Protocol
Verklaring van het onderzoek ethiek: Alle experimenten met dieren hierin gedetailleerd zijn onderworpen aan de regels en voorschriften van de UNC Commissie Animal Care en NIH normen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Voorbereiding en Plating van Gescheiden corticale neuronen
- Euthanaseren timed-drachtige vrouwtjes door CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie. Verwijder gehele hersenen uit de schedels van de embryonale dag 15,5 (E15.5) muizen en microdissect cortex van elk halfrond. Voor gedetailleerde instructies met betrekking tot de microdissectie van embryonale muis cortex zie Viesselmann et al 8.
- Plaats niet meer dan 4 cortex in 1 ml van het ontleden van media in een steriele 1,6 ml microbuisjes. Voeg 120 ul van 10x trypsine en keren de buis 3-5 keer om te mengen.
- Met behulp van een hemocytometer, tel cellen om celkweek gerechten zaad. Opmerking: 1 corticale halfrond biedt ca.oximately 3.000.000 cellen.
- Voor de SDS-resistente SNARE complex biochemie assay plaat zes miljoen cellen per 35 mm schaal en gebruik maken van twee gerechten per aandoening. Opmerking: Dit is vereenvoudigd door het gebruik van 6 well platen bij het vergelijken van meerdere voorwaarden.
- Vertakkingspunt assays plaat neuronen op salpeterzuur gewassen ronde dekglaasjes bij een dichtheid van 250.000 cellen per 35 mm schaal, voor DIC beeldvorming van axon vertakking plaat bij een dichtheid van 150.000. Deze dichtheden voorkomen overbevolking en analyse te vereenvoudigen.
- Voor levende cellen TIRF microscopie, resuspendeer twee miljoen neuronen per transfectie in nucleofection oplossing bij kamertemperatuur.
- Voeg 100 ul van celsuspensie tot microbuisjes die 10 ug VAMP2-pHlourin expressieplasmide en electroporate met een Nucleofector volgens de fabrikant protocol 9.
- Na transfecties onmiddellijk 500 ul van trypsine blussen media toevoegen, verwijderen schorsing uit cuvette en plaat cellen op een holdiversiteit van 400.000 cellen per 35 mm PDL-gecoat glas onderste schaal.
- Plaat alle corticale neuronen in 2 ml serumvrij medium.
2. SNARE Complex Formation Assay
Opmerking: SDS-resistente SNARE complexen werden verwerkt en geanalyseerd zoals oorspronkelijk beschreven 10 met de modificaties hieronder. Voor gevalideerde alternatieve antilichamen tegen degene die hier wordt gebruikt, zie het hoofdstuk materialen.
- Stimuleer E15.5 corticale neuronen 2 dagen in vitro (DIV) met 250 ng / ml netrin-1 of sham controle gedurende 1 uur voorafgaand aan lysis.
- Vóór verwerking monsters, koel centrifuge tot 4 ° C en ingesteld waterbad temperatuur tot 37 ° C, en het verwarmingsblok op 100 ° C.
- Verwijder cel gerechten uit incubator en plaats op ijs.
- Aspireren media uit cellen, te vervangen door ~ 2 ml ijs koud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voorzichtig 2 keer voor 1-2 min per wasbeurt.
- Voor deze test gebruiken 2 waterputten per condvulle.
- Zuig PBS uit de eerste put van een aandoening en te vervangen door 250 ul homogenisering buffer. Laat op ijs gedurende 5 minuten, en vervolgens met behulp van een mobiele tillift, homogeniseren cellen op ijs.
- Zuig het PBS uit de volgende bron van dezelfde staat en voeg de recent gehomogeniseerd mengsel aan de put. Dit eiwit verhogen. Herhaal dit voor alle omstandigheden.
- Na voltooiing pipet gehomogeniseerd oplossing voor een voorgekoelde 1,6 ml microbuisjes op ijs en voeg 20% Triton X-100 tot een eindconcentratie van 1% Triton X-100 bereikt. Vermaal mengen 10 maal met 1000 ui pipet terwijl het minimaliseren van bubbels.
