebo para 1 hora antes da lise.
- Antes de processamento de amostras, centrífuga fresco a 4 ° C, e ajustar a temperatura do banho de água a 37 ° C, e o bloco de aquecimento a 100 ° C.
- Remover pratos de células de incubadora e colocar no gelo.
- Aspirar meios de células, substitua com -2 mL de gelo frio de fosfato salina tamponada (PBS) suavemente 2 vezes durante 1-2 minutos por lavagem.
- Para este ensaio, utilizar 2 poços por condsição.
- Aspirar PBS a partir do primeiro poço de uma condição e substituir com 250 ul de tampão de homogeneização. Deixar em gelo durante 5 min, e, em seguida, utilizando um tirante de células, homogeneizar as células em gelo.
- Aspirar o PBS do poço seguinte da mesma condição e adicionar a mistura homogeneizada recentemente para o poço. Isto irá aumentar a concentração de proteína. Repita o procedimento para todas as condições.
- Após a conclusão, pipeta solução para um pré-arrefecida de 1,6 ml microtubo homogeneizado em gelo e adiciona-se 20% Triton X-100 para se atingir uma concentração final de 1% Triton X-100. Triturar misturar 10 vezes com 1000 mL pipeta, minimizando bolhas.
- Incubar os tubos em gelo durante 2 min para solubilizar as proteínas. Após a incubação, centrifuga-se durante 10 min a 6010 RCF a 4 ° C para sedimentar o material não solubilizado. Mover sobrenadante do lisado para um novo tubo de 1.6 ml arrefecida em gelo.
- Realizar a análise de concentração de proteína utilizando o ensaio Bradford 11 e diluir as amostras a uma finaL concentração de proteína de 3-5 mg / mL com o restante tampão de homogeneização suplementado com 1% de Triton X-100 e de 5x tampão de amostra suplementado com B-Mercaptethanol (BME).
- Divida cada amostra experimental uniformemente em 2 tubos. Incubar uma amostra a 37 ° C durante 30 min (complexos SNARE), e o outro a 100 ° C durante 30 min (monómeros SNARE). Inverta tubos intermitentemente para manter as amostras em solução.
- Congele as amostras à temperatura de -20 ° C até estar pronto para separar por meio de SDS-PAGE. Antes da execução de amostras por meio de electroforese, utilizando técnicas convencionais, referver anteriormente amostras fervidas durante 5 min a 100 ° C, mas descongelar 37 ° C As amostras à TA.
- duplicatas corrida de amostras (30 - 40 mg de proteína por amostra) em ambos a 8% e um gel de 15%; a 8% proporciona separação ideal do complexo, enquanto que a 15% é utilizada para quantificar os monómeros de proteína SNARE (~ 25 kDa de SNAP-25, VAMP2 ~ 18kDa, sintaxina-1 ~ 35 kDa). Manter a fonte de alimentação de 70 V até que a linha de corante é através da Stacrei gel e aumento da tensão de 90V. Executar géis até que o corante foge.
- Para preservar monómeros, transferir as proteínas para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 um em gelo utilizando tampão de transferência de frio com 20% de metanol (MeOH) adicionado, a 70 V durante 45 min.
- membrana seco em um prato coberto para 2 horas de O / N à temperatura ambiente (O / N fornece os melhores resultados).
- Bloco SNARE membranas complexas em 10% Albumina de Soro Bovino (BSA) durante 1 h à TA.
- Preparar anticorpos primários (reconhecendo componentes específicos complexo SNARE) a uma diluição de 1: 1000 e sonda de O / N a 4 ° C num agitador rotativo.
- Lavar blots em solução salina tamponada TRIS mais 0,1% de Tween-20 (TBS-T) 3 vezes durante 5 minutos cada.
- Preparar soluções de anticorpos secundários fluorescentes a uma diluição de 1: 20000 em 1% de BSA em TBS-T e a sonda durante 1 h, à RT coberto. 2.12.1 Passo Repita depois de 1 hora.
- borrões de imagem em uma máquina de digitalização fluorescente equipado com conjunto de software e quantificar tanto a co proteína SNAREmplex (bandas imunorreactivas acima de 40 kDa) e as bandas imunorreactivas monómero (bandas a 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa para SNAP-25, VAMP2 e sintaxina-1, respectivamente), utilizando as instruções do fabricante para o desenho ROIs rectangular.
