Protocol
Opgørelse af forskningsetik: Alle forsøg med dyr beskrevet heri, er underlagt de regler og forskrifter i UNC Komité for Dyrs Pleje og til NIH standarder for pasning og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Forberedelse og Plating af Dissocierede kortikale neuroner
- Afliv timede-gravide kvinder med CO 2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation. Fjern hele hjerner fra kranierne på embryonale dag 15,5 (E15.5) mus og microdissect cortex fra hver halvkugle. For detaljerede instruktioner om mikrodissektion af embryonale mus cortex se Viesselmann et al 8.
- Placer ikke mere end 4 cortex i 1 ml dissekere medier i en steril 1,6 ml mikrorør. Tilføj 120 ul 10x trypsin og vend røret 3 - 5 gange for at blande.
- Anvendelse af et hæmocytometer, tælle celler til frø celle dyrkningsskåle. Bemærk: 1 kortikale halvkugle giver ca.oximately tre millioner celler.
- For SDS-resistente SNARE komplekse biokemi assay, plade seks millioner celler pr 35 mm skål og udnytte to retter pr tilstand. Bemærk: Dette er forenklet ved at anvende plader med 6 brønde ved sammenligning flere betingelser.
- Til forgrening assays, plade neuroner på salpetersyre vasket cirkulære dækglas med en tæthed på 250.000 celler pr 35 mm skål, for DIC-billeddannelse af axon forgrening plade med en tæthed på 150.000. Disse tætheder undgår overbelægning og forenkle analysen.
- For levende celle TIRF mikroskopi, resuspender to millioner neuroner pr transfektion i nucleofection opløsning ved stuetemperatur.
- Tilsæt 100 pi cellesuspension til mikrorør indeholdende 10 ug VAMP2-pHlourin ekspressionsplasmid og elektroporere med en nucleofector henhold til producentens protokol 9.
- Efter transfektioner straks tilføje 500 pi trypsin afkølende medier, ophæve suspension fra kuvetten og plade celler ved en hulefoldighed på 400.000 celler pr 35 mm PDL-belagt glas bund fad.
- Plade alle kortikale neuroner i 2 ml serumfrit medium.
2. SNARE Complex Dannelse Assay
Bemærk: SDS-resistente SNARE komplekser blev behandlet og analyseret som oprindeligt beskrevet 10 med de ændringer, der er beskrevet nedenfor. For validerede alternative antistoffer mod dem, der anvendes her, se afsnittet materialer.
- Stimulere E15.5 corticale neuroner 2 dage in vitro (DIV) med 250 ng / ml netrin-1 eller fingeret kontrol i 1 time inden lyse.
- Forud for behandling prøver, køligt centrifuge til 4 ° C, og indstille vandbadstemperatur til 37 ° C, og varmeblok til 100 ° C.
- Fjern celle retter fra inkubatoren og placere på is.
- Aspirer medier fra celler, erstatte med ~ 2 ml iskold Fosfat saltopløsning (PBS) forsigtigt 2 gange for 1 - 2 min per vask.
- Til denne analyse, bruge 2 brønde pr condition.
- Aspirer PBS fra den første brønd i en tilstand og erstatte med 250 pi homogenisering buffer. Efterlad på is i 5 minutter, og derefter under anvendelse af en celle palleløfter, homogenisere celler på is.
- Aspirer PBS fra den næste brønd i samme stand og tilføje den nyligt homogeniseret blanding til brønden. Dette vil øge proteinkoncentrationer. Gentag for alle forhold.
- Ved afslutning, pipette homogeniseret opløsning til en forafkølet 1,6 ml mikrorør på is, og der tilsættes 20% TritonX-100 for at nå en slutkoncentration på 1% Triton X-100. Dette findeles blande 10 gange med 1.000 pi pipette og samtidig minimere bobler.
- Inkuber rørene på is i 2 minutter for at solubilisere proteiner. Efter inkubering centrifugeres i 10 minutter ved 6.010 rcf ved 4 ° C for at pelletere ikke-solubiliseret materiale. Flyt lysatsupernatant i ny kølet 1,6 ml rør på is.
