Protocol
Araştırma etiği Beyanı: Burada detaylı hayvanları da içeren tüm deneylerde kural ve Hayvan Bakım UNC Komitesi tarafından yapılan düzenlemelere ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için NIH standartlarına tabidir.
1. Hazırlık ve Dissosiye Kortikal nöronlar Kaplama
- CO servikal dislokasyon tarafından takip 2 inhalasyon zamanlı hamile kadın öldürülür. Her yarımkürede embriyonik gün 15.5 (E15.5) fareler ve microdissect korteks kafatası gelen bütün beyinleri çıkarın. Viesselmann ve ark 8 bakınız embriyonik fare korteksin mikrodiseksiyon ilgili detaylı talimatlar için.
- steril 1.6 ml'lik mikrotüp içinde diseksiyon medya 1 ml fazla 4 korteks yerleştirin. 10x tripsin 120 ul ekleyin ve tüpü 3 ters - karıştırmak için 5 kez.
- hemasitometre kullanarak, hücreler, hücre kültür kaplarına tohum saymak. Not: 1 kortikal yarımkürede sağlar yakloximately üç milyon hücre.
- SDS-dirençli Snare karmaşık biyokimya testi için, 35 mm çanak başına altı milyon hücre plaka ve durum başına iki yemekler kullanmaktadır. Not: Bu birden fazla koşul karşılaştırırken 6 kuyucuğu kullanılarak basitleştirilmiştir.
- Dallanma tahlilleri için, nitrik asit levha nöronlar 150,000 yoğunluğunda akson dallanma plakasının DIC görüntüleme için, 35 mm tabak başına 250,000 hücrelik bir yoğunlukta dairesel lamelleri yıkanmıştır. Bu yoğunluklar aşırı kalabalık önlemek ve analizi basitleştirmek.
- canlı hücre TIRF mikroskopi için, oda sıcaklığında nucleofection çözeltide transfeksiyon başına iki milyondan nöron tekrar süspansiyon.
- İmalatçı protokolüne 9'a göre bir Nucleofector sahip VAMP2-pHlourin sentezleme plasmidi ve elektroporasyona 10 ug içeren bir mikrotüp hücre süspansiyonu 100 ul ekle.
- transfections hemen tripsin söndürme medya 500 ul ekledikten sonra, bir den de küvet ve plaka hücreleri süspansiyon kaldırmak35 mm PDL kaplı cam alt çanak başına 400.000 hücre sity.
- Plaka serum serbest medya 2 ml tüm kortikal nöronlar.
2. Snare Kompleks Oluşumu Testi
Not: SDS-dirençli tuzak kompleksleri işlenir ve ilk aşağıda detaylı değişikliklerle 10 tarif edildiği gibi analiz edilmiştir. Burada kullanılan olanlar valide alternatif antikorları için, malzeme bölümüne bakın.
- Önceden lizise 1 saat boyunca 250 ng / ml Netrin-1 ya da sham kontrol ile in vitro (DIV) 'de E15.5 kortikal nöronlar 2 gün teşvik.
- işlem örnekleri, 37 ° C, 4 ° C'ye soğutun santrifüj ve set su banyosu sıcaklığında ve 100 ° C sıcaklıkta bir blok önce.
- inkübatör hücre yemekleri çıkarın ve buz üzerine yerleştirin.
- yıkama başına 2 dakika - hücrelerden aspire ortam, 2 ~ sahip ml buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 1 yavaşça 2 kez değiştirin.
- Bu tahlil için, koşul başına 2 kuyu kullanımıition.
- bir durumun ilk kuyudan aspire PBS ve 250 ul homojenizasyon tamponu ile değiştirin. buz üzerinde hücreleri homojenize 5 dakika boyunca buz üzerinde bırakın ve daha sonra bir hücre kaldırıcı kullanılmıştır.
- Aynı durum bir sonraki oyuk PBS aspire ve de son zamanlarda homojenize karışımı ekleyin. Bu protein konsantrasyonlarını artacaktır. Tüm koşullar için tekrarlayın.
- tamamlanmasından sonra, bir pipet, buz üzerinde önceden soğutulmuş 1.6 mL mikrotüp çözüm homojenize edilir ve% 1 Triton X-100, bir nihai konsantrasyon elde etmek% 20 Triton X-100 ilave edin. kabarcıklar en aza indirirken 1000 ul pipet ile 10 kez karıştırın triturate.
- 2 dakika proteinlerin çözündürülmesi için buz üzerinde inkübe edin. 4 ° C'de 6.010 RCF 10 dakika boyunca inkübasyon, santrifüj olmayan aşağıdaki çözündürülmüş malzeme peletlendi. buz üzerinde yeni soğutulmuş 1.6 ml tüp içine lizat süpernatant taşıyın.