3. Imagem exocíticas Eventos via microscopia TIRF
Nota: Este protocolo requer equipamento microscopia especializada, incluindo uma câmara de ambiente para manter a temperatura, humidade e de CO2, um microscópio TIRF invertido equipado com uma iluminação de epifluorescência, um / elevada abertura numérica (NA) objectivo TIRF alta ampliação, uma fase automatizado XYZ, e uma sensível Charge Coupled Device (CCD) detector. Este protocolo utiliza um microscópio invertido totalmente automatizado equipado com uma objectiva de um sólido estado de laser 491 nm 100x 1.49NA TIRF e um Electrão Multiplicando CCD (CCD-EM). Todo o equipamento é controlado pelo software de imagem e controle laser. Antes do início do protocolo de alimentação de imagem no ambionmental câmara, palco, lâmpada, computador e câmera.
- Escolha um objetivo dentro de software de imagem. Uma vez que o objetivo está no lugar, aperte o aquecedor objetivo em volta da gola.
- Confirmar que o objectivo é baixado completamente antes de fixar a incubadora estágio no slot palco. Despeje água destilada para as entradas de estágio incubadora uniformemente para evitar derramamento.
- Ligue o sistema de incubação. Abrir a válvula ao tanque de CO 2 e confirmar a pressão é apropriado para o sistema de acordo com as instruções do fabricante. Permitir câmara de algum tempo para atingir os 5% de CO 2 e 37 ° C. Antes de adicionar o prato de imagem, colocar um recipiente vazio na incubadora para evitar a condensação de água no objectivo.
- Ligar a fonte de laser.
- Abrir incubadora palco e adicionar óleo de imersão para a lente. Coloque amostra na incubadora e estabilizar com os braços de estabilidade ou um peso prato. Elevar o objectivo, até o óleo entra em contacto com a parte inferior da amostra. switch com iluminação de luz transmitida e encontrar plano focal neuronal através das oculares.
- Inicie o software de laser e se conectar ao software de controle de laser. iluminação para widefield e selecione o objetivo a ser utilizado set (100X 1,49 NA TIRF é recomendado). Conjunto de índices de refracção da amostra (células de ~ 1,38). Ajustar a intensidade do laser, desmarcando "TTL" para o laser 491 nm. Ajuste o controle deslizante para 100, em seguida, trazê-lo de volta para baixo para um valor entre 20 - 40%. Verifique novamente "TTL".
- Concentre-se em amostra novamente em iluminação de luz transmitida. Ir para o software de imagem e selecione iluminação do laser 491 nm e obturador aberto. Um ajuste fino do ponto focal do laser no teto e centrar o ponto até ao centro do diafragma campo fechado com o condensador removido. Coloque condensador de cabeça para baixo no banco óptico, de modo a não lente zero.
- Substitua condensador e ir para o software TIRF e definir profundidade de penetração (PD) a 110 nm. Mudar de iluminação widefield para illum TIRFmodo de inação para a imagem latente.
- Encontrar VAMP2-phluorin células que expressam através das oculares usando epifluorescência widefield com fonte de luz de epifluorescência.
- Ajustar os parâmetros de imagem (tempo de exposição, o ganho e de potência de laser) para maximizar a razão sinal-ruído e gama dinâmica usando o tempo de exposição mínimo e intensidade do laser para reduzir a fotodegradação e fototoxicidade (por exemplo: exposição entre 50 - 100 ms, com uma 15 - 30 ganhar a 30% de potência máxima laser).
- Definir o foco automático contínuo por célula. Adquirir uma imagem timelapse conjunto com aquisição ocorrendo a cada 0.5 s por 5 min. Para a condição estimulada netrina-1, adicionar 500 ng netrina-1 / ml a placa de células numa câmara de fluxo laminar e devolver o prato para a incubadora durante 1 h antes da imagiologia.
- Para quantificar a frequência de eventos exocíticas normalizados por área celular e tempo, pilhas de imagens abertas em ImageJ arrastando o arquivo para a janela ou ir em File> Open> File (Figura0; 2A Inserção 1).
- Para remover sinais fluorescentes estáveis que não representam eventos de fusão de vesícula, criar uma projeção média z de toda a pilha usando Imagem> Pilha> Z-Project> tipo de projeção: Intensidade Média. Subtrair esta imagem média de cada imagem na timelapse usando o Process> Calculadora Imagem> Image1: sua operação de pilha: Subtrair Image2 recém-criado projeção média z. Isto enfatiza eventos exocíticos (Figura 2A Inset 2-3).