- Udfør proteinkoncentration analyse ved hjælp Bradford assay 11 og fortyndes prøver til en final proteinkoncentration på 3 - 5 mg / ml med resterende homogeniseringsbuffer suppleret med 1% Triton X-100 og 5x prøvepuffer suppleret med B-Mercaptethanol (BME).
- Opdele hver forsøgsgruppe prøve jævnt i 2 rør. Inkuber én prøve ved 37 ° C i 30 minutter (SNARE komplekser), og den anden ved 100 ° C i 30 min (SNARE monomerer). Invert rør intermitterende at opbevare prøver i opløsning.
- Frys prøver ved -20 ° C indtil den er klar til at separere via SDS-PAGE. Inden der køres prøver via elektroforese ved anvendelse af standardteknikker, genkogning tidligere kogt prøver i 5 minutter ved 100 ° C, men tø 37 ° C prøverne ved stuetemperatur.
- Kør dubletter af prøver (30 - 40 ug protein per prøve) på både en 8% og en 15% gel; 8% giver ideelle adskillelse af komplekset, hvorimod der anvendes 15% at kvantificere SNARE protein monomerer (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18 kDa, syntaxin-1 ~ 35 KDa). Oprethold strømkilde ved 70 V indtil farvestoffet linje er gennem stacking gel og forøge spændingen til 90V. Kør geler indtil farvestoffet løber væk.
- For at bevare monomerer, overføre proteiner til 0,2 um nitrocellulosemembran på is under anvendelse af kold transfer buffer med 20% methanol (MeOH) tilsat, ved 70 V i 45 minutter.
- Dry membran i en overdækket skål i 2 timer til O / N ved stuetemperatur (O / N giver de bedste resultater).
- Block SNARE komplekse membraner i 10% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time ved stuetemperatur.
- Forbered primære antistoffer (der genkender specifikke SNARE komplekse komponenter) i en fortynding på 1: 1.000 og probe O / N ved 4 ° C på en rotationsryster.
- Skyl blots i Tris saltvand plus 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 gange i 5 min hver.
- Forbered fluorescerende sekundært antistof opløsninger ved en fortynding på 1: 20.000 i 1% BSA i TBS-T og probe i 1 time, dækket ved stuetemperatur. Gentag trin 2.12.1 efter 1 time.
- Billede klatter på en fluorescerende scanning maskine udstyret med software suite og kvantificere både SNARE protein complex (immunoreaktive bånd over 40 kDa) og monomere bånd (immunoreaktive bånd på 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa for SNAP-25, VAMP2 og syntaxin-1, henholdsvis) ved hjælp af producentens anvisninger for udarbejdelse rektangulære ROI'er.
3. Imaging exocytiske Begivenheder via TIRF Microscopy
Bemærk: Denne protokol kræver specialiseret mikroskopi udstyr, herunder et miljøkammer for at opretholde temperatur, luftfugtighed og CO2, et omvendt TIRF mikroskop udstyret med et epifluorescerende belysning, en stor forstørrelse / høj numerisk apertur (NA) TIRF mål, en automatiseret XYZ fase, og en følsom Charge Coupled Device (CCD) detektor. Denne protokol anvender et fuldautomatisk omvendt mikroskop udstyret med en 100x 1.49NA TIRF mål en solid state 491 nm laser og en Electron Multiplicere CCD (EM-CCD). Alt udstyr styres af billedbehandling og laser kontrol software. Forud for starten af imaging-protokollen tænde envirmæssig kammer, scene, lampe, computer og kamera.
- Vælg mål inden imaging software. Når målet er på plads, fastgør det mål varmelegeme omkring kraven.
- Bekræft, at målet sænkes helt, før fastgørelse af scenen kuvøse i den fase slot. Hæld destilleret vand i fase inkubator fjorde jævnt for at forhindre spild.