- Incubeer buizen op ijs gedurende 2 minuten om eiwitten te solubiliseren. Na incubatie centrifugeer gedurende 10 minuten bij 6010 RCF bij 4 ° C om niet-oplosbaar gemaakt materiaal te pelletiseren. Verplaats lysaat supernatant in nieuwe gekoeld 1,6 ml buis op ijs.
- Voer eiwitconcentratie analyse met behulp van Bradford assay 11 en verdun monsters naar een final eiwitconcentratie van 3-5 mg / ml met resterende homogenisatiebuffer aangevuld met 1% Triton X-100 en 5 x monsterbuffer aangevuld met B-Mercaptethanol (BME).
- Verdeel elke experimentele monster gelijkmatig in 2 buizen. Incubeer een monster bij 37 ° C gedurende 30 min (SNARE complexen), en de andere bij 100 ° C gedurende 30 min (SNARE monomeren). Inverteer buizen tussenpozen monsters in oplossing te houden.
- Freeze monsters bij -20 ° C tot klaar te scheiden via SDS-PAGE. Voordat monsters lopen via elektroforese onder toepassing van standaardtechnieken, reboil eerder gekookte monsters 5 min bij 100 ° C, maar 37 ° C ontdooien monsters bij kamertemperatuur.
- Run duplicaten van monsters (30 - 40 ug eiwit per monster) over zowel een 8% en een 15% gel; de 8% geeft ideale scheiding van het complex, terwijl de 15% wordt gebruikt voor SNARE eiwitten monomeren (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18kDa, syntaxine-1 ~ 35kDa) kwantificeren. Handhaaf stroombron op 70 V tot de kleurstof lijn is door de stackoning gel en verhoging spanning naar 90V. Ren gels totdat de kleurstof af loopt.
- Monomeren behouden transporterende eiwitten tot 0,2 urn nitrocellulosemembraan op ijs met koud overdracht buffer met 20% methanol (MeOH) toegevoegd, bij 70 V gedurende 45 minuten.
- Droge membraan in een afgesloten schaaltje gedurende 2 uur tot O / N bij kamertemperatuur (O / N geeft de beste resultaten).
- Blok SNARE complex membranen in 10% runderserumalbumine (BSA) gedurende 1 uur bij KT.
- Bereid primaire antilichamen (het herkennen van specifieke SNARE complexe componenten) bij een verdunning van 1: 1000 en probe O / N bij 4 ° C op een rondschudapparaat.
- Spoel blots in Tris gebufferde zoutoplossing plus 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 maal gedurende 5 minuten elk.
- Bereid fluorescerende secundaire antilichaam oplossingen bij een verdunning van 1: 20.000 in 1% BSA in TBS-T en probe voor 1 uur, bij kamertemperatuur bedekt. Herhaal stap 2.12.1 na 1 uur.
- Afbeelding vlekken op een fluorescerende scanning machine uitgerust met een software suite en kwantificeren van zowel de SNARE eiwit complex (immunoreactieve bands boven 40 kDa) en monomeer bands (immunoreactieve banden bij 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa voor SNAP-25, VAMP2 en syntaxine-1, respectievelijk) met behulp van instructies van de fabrikant voor het tekenen van rechthoekige ROI.
3. Imaging exocytose Events via TIRF Microscopie
Opmerking: Dit protocol vereist speciale microscopie apparatuur waaronder een klimaatkamer temperatuur, vochtigheid en CO 2, een omgekeerde TIRF microscoop uitgerust met een epifluorescerende verlichting, een sterke vergroting / hoge numerieke apertuur (NA) TIRF doelstelling, een geautomatiseerde XYZ stadium behouden en een gevoelige Charge Coupled Device (CCD) detector. Dit protocol maakt gebruik van een volledig geautomatiseerde omgekeerde microscoop uitgerust met een 100x 1.49NA TIRF doelstelling een solid state 491 nm laser en een elektron vermenigvuldigen CCD (EM-CCD). Alle apparatuur wordt door beeldvorming en laser besturingssoftware. Voor aanvang van de beeldvormingsprotocol vermogen op de milionmental kamer, toneel, lamp, computer, en de camera.
- Kies een doel binnen imaging software. Zodra het doel is op zijn plaats, maak de doelstelling kachel rond de kraag.
- Bevestigen dat doel wordt volledig omlaag voordat het veiligstellen van het podium incubator in de fase slot. Giet gedestilleerd water in het stadium incubator inlaten gelijkmatig te morsen te voorkomen.