- Contagem de eventos de fusão exocíticas por olho. Eventos exocitico são definidas como o surgimento de um sinal de fluorescência limitado por difração, que se difunde rapidamente quanto VAMP2-phluorin difunde no interior da membrana plasmática (Figura 2A Inserção 6).
- Use o comando Limiar para realçar a primeira imagem usando Image> Adjust> Threshold> ajuste deslizante até que toda a célula é limiar de destaque (Figura 2A Inset 7-8).
- sob AnaLyze, escolha SetMeasurements e área e rótulo de exibição verificar. Seleccione a área celular thresholded usando a ferramenta varinha traçado e pressione 'm' para medir (Figura 2A Inset 7-8).
- Transferência ambos os eventos de fusão exocíticas contar, as medições de área celular e o tempo decorrido de imagem para uma planilha para calcular o número de exocítico eventos / mm 2 / hora (Figura 2A Inset 9).
4. interferência diferencial Contrast (DIC) Timelapse Microscopia de Axon Ramificação
Nota: Um protocolo completa e de demonstração para uma abordagem geral à imagem DIC está disponível 12. Embora este protocolo utiliza DIC, podem ser utilizados outros métodos de microscopia de luz transmitida para os mesmos fins (por exemplo: contraste de fase).
- Às 2 DIV, prato de imagem inferior lugar de vidro contendo neurônios untransfected na pré-aquecido câmara ambiental para manter um env úmidoironment com 5% de CO 2 e 37 ° C. Utilizar um microscópio equipado com um 60X Plan-Apochromat, 1,4 NA DIC lente objetiva e de alta condensador NA para a melhor qualidade de imagem e resolução.
- Ajuste o plano focal para encontrar neurônios através das oculares utilizando iluminação de luz transmitida.
- Usando a função de multi aquisição da área de software de imagem, encontrar e salvar os locais XYZ de pelo menos 6 células. Posicione o palco para que os neurônios de ajuste interesse dentro do campo de visão para melhores resultados.
- Estimular com 250 ng / ml netrin-1 e pressione 'start vários aquisição área'. adquirir sequencialmente imagens em cada posição a cada 20 segundos, durante 24 horas, parando aquisição e reorientação, se necessário.
- Rever imagens no software de imagem usando Aplicativos> Comente Dimensional de Dados> nome do arquivo aberto multi. Identificar ramificações de axónios estáveis (20 mm de comprimento) que se formam durante a sessão de imagens. Use a ferramenta da linha de empate para medir um branc stableaxonh partir da base no axónio até a ponta para assegurar a qualificação comprimento de 20 um é satisfeita.
- Em uma planilha, gravar o número do quadro após a estimulação netrin quando saliências membrana iniciar em áreas onde ramos mais tarde formam, bem como o número do quadro após a estimulação netrin quando ramos nascentes chegar a 20 mm de comprimento.
- Multiplique o número de quadros entre protrusão e formação de ramo por 20 segundos para calcular o tempo de formação por agência.
5. Manipulações Toxinas e imunofluorescência celular fixo
- No DIV 2, tratar os neurónios em condições experimentais com 250 ng / ml a netrina-1 e / ou 10 nM de toxina botulínica A (BoNT), que cliva a proteína SNARE SNAP25 e inibe eficazmente a SNARE exocitose mediada 13, mais 250 ng / mL netrin- 1. Deixar um conjunto de neurónios não tratados como condição de controle.
CUIDADO: BoNTA requer a utilização de protecção ocular e protecção respiratória quando a preparação e utilizaçãosoluções. Manter todos os materiais contaminados como material de risco biológico e autoclave o mais rapidamente possível. - No DIV 3 (24 horas após o tratamento) meios aspirado, e substituir imediatamente com, pelo menos, 1 ml de solução PHEM (ver Tabela 1 para detalhes) aquecido a 37 ° C. Incubar durante 20 min no escuro à temperatura ambiente.
- Lavar 3x com PBS (para o futuro selo uso com parafilme e armazenar a 4 ° C).
- lamelas em lugar escuro, coloração câmara humidificada e permeabilizar as membranas das células durante 10 minutos em recentemente diluído 0,2% Triton X-100 em PBS (feito a partir de 10% da TritonX-100).