- Bradford tahlili 11 kullanılarak protein konsantrasyonu analizi yapın ve bir fina örnekleri sulandırmakB-Mercaptethanol (BME) ile desteklenmiş,% 1 Triton X-100 ve 5x örnek tampon maddesi ile takviye edilmiş homojenizasyon tamponu kalan 5 mg / ml - 3 L protein konsantrasyonu.
- 2 tüp içine eşit her deneysel örnek bölün. 30 dakika (tuzak kompleksleri) ve 30 dakika (tuzak monomer), 100 ° C de başka bir 37 ° C 'de bir örnek inkübe edin. çözeltide örnekleri tutmak için aralıklı olarak tüpler ters.
- SDS-PAGE ile ayrılması için hazır olana kadar -20 ° C'de örnekleri dondurun. 100 ° C'de 5 dakika boyunca, daha önce kaynatıldı örnekleri reboil, standart teknikler kullanılarak elektroforez ile örnekleri çalışan ancak oda sıcaklığında 37 ° C'de numune çözülme önce.
- Örneklerin Run çiftleri (30 - numune başına protein 40 ug) bir% 8 ve% 15 jel hem; % 15 SNARE protein monomerleri (SNAP-25 ° 25kDa, VAMP2 ~ 18 kDa, sintaksin-1 ~ 35kDa) ölçmek için kullanılır ise,% 8, kompleks doğru ayrılmasını sağlar. boya hattı STAC aracılığıyla kadar 70 V güç kaynağı koruyun90V için kral jel ve artış gerilimi. Boya kapalı bitene kadar jeller çalıştırın.
- monomerler korumak için, 45 dakika boyunca 70 V,% 20 metanol (MeOH) ilave soğuk aktarım tamponu kullanılarak buz üzerinde 0.2 mikron nitroselüloz zar proteinleri aktarın.
- O, 2 saat boyunca kapalı bir tabak içinde kuru membran / oda sıcaklığında N (O / N en iyi sonuçları verir).
- Blok oda sıcaklığında 1 saat için,% 10 Sığır Serum Albumin (BSA) kompleks membranlar SNARE.
- bir döner çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de 1000 ve prob olarak O / N: 1 bir seyreltme (spesifik SNARE kompleks bileşenlerini belirleyen) primer antikorların hazırlanması.
- Tris Tamponlu tuzlu su artı% 0.1 Tween-20 (TBS-T) her biri 5 dakika için 3 kez lekelerini durulayın.
- 1 bir seyreltme floresan ikincil antikor solüsyonları hazırlayın: 20,000,% 1 TBS-T içinde BSA ve prob, oda sıcaklığında kapalı 1 saat için. 1 saat sonra tekrarlayın Adım 2.12.1.
- Bir floresan tarama makinesinde görüntü lekeler yazılım paketi ile donatılmış ve Snare protein co hem ölçmekdikdörtgen İB'leri çizim için üreticinin talimatlarına kullanarak (sırasıyla 25 kDa, 18 kDa, SNAP-25, VAMP2 35 kDa immunoreaktif bantları ve sintaksin-1) mplex (40kDa yukarıda immunoreaktif bantları) ve monomer bantları.
TIRF Mikroskopi 3. Görüntüleme ekzositik Etkinlikleri
Bu protokol, sıcaklık, nem ve CO2 bir epifluorescent aydınlatma, yüksek bir büyütme / yüksek sayısal açıklık (NA) TIRF amacı, otomatik bir XYZ aşaması ile donatılan bir ters TIRF mikroskop korumak için bir çevre odasının dahil olmak üzere özel mikroskopi ekipman gerektirir ve Not: hassas Charge Coupled Device (CCD) dedektörü. Bu protokol, 100X 1.49NA TIRF amacı yarıiletken 491 nm lazer ve bir elektron Çarpma CCD (EM CCD) ile donatılmış bir tam otomatik ters mikroskop kullanılır. Tüm ekipman görüntüleme ve lazer kontrol yazılımı tarafından kontrol edilir. Envir üzerine daha önce başından görüntüleme protokolü gücüonmental odası, sahne, lamba, bilgisayar ve kamera.
- görüntüleme yazılımı içinde seçin hedefi. Amaç yerleştirildikten sonra, yaka etrafında objektif ısıtıcı sabitleyin.
- Bu amaç sahne yuvasına sahne inkübatör güvence önce tamamen aşağı iner onaylayın. dökülme önlemek için eşit sahne inkübatör girişlerine içine distile su dökün.
- Kuluçka sistemi açın. CO 2 tanka vanasını açın ve basıncı, üreticinin talimatlarına göre sistemine uygun onaylayın. Bölmesini% 5 CO 2 ve 37 ° C ulaşmak için biraz zaman tanıyın. görüntüleme çanak eklemeden önce, objektif su yoğunlaşmasını önlemek için inkübatör boş çanak yerleştirin.