- Zet de incubatie systeem. Open de klep naar de CO 2 tank en bevestig de druk die geschikt is voor het systeem instructies van de fabrikant is. Laat kamer enige tijd tot 5% CO 2 en 37 ° C te bereiken. Voorafgaand aan het toevoegen van de beeldvorming schotel, plaats een lege schaal in de couveuse om condensatie van water op de doelstelling te vermijden.
- Schakel de laserbron.
- Open podium incubator en voeg immersie olie aan de lens. Plaats monster in incubator en te stabiliseren met de stabiliteit van de armen of een gerecht gewicht. Hef het doel tot de olie bodemcontact van het monster maakt. switch tot doorgelaten licht verlichting en vind neuronale focal plane door de oculairs.
- Start laser software en verbinding met de laser besturingssoftware. Stel verlichting om groothoek en selecteer het doel wordt gebruikt (100X 1,49 NA TIRF wordt aanbevolen). Set brekingsindex van het monster (cellen ~ 1,38). Pas laser intensiteit door het vinkje "TTL" voor de 491 nm laser. Pas de schuifknop om 100 breng het dan terug naar een waarde tussen de 20 - 40%. Controleer "TTL".
- Focus op proefmodel nog steeds in doorgelaten licht verlichting. Ga naar imaging software en selecteer 491 nm laser verlichting en open blind. Fijnafstelling het brandpunt van de laser op het plafond en centreren het punt naar het midden van de gesloten veld diafragma met de condensor verwijderd. Plaats condensor ondersteboven op de optische bank, zodat er geen krassen lens.
- Vervang koeler en naar TIRF software en stel indringdiepte (PD) tot 110 nm. Overschakelen van groothoek verlichting naar TIRF Illumderzoek-modus voor beeldvorming.
- Vind VAMP2-pHluorin tot expressie brengen door de oculairs met behulp van groothoek epifluorescentie met epifluorescerende lichtbron.
- Pas beeldvormingsparameters (belichtingstijd, versterking en laser uit) om signaal-ruisverhouding en het dynamisch bereik te maximaliseren met de minimale blootstellingstijd en laser intensiteit verminderen fotobleken en fototoxiciteit (bijvoorbeeld blootstelling gedurende 50 - 100 msec, met een 15-30 krijgen bij 30% maximale laservermogen).
- Stel continue autofocus per cel. Schaf een afbeelding timelapse set met overname plaatsvindt om de 0,5 sec gedurende 5 minuten. Voor de netrine-1 gestimuleerde toestand, voeg 500 ng / ml netrine-1 tot schotel van cellen in een laminaire stroming kap en zet de schotel naar de incubator gedurende 1 uur voorafgaand aan de beeldvorming.
- Om de frequentie van exocytose gebeurtenissen genormaliseerd per cel ruimte en tijd te kwantificeren, geopende afbeelding stacks in ImageJ door het bestand te slepen naar het raam of naar Bestand> Open> Filename (Figuur0; 2A Inzet 1).
- Om stabiele fluorescerende signalen die niet blaasje fusie gebeurtenissen vertegenwoordigen verwijderen, maak een gemiddelde z projectie van de gehele stack met behulp van Image> Stapel> Z-Project> Projectie type: Gewoon Intensity. Trek dit beeld Het gemiddelde van elk beeld in de timelapse met behulp van Process> Afbeelding Calculator> Image1: je stack Operation: aftrekken Image2 nieuw gecreëerde gemiddelde z-projectie. Dit benadrukt exocytose gebeurtenissen (Figuur 2A Inzet 2-3).
- Count exocytose fusie gebeurtenissen op het oog. Exocytose zijn gedefinieerd als de gedaante van een buigingsbegrensde fluorescentiesignaal, die snel diffundeert als VAMP2-pHluorin in het plasmamembraan (Figuur 2A Inzet 6) diffundeert.
- Gebruik de opdracht Drempel om het eerste beeld te markeren met behulp van Image> Adjust> Drempel> schuifregelaar totdat de hele cel drempel gemarkeerd (Figuur 2A Inzet 7-8).