- Remoção da solução de permeabilização e lavar com 50 ul de 1x com PBS. Bloco durante 30 min em ~ 50 mL de 10% de albumina de soro bovino em PBS (BSA-PBS) ou 10% de Soro asno fervido em PBS à temperatura ambiente.
- Enxágüe com 1x PBS novamente. Incubar lamelas em 50 ul de anticorpo primário (1: 1000 βIII tubulina, para confirmar a identidade neuronal) em 1% de BSA-PBS, durante 1 h à TA, no escuro.
- Realizar 3x lavagens de 5 min em PBS. Incubar lamelas em 50 ul de anticorpo secundário espectralmente distinto para tubulina (1: 400), e faloidina fluorescente (varia de acordo com excitação: 488 faloidina a 1: 400, 647 faloidina a 1: 100) em 1% de BSA-PBS, durante 1 hora .
- Lavar 3x 5 minutos em 1x PBS e montar lamelas em lâminas em meios de montagem.
- Vacuum o excesso de meio de montagem a partir das bordas da lamela e vedação com unhas polonês claro.
- Coletar imagens de epifluorescência widefield em um microscópio invertido com uma objetiva de 40X 1.4NA, capacidades de epifluorescência e EM-CCD.
- analisar manualmente ramificação usando ImageJ. Pilhas de imagens abertas em ImageJ por arrastar o arquivo para a janela ou ir em File> Open> File (Figura 4A inserção 1).
- Usando linha> A linha segmentada, traçar o axónio, definida como a neurite mais longa se estende a partir do soma (Figura 4A inserir 2-3).
- Usando Analisar> Ferramentas> ROI Manager, salvar o axônio de rastreamento como uma região de interesse. Rastrear e salvar cada ramo do axônio, definida como uma neurite ≥20 mm de comprimento. Incluem ramos primários única (excrescências brotando directamente a partir do axónio) na análise (Figura 4A inserir 3-4).
- Prima 'm' para medir as regiões salvas de interesse, e transferir comprimentos de pixels para uma planilha para calcular o comprimento em mm.
- Dividir o número de ramificações de axónios ≥20 ^ m em comprimento, por o comprimento do axónio em uM dividido por 100 para obter o número de ramificações de axónios por 100 uM de comprimento.
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Representative Results
Utilizando técnicas bioquímicas in vitro para ensaiar a quantidade de complexos SNARE-resistentes SDS em uma população de neurónios. A Figura 1 mostra a western blot resultante, após a conclusão do ensaio de complexo SNARE resistente SDS sondadas para SNAP-25, e syntaxin1A VAMP2.
Microscopia TIRF na membrana celular basal fornece imagens de alta resolução de eventos de fusão exocíticos individuais em células individuais. A Figura 2A demonstra a metodologia de análise de imagem para identificação de VAMP2-phluorin exocíticos eventos mediados. A inserção mostra um único evento exocitico como ocorre a fusão das vesículas e, como VAMP2-phluorin difunde no interior da membrana plasmática. A Figura 2B mostra um exemplo de um evento exocitico que ocorre ao longo do tempo (segundos) num neurónio cortical. inserções ampliadas denotar a soma, um ramo do axônio e um cone de crescimento axonal mostrando os spatiai utilidade deste ensaio. Círculos denotam eventos de fusão exocítico individuais, que podem ser vistos através de microscopia TIRF.
Timelapse DIC imagiologia de netrina estimulada axónio ramificação revela o tempo de formação de axónio ramo. A Figura 3 mostra a formação de um ramo de axónio em tempo real, no seguimento da estimulação netrina. setas brancas indicam a saliência inicial a partir de um site da filial. setas pretas indicam um totalmente formado, ramo estável de pelo menos 20 um medindo entre o axônio principal para a ponta do ramo. aumentos dependentes Netrin em ramificação axonal ocorre após aumentos dependentes netrina em fusão exocítico.
Imunocitoquímica de células fixa combinada com a inibição farmacológica da atividade SNARE mostra que SNARE mediada exocitose é um requisito para o axônio cortical ramificação. Figura 4A, esboça um processo passo a passo dos traçados filial perfo rmou no ImageJ. Figura 4B mostra imagens representativas de neurônios corticais em 3DIV. As condições são como se segue: sem tratamento, estimuladas com 250 ng netrina / ml, ou tratadas com BoNT e 250 ng netrina / ml durante 24 horas.