- Tænd inkubationen systemet. Åbn ventilen til CO 2 tank og bekræft trykket er passende for systemets producentens instruktioner. Tillad kammer lidt tid til at nå 5% CO2 og 37 ° C. Før tilsætning imaging fad placeres et tomt fad i inkubatoren for at undgå dannelse af kondensvand på målsætningen.
- Tænd laseren kilde.
- Åben scene inkubator og tilsæt fordybelse olie på objektivet. Anbring prøven i kuvøse og stabilisere med stabilitet arme eller et fad vægt. Hæv mål indtil olien kommer i kontakt med bunden af prøven. switch til transmitteret lys belysning og finde neuronal fokalplan gennem okularerne.
- Start laser software og oprette forbindelse til laser kontrol software. Indstil belysning til vidvinklede og vælg det mål, der anvendes (100X 1.49 NA TIRF anbefales). Sæt brydningsindeks af prøven (celler ~ 1,38). Juster laser intensitet ved at fjerne markeringen "TTL" til 491 nm laser. Juster skyderen til 100 derefter bringe det tilbage ned til en værdi på mellem 20 - 40%. Kontrollér "TTL".
- Fokus på prøve igen i transmitteret lys belysning. Gå til billedbehandling software og vælg 491 nm laser belysning og åben lukker. Fin justere fokuspunktet af laseren på loftet og centrere punkt til midten af den lukkede membran felt med kondensatoren fjernes. Placer kondensatoren op og ned på den optiske bænk, for ikke at ridse linsen.
- Udskift kondensatoren og gå til TIRF software og sæt indtrængningsdybde (PD) til 110 nm. Skift fra vidvinklede belysning til TIRF Illumgennemgang mode for billeddannelse.
- Find VAMP2-phluorin celler, der udtrykker gennem okularerne hjælp Vidvinklet epifluorescens med epifluorescerende lyskilde.
- Juster imaging parametre (eksponeringstid, forstærkning og laser power) for at maksimere signal-støj-forholdet og dynamikområde under anvendelse af minimale eksponeringstid og laser intensitet for at reducere fotoblegning og fototoksicitet (for eksempel: eksponering mellem 50 - 100mSek, med en 15 - 30 vinde på 30% maksimal lasereffekt).
- Set kontinuerlig autofokus per celle. Anskaf en timelapse billede sæt med overtagelsen sker hver 0,5 sek i 5 min. For netrin-1 stimuleret tilstand, tilsættes 500 ng / ml netrin-1 til fad af celler i en laminar flow hætte og returnere fadet til inkubatoren i 1 time før billeddannelse.
- For at kvantificere hyppigheden af exocytiske begivenheder normaliseret per celle område og tid, åbne billedfiler stakke i ImageJ ved at trække filen i vinduet eller gå til Filer> Åbn> Filnavn (figur0; 2A Indsat 1).
- For at fjerne stabile fluorescerende signaler, der ikke repræsenterer vesikel fusion begivenheder, oprette en gennemsnitlig z projektion af hele stakken hjælp Image> Stak> Z-Projekt> Projection type: Average Intensitet. Træk denne gennemsnitlige billede fra hvert billede i timelapse hjælp Process> Billede Lommeregner> Image1: din stak Operation: Træk Image2 nyoprettede gennemsnitlige z projektion. Dette understreger exocytiske begivenheder (figur 2A Indsatser 2 - 3 i).
- Count exocytiske fusion begivenheder ved øjet. Exocytiske begivenheder er defineret som forekomsten af en diffraktionsbegrænset fluorescenssignal, som hurtigt diffunderer som VAMP2-phluorin diffunderer inden plasmamembranen (figur 2A Indsat 6).
- Brug Threshold kommandoen for at fremhæve det første billede ved hjælp Image> Adjust> Threshold> justere skyderen indtil hele cellen er tærskel fremhævet (figur 2A Indsat 7 - 8).
- Under Analyze vælge SetMeasurements og kontrollere området og display etiket. Vælg den tærskel-cellulære område ved hjælp af staven sporing værktøj og tryk på 'm' for at måle (figur 2A Indsat 7 - 8).