- onder AnaLyze, kiest SetMeasurements en controleer gebied en weergave label. Selecteer de thresholded cellulaire gebied met behulp van de staf tracing tool en druk op 'm' te meten (Figuur 2A Inzet 7-8).
- Transfer zowel de exocytose fusie gebeurtenissen te tellen, de cel gebied metingen en de verstreken imaging tijd om een spreadsheet te aantal exocytose events / mm 2 / tijd (Figuur 2A Inzet 9) te berekenen.
4. Differentieel Interferentie Contrast (DIC) Timelapse Microscopie van Axon Vertakken
Opmerking: Een complete protocol en demonstratie voor een algemene benadering van DIC imaging is beschikbaar 12. Hoewel dit protocol gebruikt DIC, kunnen andere doorvallend licht microscopie methoden worden gebruikt voor hetzelfde doel (bijvoorbeeld fasecontrast).
- Op 2 DIV, plaats glazen bodem imaging schaaltje met ongetransfecteerde neuronen in voorverwarmde klimaatkamer aan een vochtige env behoudenironment met 5% CO2 en 37 ° C. Maken gebruik van een microscoop uitgerust met een 60x Plan-Apochromat, 1.4 NA DIC objectief en een hoge NA condensor voor de beste beeldkwaliteit en resolutie.
- Pas de focal plane neuronen door de oculairs met behulp van uitgezonden licht verlichting te vinden.
- Met behulp van de multi-zone functie voor acquisitie van op imaging software, vinden en sla de XYZ plaatsen van ten minste 6 cellen. Plaats het podium, zodat de neuronen van belang passen binnen het gezichtsveld voor de beste resultaten.
- Stimuleer met 250 ng / ml netrin-1 en druk op 'start met meerdere gebied overname'. Sequentieel beelden te verwerven op elke positie elke 20 seconden gedurende 24 uur, pauzeren acquisitie en heroriëntatie als dat nodig is.
- Geef je mening over beelden in imaging software met behulp van Apps> beoordelen Multi Dimensional Data> geopend bestandsnaam. Identificeer stabiel axon takken (20 micrometer lang) die vorm tijdens de opnamesessie. Gebruik de lijn draw tool om een stableaxon branc metenh van de basis op de axon naar de tip om ervoor te zorgen de 20 urn lengte kwalificatie wordt voldaan.
- In een spreadsheet, noteert u het framenummer na netrin stimulatie wanneer membraan uitsteeksels starten in gebieden waar de takken later vormen evenals het framenummer na netrin stimulatie toen ontluikende takken oplopen tot 20 micrometer in lengte.
- Vermenigvuldig het aantal frames tussen uitsteeksel en vorming tak door 20 seconden om de vorming keer per tak berekenen.
5. Toxine Manipulaties en Fixed Cell immunofluorescentie
- Bij 2 DIV behandelen neuronen in experimentele condities met 250 ng / ml netrine-1 en / of 10 nM Botulinum A toxine (Bonta), die splitst de SNARE eiwitten SNAP25 en SNARE gemedieerde exocytose 13, plus 250 ng / ml remt effectief netrin- 1. Laat één set onbehandelde neuronen als controle conditie.
LET OP: Bonta vereist het gebruik van oog- en adembescherming bij de voorbereiding en het gebruik vanoplossingen. Handhaaf alle verontreinigde materialen als biologisch gevaarlijk materiaal en de autoclaaf zo spoedig mogelijk. - Bij DIV 3 (24 uur na behandeling) aspireren media en onmiddellijk vervangen met ten minste 1 ml PHEM fix (zie tabel 1 voor details) verwarmd tot 37 ° C. Incubeer gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
- 3x spoelen met PBS (voor later gebruik afdichting met parafilm en bewaar bij 4 ° C).
- Plaats dekglaasjes in een donkere, vochtige vlekken kamer en permeabilize de celmembranen gedurende 10 min in vers verdund met 0,2% Triton-100 in PBS (gemaakt van 10% Triton-100 stock).
- Verwijderen permeabilisatie oplossing en spoelen met 50 pl 1x met PBS. Block for 30 min in ~ 50 pi 10% runderserumalbumine in PBS (BSA-PBS) of 10% Gekookte ezel serum in PBS bij kamertemperatuur.