Figura 1. Usando a Resistência SDS de SNARE Complexos como uma formação Quantificável métricas de SNARE In Vitro. Um western blot representante sondado para SNARE membros complexos VAMP2, Syntaxin1A e SNAP-25 ea BIII tubulina controle de carregamento. Ambos SNARE proteínas em monômeros complexos e identificáveis são apresentados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. Imagens ao vivo celular e quantificação de exocíticas Vesícula Fusão Eventos em neurônios corticais. (A) Passo a descrição passo da análise de imagem fusão das vesículas exocítico como foi realizada manualmente usando ImageJ. Painéis (B) Inset mostram um único evento de fusão das vesículas VAMP2-pHlourin, uma vez que ocorre ao longo do tempo. O segundo painel que caracteriza uma imagem de microscopia TIRF de um neurônio cortical toda expressando VAMP2-pHlourin em 2DIV. caixas de linha pontilhada denotam as regiões de interesse, como mostrado abaixo: soma, ramo do axônio, e um cone de crescimento axonal. Círculos com as regiões de interesse denotam eventos de fusão das vesículas individuais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Long Term DI de células vivasC Imagiologia revela Tempo de Netrin 1-imagens ao vivo de células dependentes Axon Ramificação. DIC de um neurônio cortical mostrando a formação de ramificações de axónios em resposta à estimulação netrin. setas brancas indicam pontos de protrusão inicial antes da neurite atingir 20 jim de comprimento. setas pretas indicam ramos genuínos (comprimento ≥20 mm). Tempo denotado como hora: Min. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Corrigido Imunofluorescência celular Juntamente com inibição Toxina de Exocytosis Mostra que Exocytosis é necessária para Netrin-1 Dependente Axon Ramificação. (A) descrição das etapas de rastreamento e análise para quantificação de axônio ramificação em um netrin estimulado neurônio cortical em 3DIV. (B) Imagens representativas de neurónios corticais em 3DIV de cada condição experimental: sem tratamento, estimuladas com 250 ng / mL netrina, ou tratadas com 10 nM de BoNT toxina mais 250 ng netrina / ml. Verde é F-actina (phalloidin), o vermelho é βIIItubulin. Setas indicam pontos de ramificações de axónios ≥20 mm de comprimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Receita |
| tampão de homogeneização | mM de HEPES-NaOH 10 mM de pH NaCl 7.4,150, EGTA 1 mM. Além de inibidores de protease e fosfatase necessárias depende do tipo de célula |
| tampão de amostra 2x | 60 mM Tris-HCl pH 6,75, 5% (v / v) de fi-mercaptoetanol, 2% (w / v) de SDS, 10% (w / v) de glicerol, 0,007% (W /v) de azul de bromofenol |
| PHEM fixador | PIPES 60 mM pH 7,0, 25 mM de HEPES pH 7,0, 10 mM de EGTA, pH 8,0, 2 mM de MgCl2, 0,12 M de sacarose, 4% PFA |
| meios de montagem | Tris 20 mM, pH 8,0, 0,5% de N-propil-galato, 90% de glicerol alta qualidade, H2O MilliQ |
| 10X SDS tampão de corrida | Dissolve-se 30,0 g de base Tris, 144,0 g de glicina, e 10,0 g de SDS em 1000 ml de H 2 O, pH 8,3. Diluir até 1x. |
| 10X tampão de transferência | Dissolve-se 30,3 g de Tris para 250 mM e 144,1 g Glicina para solução 1,92 M em 1 LH 2 O; (para 1 L de tampão 1x adicionar 100 ml de solução 10x a 200 mL de MeOH e 700 ml de DI fria H2O) |
| Soro de mídia gratuito (SFM) | 50 ml: 0,5 ml de L-glutamina, 1 ml B27, 48,5 ml de meio Neurobasal |
| Tripsina Têmpera de mídia (TQM) | 50 ml: 0,5 ml de L-glutamina, 2,5 ml de FBS, 47 ml Neurobasal mídia |
| Solução salina tamponada TRIS | 50 mM de Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM de NaCl em 1 LH 2 O; (Para TBS-T adicionar 1 ml de Tween-20) |
Tabela 1. Solutions
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde: SR1-GM108970 (SLG) e F31-NS087837 (CW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
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