- Overføre både de exocytiske fusion begivenheder tæller, at celleområdet målinger, og den forløbne imaging tid til et regneark beregne antal exocytisk hændelser / mm 2 / tid (figur 2A Indsat 9).
4. Differential Interferens Contrast (DIC) Timelapse Mikroskopi af Axon Forgrening
Bemærk: En komplet protokol og demonstration for en generel tilgang til DIC billeddannelse er tilgængelig 12. Mens denne protokol anvender DIC, kan andre transmitteret lys mikroskopi metoder anvendes til de samme formål (for eksempel: fasekontrast).
- Ved 2 DIV, at sted glasbund imaging skål indeholdende utransficerede neuroner i forvarmet klimakammer opretholde et fugtigt environment med 5% CO2 og 37 ° C. Udnyt et mikroskop udstyret med en 60X Plan-Apochromat, 1,4 NA DIC objektiv og høj NA kondensator for bedste billedkvalitet og opløsning.
- Juster brændplanet at finde neuroner gennem okularerne hjælp transmitteret lys belysning.
- Brug af multi erhvervelse området funktionen på imaging software, finde og gemme XYZ placeringer af mindst 6 celler. Placer tidspunkt, således at neuroner af interesse fit inden for synsfeltet for de bedste resultater.
- Stimuler med 250 ng / ml netrin-1 og tryk på 'begynde erhvervelse multi område «. Sekventielt erhverve billeder på hver position hver 20 sek i 24 timer, pause erhvervelse og refokusering som nødvendigt.
- Gennemgå billeder i imaging software ved hjælp af apps> Gennemgå Multi Dimensional Data> åben filnavn. Identificere stabile Axon grene (20 um lange), der dannes under den billeddannende session. Brug den linje lodtrækningen værktøj til at måle en stableaxon branch fra basen på axon til spidsen for at sikre 20 pm længde kvalifikation er opfyldt.
- I et regneark, registrerer rammen nummer efter netrin stimulation når membran fremspring indleder i områder, hvor grene senere danner samt rammen nummer efter netrin stimulation når spirende grene nå 20 pm i længden.
- Gange antallet af rammer mellem fremspring og gren dannelse ved 20 sek til at beregne dannelsen pr gren.
5. Toxin Manipulationer og Fast Cell immunofluorescens
- Ved 2 DIV, behandle neuroner i forsøgsbetingelser med 250 ng / ml netrin-1 og / eller 10 nM Botulinum A toksin (Bonta), som spalter SNARE protein SNAP25 og effektivt inhiberer SNARE exocytose 13, plus 250 ng / ml netrin- 1. Lad et sæt ubehandlede neuroner som kontrol tilstand.
ADVARSEL: Bonta kræver brug af øjet og åndedrætsværn forbindelse med forberedelsen og hjælpløsninger. Bevar alle forurenede materialer som biologisk farligt materiale og autoklave så hurtigt som muligt. - Ved 3 DIV (24 timer efter behandling) Aspirer medier, og straks erstatte med mindst 1 ml Phem fix (se tabel 1 for detaljer) opvarmet til 37 ° C. Der inkuberes i 20 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Skyl 3 x med PBS (til fremtidig brug tætning med parafilm og opbevares ved 4 ° C).
- Placer dækglas i mørke, befugtet farvning kammer og permeabilisere cellemembraner i 10 minutter i frisk fortyndet 0,2% TritonX-100 i PBS (fremstillet af 10% TritonX-100 dyr).
- Fjern permeabilisering løsning og skyl med 50 pi 1x med PBS. Blok i 30 min i ~ 50 pi 10% bovint serumalbumin i PBS (BSA-PBS) eller 10% Kogt Donkey serum i PBS ved stuetemperatur.
- Skyl med 1x PBS igen. Inkuber dækglas i 50 pi primære antistof (1: 1.000 βIII tubulin, for at bekræfte neuronal identitet) i 1% BSA-PBS i 1 time ved stuetemperatur, i mørket.