- Spoel met 1x PBS opnieuw. Incubeer dekglaasjes in 50 gl primair antilichaam (1: 1000 βIII tubuline, neuronale identiteit te bevestigen) in 1% BSA-PBS gedurende 1 uur bij KT, in het donker.
- Voer 3x 5 min wassingen in PBS. Incubeer dekglaasjes in 50 pl spectraal verschillende secundaire antilichaam voor tubuline (1: 400), en fluorescerende phalloidin (afhankelijk van excitatie: 488 falloïdine bij 1: 400, 647 falloïdine bij 1: 100) in 1% BSA-PBS gedurende 1 uur .
- Was 3x 5 min in 1x PBS en dekglaasjes op dia's te monteren in de montage media.
- Vacuum overtollige montage media van de randen van het dekglaasje en afdichting met duidelijke nagellak.
- Verzamel groothoek epifluorescentie beelden op een omgekeerde microscoop met een 40X 1.4NA doelstelling epifluorescerende mogelijkheden en EM-CCD.
- Handmatig analyseren vertakking met behulp van ImageJ. Open afbeelding stacks in ImageJ door het bestand te slepen naar het raam of naar Bestand> Open> Filename (Figuur 4A inzet 1).
- Met behulp van lijn> gesegmenteerde lijn, sporen de axon, gedefinieerd als de langste neuriet zich uitstrekt van de soma (Figuur 4A inzet 2-3).
- Met behulp van Analyze> Extra> ROI Manager, sparen de axon traceren als een regio van belang. Traceren en op te slaan elke axon tak, gedefinieerd als een neuriet ≥20 um in lengte. Neem alleen primaire takken (uitwassen rechtstreeks ontspruit uit de axon) bij de analyse (Figuur 4A inzet 3-4).
- Druk 'm' de opgeslagen gebieden van belang te meten en overdragen lengte in pixels van een spreadsheet om de lengte berekenen urn.
- Verdeel het aantal axon vestigingen ≥20 urn lengte door de lengte van het axon in urn gedeeld door 100 om het aantal axon vertakkingen per 100 pm lengte krijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gebruik in vitro biochemische technieken om de hoeveelheid SDS-resistente SNARE complexen in een populatie van neuronen te testen. Figuur 1 toont de resulterende Western blot na afloop van de SDS-resistente SNARE complex assay gesondeerd voor SNAP-25, syntaxin1A en VAMP2.
TIRF microscopie op de basale celmembraan biedt een hoge resolutie beelden van individuele exocytose fusie gebeurtenissen in enkele cellen. Figuur 2A toont de beeldanalyse methodologie voor het identificeren van VAMP2-pHluorin gemedieerde exocytose gebeurtenissen. De inzet toont een exocytose-gebeurtenis als vesikel fusie plaatsvindt en als VAMP2-pHluorin binnen het plasmamembraan diffundeert. Figuur 2B toont een voorbeeld van een exocytose-gebeurtenis in de tijd (seconden) in corticale neuronen. Ingezoomde inzetstukken geven de soma, een axon tak en een axonale groeikegel met de Spätial bruikbaarheid van deze assay. Cirkels geven enkele exocytose fusiegebeurtenissen die via TIRF microscopie zichtbaar.
Time-lapse DIC beeldvorming van netrine gestimuleerde axon vertakking toont de timing van axon tak formatie. Figuur 3 toont de vorming van een axon tak in real time netrin na stimulatie. White pijlpunten duiden de eerste uitsteeksel van een tak ter plaatse. Black pijlpunten duiden op een volledig gevormd, stabiele tak van ten minste 20 urn het meten van de belangrijkste axon aan het bijkantoor tip. Netrin afhankelijke stijgingen in axon vertakking optreedt na netrin afhankelijke toename in exocytose-fusion.
Vaste cel immunocytochemie gecombineerd met farmacologische remming van SNARE activiteit toont aan dat SNARE gemedieerde exocytose is een voorwaarde voor corticale axon vertakking. Figuur 4A, schetst een stap voor stap proces van het filiaal traces perfo rmed in ImageJ. toont figuur 4B representatieve beelden van de corticale neuronen bij 3DIV. Zijn als volgt: onbehandeld, gestimuleerd met 250 ng / ml netrine, of behandeld met Bonta en 250 ng / ml netrin voor 24 uur.