- Udfør 3x 5 minutters vaske i PBS. Inkuber dækglas i 50 pi af spektralt distinkt sekundært antistof til tubulin (1: 400), og fluorescerende phalloidin (varierer efter excitation: 488 phalloidin ved 1: 400, 647 phalloidin ved 1: 100) i 1% BSA-PBS i 1 time .
- Vask 3x 5 min i 1x PBS og montere dækglas onto dias i montering medier.
- Vakuum overskydende montering medier fra kanterne af dækglasset og tætning med klar neglelak.
- Saml Vidvinklet epifluorescens billeder på et omvendt mikroskop med en 40X 1.4NA målsætning, epifluorescerende evner og EM-CCD.
- Manuelt analysere forgrening hjælp ImageJ. Åbne billedstakke i ImageJ ved at trække filen i vinduet eller gå til Filer> Åbn> Filnavn (figur 4A indsat en).
- Brug af linje> segmenteret linje, spore axon, defineret som den længste neurit strækker sig fra soma (figur 4A inset 2 - 3 i).
- Brug Analyser> Værktøjer> ROI Manager gemme axon sporing som et område af interesse. Trace og gemme hver Axon gren, defineret som en neurit ≥20 um i længden. Medtag kun primære grene (udvækster direkte spiring fra Axon) i analysen (figur 4A indsatte 3 - 4).
- Tryk på 'm' for at måle de gemte områder af interesse, og overføre længder i pixels til et regneark til at beregne længden i um.
- Opdele antallet af axon filialer ≥20 um i længde, ved længden af Axon i um divideret med 100 for at få antallet af axon grene 100 um længde pr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp in vitro biokemiske teknikker til analyse af mængden af SDS-resistente SNARE komplekser i en population af neuroner. Figur 1 viser den resulterende western blot efter afslutningen af SDS-resistent SNARE kompleks assay probet for SNAP-25, syntaxin1A og VAMP2.
TIRF mikroskopi på den basale cellemembran indeholder billeder af de enkelte exocytiske fusion begivenheder i enkelte celler i høj opløsning. Figur 2A viser billedanalyse metode til at identificere VAMP2-phluorin medierede exocytiske begivenheder. Det indsatte viser en enkelt exocytisk begivenhed som vesikelfusion forekommer, og som VAMP2-phluorin diffunderer inden plasmamembranen. Figur 2B viser et eksempel på en exocytisk begivenhed, der indtræffer over tid (sekunder) i en kortikal neuron. Zoomet mellemværker betegne soma, en axon filial og en axonal vækst kegle viser spatial anvendeligheden af dette assay. Cirkler betegner enkelt exocytisk fusion begivenheder, som kan ses via TIRF mikroskopi.
Timelapse DIC billeddannelse af netrin stimuleret axon forgrening afslører timingen af axon gren formation. Figur 3 viser dannelsen af en axon gren i realtid efter netrin stimulering. Hvide pilespidser betegne indledende fremspring fra en gren site. Sorte pilespidser betegne en fuldt dannet, stabil gren på mindst 20 um måling fra de vigtigste Axon til filialen spids. Netrin afhængige stigninger i axon forgrening forekommer efter netrin afhængige stigninger i exocytisk fusion.
Fast celle immuncytokemi kombineret med farmakologisk hæmning af SNARE aktivitet viser, at SNARE exocytose er en forudsætning for kortikal Axon forgrening. Figur 4A, skitserer en trinvis proces med branche tracings PERFO RMED i ImageJ. figur 4B viser repræsentative billeder af kortikale neuroner på 3DIV. Betingelser er som følger: ubehandlet, stimuleret med 250 ng / ml netrin, eller behandlet med Bonta og 250 ng / ml netrin i 24 timer.
Figur 1. Brug af SDS Resistance af SNARE komplekser som en kvantificerbar Metric af SNARE Formation in vitro. Et repræsentativt western blot undersøgt for SNARE komplekse medlemmer VAMP2, Syntaxin1A og SNAP-25 og lastning kontrol BIII tubulin. Begge SNARE proteiner i komplekse og identificerbare monomerer vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
pg "/>
Figur 2. Levende Cell Imaging og Kvantificering af exocytisk vesikelfusion Begivenheder i Kortikal neuroner. (A) Trin for trin oversigt over exocytiske vesikelfusion billedanalyse, som det blev manuelt udført ved hjælp ImageJ. (B) Indsatser paneler vise en enkelt VAMP2-pHlourin vesikelfusion begivenhed som det sker over tid. Det andet panel med et TIRF mikroskopi billede af en hel kortikal neuron udtrykker VAMP2-pHlourin på 2DIV. Stiplede linje bokse betegner regioner af interesse som vist nedenfor: soma, axon gren, og en axonal kegle vækst. Cirkler med regionerne af interesse betegner enkelt vesikel fusion begivenheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Long Term Levende Cell DIC Imaging afslører Timing af netrin-1 Afhængige Axon forgrening. DIC levende celle billeder af en cortical neuron viser dannelsen af axon grene som reaktion på netrin stimulation. Hvide pilespidser betegne punkter af indledende fremspring før neurit nå 20 pm i længden. Sorte pilespidser betegne bonafide grene (længde ≥20 um). Tid betegnet som timer:. Min Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Fast Cell Immunofluorescens Sammen med Toxin Hæmning af exocytose Viser, at eksocytose er påkrævet for netrin-1 Afhængig Axon forgrening. (A) Oversigt over opsporing og analyse trin til kvantificering af axon forgrening i et netrin stimuleret kortikal neuron på 3DIV. (B) Repræsentative billeder af kortikale neuroner ved 3DIV af hver eksperimentel tilstand: ubehandlet, stimuleret med 250 ng / mL netrin, eller behandlet med 10 nM Bonta toksin plus 250 ng / ml netrin. Green er F-actin (phalloidin), rød er βIIItubulin. Pile angiver punkter af axon grene ≥20 um i længden. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning | Opskrift |
| homogeniseringsbuffer | 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4,150 mM NaCl, 1 mM EGTA. Plus nødvendige protease og phosphataseinhibitorer afhængige celletype |
| 2x prøvepuffer | 60 mM Tris-HCl pH 6,75, 5% (v / v) FI-mercaptoethanol, 2% (vægt / volumen) SDS, 10% (vægt / vol) glycerol, 0,007% (vægt /v) bromphenolblåt |
| Phem fiksativ | 60 mM PIPES pH 7,0, 25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM EGTA, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 0,12 M saccharose, 4% PFA |
| montering medier | 20 mM TRIS pH 8,0, 0,5% N-propylgallat, 90% høj kvalitet glycerol, MilliQ H 2 O |
| 10X SDS Running Buffer | Opløs 30,0 g Tris-base, 144,0 g glycin og 10,0 g SDS i 1000 ml H2O, pH 8,3. Fortyndes til 1x. |
| 10X Transfer Buffer | Opløs 30,3 g Tris for 250 mM og 144,1 g Glycine for 1,92 M opløsning i en LH 2 O; (i 1 L 1x puffer tilsættes 100 ml 10x opløsning til 200 ml MeOH og 700 ml kold DI H2O) |
| Serum Gratis Medier (SFM) | 50 ml: 0,5 ml L-glutamin, 1 ml B27, 48,5 ml Neurobasal Media |
| Trypsin Quenching Media (TQM) | 50 ml: 0,5 ml L-glutamin, 2,5 ml FBS, 47 ml NeurobASAL Media |
| TRIS saltvand | 50 mM Tris-CI, pH 7,5, 150 mM NaCI i 1 LH 2 O; (For TBS-T tilsættes 1 ml Tween-20) |
Tabel 1. Opløsninger
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health: RO1-GM108970 (SLG) og F31-NS087837 (CW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
- Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
- Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
- Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).