Figuur 1. Met behulp van de SDS Verzet van SNARE complexen als een kwantificeerbaar Metric van SNARE Formatie In Vitro. Een vertegenwoordiger western blot gesondeerd voor SNARE complex leden VAMP2, Syntaxin1A en SNAP-25 en de laad- controle BIII tubuline. Beide SNARE proteïnen in complexe en herkenbare monomeren worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
pg "/>
Figuur 2. Live-cell imaging en kwantificatie van exocytose vesikel fusie Evenementen in corticale neuronen. (A) Stap voor stap overzicht van de exocytose afbeelding blaasje fusion analyse zoals het handmatig werd uitgevoerd met behulp van ImageJ. (B) Inzet panelen tonen een enkele VAMP2-pHlourin blaasje fusie gebeurtenis als het zich voordoet in de tijd. Het tweede paneel een TIRF microscopie beeld van een hele corticale neuron uiten van VAMP2-pHlourin bij 2DIV voorzien. Gestippelde lijn boxen geven de regio's van belang zoals hieronder weergegeven: soma, axon tak en een axonale groei kegel. Cirkels met de regio's van belang aan te duiden enkele blaasje fusie evenementen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Long Term Levende Cell DIC Imaging onthult Timing van Netrin-1 afhankelijke Axon vertakking. DIC levende cellen beelden van een corticale neuron die de vorming van de axon vestigingen in reactie op netrin stimulatie. Witte pijlpunten geven met betrekking tot de eerste uitsteeksel vóór de neurieten bereiken van 20 urn in lengte. Black pijlpunten duiden bonafide branches (lengte ≥20 pm). Time aangeduid als uur: min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Vaste Cell Immunofluorescentie Gekoppeld aan Toxine Remming van Exocytosis Geeft aan dat Exocytosis is vereist voor Netrin-1 afhankelijke Axon vertakking. (A) Overzicht van de opsporing en de analyse stappen voor het kwantificeren van axon vertakking in een netrin gestimuleerd corticale neuron bij 3DIV. (B) Representatieve beelden van de corticale neuronen bij 3DIV van elke experimentele conditie: onbehandeld, gestimuleerd met 250 ng / mL netrin, of behandeld met 10 nM Bontà toxine plus 250 ng / ml netrin. Groen is F-actine (phalloidin), rood is βIIItubulin. Pijlen geven de punten van axon vestigingen ≥20 um in lengte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Recept |
| homogenisatiebuffer | 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4,150 mM NaCl, 1 mM EGTA. Plus noodzakelijk protease en fosfatase remmers afhankelijk celtype |
| 2x monsterbuffer | 60 mM Tris-HCl pH 6,75, 5% (v / v) FI-mercaptoethanol, 2% (w / v) SDS, 10% (w / v) glycerol, 0,007% (w /v) broomfenolblauw |
| PHEM fixatief | 60 mM PIPES pH 7,0, 25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM EGTA pH 8,0, 2 mM MgCl2, 0,12 M sucrose, 4% PFA |
| Mounting Media | 20 mM TRIS pH 8,0, 0,5% N-propyl-gallaat, 90% glycerol hoge kwaliteit, MilliQ H2O |
| 10X SDS loopbuffer | Ontbinden 30,0 g Tris-base, 144,0 g glycine en 10,0 g SDS in 1000 ml H2O, pH 8,3. Verdun tot 1x. |
| 10X Transfer Buffer | Ontbinding van 30,3 g Tris 250 mM en 144,1 g Glycine voor 1,92 M oplossing in 1 LH 2 O; (voor 1 L 1x buffer voeg 100 ml 10x oplossing van 200 ml MeOH en 700 ml koud DI H2O) |
| Serum Free Media (SFM) | 50 ml: 0,5 ml L-Glutamine, 1 ml B27, 48,5 ml Neurobasal Media |
| Trypsine Afschrikken Media (TQM) | 50 ml: 0,5 ml L-glutamine, 2,5 ml FBS, 47 ml Neurobasal Media |
| TRIS gebufferde zoutoplossing | 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl in 1 LH 2 O; (Voor de TBS-T voeg 1 ml Tween-20) |
Tabel 1. Oplossingen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health: RO1-GM108970 (SLG) en F31-NS087837 (CW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
- Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
- Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
- Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).