- lazer kaynağı açın.
- Açık sahne kuvöz ve lens daldırma yağı ekleyin. inkübatör örnek yerleştirin ve kararlılık kol ya da bir tabak ağırlığı stabilize. Yağ örneğinin alt ile temas edinceye kadar objektif kaldırın. switciletilen ışık aydınlatma h ve Okülerin yoluyla nöronal odak düzlemi bulmak.
- Lazer yazılımını başlatın ve lazer kontrol yazılımı bağlanın. Widefield ve objektif kullanılan seçmek için aydınlatma ayarlayın (100X 1.49 NA TIRF tavsiye edilir). Numunenin Set refraktif indeks (hücreler ~ 1.38). 491 nm lazer için "TTL" işaretini kaldırarak lazer yoğunluğunu ayarlayın. % 40 - daha sonra 20 arasında bir değere geri aşağı getirmek 100 sürgüsünü ayarlayın. "TTL" yeniden kontrol edin.
- iletilen ışık aydınlatma tekrar numune odaklanın. görüntüleme yazılımı gidin ve 491 nm lazer aydınlatma ve açık deklanşörü seçin. Güzel tavana lazer odak noktasını ayarlamak ve çıkarılmış kondansatör ile kapalı alan diyafram merkezine gelin merkezi. böylece değil çizik lens, baş aşağı optik bankta Yoğuşturucuyu yerleştirin.
- kondenser değiştirin ve 110 nm TIRF yazılım ve set penetrasyon derinliğine (PD) gidin. TIRF illum için widefield aydınlatma geçingörüntüleme biçimde uygulanması modu.
- epifluorescent ışık kaynağı ile geniş açılı Epifloresans kullanarak oküler üzerinden eksprime eden hücrelerin VAMP2-pHluorin Bul.
- görüntüleme parametrelerini (pozlama süresi, kazanç ve lazer güç) (örneğin photobleaching ve fototoksisite azaltmak için en az pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu kullanarak gürültü oranı ve dinamik aralık sinyali maksimize etmek için ayarlayın: 50 arasında poz - 100 ms, 15 ile - 30 % 30 maksimum lazer gücü) kazandıracağı.
- Hücre başına ayarlayın sürekli otofokus. edinim 5 dakika boyunca her 0,5 saniyede oluşan seti bir timelapse görüntü kazanır. Netrin-1 uyarılmış durum için, bir laminar akış başlığı içinde hücrelerin çanak-1 netrin, 500 ng / ml ilave edilir ve önce görüntüleme 1 saat için inkübatöre geri çanak.
- , ImageJ açık görüntü yığınlar> Aç> Dosya adı (Şekil penceresinin içine dosyayı sürükleyip bırakmak veya dosya giderek hücre alanı ve zaman başına normalize ekzositik olayların sıklığını ölçmek için0; 2A Ankastre 1).
- Ortalama Yoğunluk: vezikül füzyon olayları temsil etmemektedir kararlı floresan sinyalleri kaldırmak için, Görüntü> Yığın> Z-Project> Projeksiyon tipi kullanarak tüm yığının ortalama z projeksiyonu oluşturmak. > Süreci kullanılarak timelapse> Görüntü Hesaplama her görüntüden Image1 demek görüntüsünü çıkarma: yığını Operasyonu: image2 yeni oluşturulan ortalama z projeksiyon çıkarın. Bu ekzositik olayları (- 3 Şekil 2A Ankastre 2) vurgulamaktadır.
- gözle ekzositik füzyon olayları saymak. Ekzositik etkinlik hızlı VAMP2-pHluorin plazma zarı (Şekil 2A ek 6) içinde dağılır olarak yayılan bir kırınım sınırlı floresans sinyali ortaya olarak tanımlanır.
- > Görüntü kullanarak ilk resmi vurgulayın ayarlayın> Threshold> tam hücre eşiği (- 8 Şekil 2A INSET 7) vurgulanan kadar kaydırıcıyı ayarlamak için Eşik komutunu kullanın.
- Ana altındaLyze, SetMeasurements seçin ve alanı ve ekran etiketi kontrol edin. (- 8 Şekil 2A INSET 7) ölçmek için asa izleme aracı ve basının 'm' ile eşiklenir hücresel alanını seçin.
- Hem ekzositik füzyon olayları saymak Transferi, bir elektronik tabloya hücre alanı ölçümleri ve geçen görüntüleme süresi ekzositik olaylar / mm 2 / süresi sayısını (Şekil 2A Ankastre 9) hesaplamak için kullanılır.
4. Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Akson dallanma Timelapse Mikroskopi
Not: DIC görüntüleme genel bir yaklaşım için tam bir protokol ve gösteri 12 mevcuttur. Bu protokol, DIC kullanır, diğer gönderilen ışık mikroskobu yöntemleri (örneğin: faz kontrast) aynı amaçlar için kullanılabilir.
- 2 SAYI anda, önceden ısıtılmış çevre odasında untransfected nöron içeren yer cam alt görüntüleme çanak nemli env korumak için% 5 CO2 ve 37 ° C ironment. En iyi görüntü kalitesi ve çözünürlük için 60X Plan-apochromat ile donatılmış mikroskop, 1.4 NA DIC objektif lens ve yüksek NA kondenser yararlanın.
- iletilen ışık aydınlatma kullanarak Okülerin aracılığıyla nöronlar bulmak için odak düzlemi ayarlayın.
- görüntüleme yazılımı çoklu alan edinme işlevi kullanarak, bulmak ve en az 6 hücre XYZ yerleri kaydedin. sahne yerleştirin, böylece en iyi sonuçları elde etmek için görüş alanı içinde faiz uyum nöronlar.
- 250 ng Canlandıracak / ml netrin-1 ve basın 'Çok alanlı alımı başlatabilirsiniz.' Sıralı gerektiği gibi satın alma ve odaklanma duraklatma, 24 saat boyunca her pozisyonda her 20 saniyede görüntü kazanır.
- Çok Boyutlu Veriler> açık dosya adını gözden> Apps kullanarak görüntüleme yazılımı görüntüleri inceleyin. istikrarlı akson dalları (20 mikron uzunluğunda) görüntüleme oturumu sırasında bu form tanımlayın. Bir stableaxon branc ölçmek için hat çizmek aracını kullanınucu akson de tabandan saat 20 mikron uzunluk yeterlilik karşılanmasını sağlamak.
- membran çıkıntılar doğmakta olan dalları uzunluğu 20 mikron ulaştığınızda dalları daha sonra yanı sıra netrin stimülasyon sonrasında kare sayısını oluşturan alanlarda başlattığınızda Elektronik tabloda, netrin uyarılmasından sonra kare numarasını kaydedin.
- Şube başına oluşum süresini hesaplamak için 20 saniye çıkıntı ve şube oluşumu arasındaki kare sayısını çarpın.
5. Toksin İşlemler ve Sabit Hücre Immunofluoresence
- Div 2 'de, 250 ng deney koşullarında nöronları tedavi / ml-netrin 1 ve / ya da 10 nM botulinum etkili / mi netrin- ng tuzak aracılı eksositoz 13 artı 250 inhibe böler SNARE proteini SNAP-25'in ve bir toksin (BoNTA), 1. kontrol koşulu olarak işlenmemiş nöronların bir set bırakın.
DİKKAT: hazırlanması ve kullanırken BoNTA göz ve solunum koruması kullanımını gerektirirçözümleri. en kısa sürede biyolojik tehlikesi malzeme ve otoklav gibi tüm kontamine malzemeler koruyun. - 3 bölme (24 saat sonra muamele) aspire ortam ve hemen PHEM düzeltme (ayrıntılar için Tablo 1 'e bakınız) en az 1 ml yerine 37 ° C'ye kadar ısıtıldı. Oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika süreyle inkübe edin.
- (4 ° C'de parafilm ve mağaza ile ileride kullanmak mühür) PBS ile 3x durulayın.
- Koyu renk, nemlendirilmiş boyama odası içinde lamelleri ve (% 10 Triton X-100, stoktan yapılmış) PBS içinde Yeni seyreltilmiş% 0.2 Triton X-100, 10 dakika boyunca hücre zarları permeabilize.
- Permeabilization çözüm çıkarın ve PBS ile 1x 50 ul ile yıkayın. 30 dakika boyunca blok ~ PBS (BSA-PBS) içinde% 10 Sığır Serum Albumin 50 ul ya da 10%, oda sıcaklığında PBS içinde eşek serumu Haşlanmış.
- Yine 1x PBS ile durulayın. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile,% 1 BSA-PBS içinde (nöronal kimliğini teyit etmek için 1000 βIII tubulin 1) birincil antikor, 50 ul lamelleri inkübe, karanlıkta.
- PBS içinde 3x 5 dakika yıkama yapın. tübülin (1: 400) için spektral olarak farklı ikincil antikor, 50 ul lamelleri inkübe ve flüoresan Phalloidin (eksitasyon göre değişir: 100, 1 488 falloidin: 400, 647 falloidin 1), 1 saat boyunca% 1 BSA-PBS'de .
- 1x PBS içinde 3x 5 dakika yıkayınız ve montaj medyada Slaytlarınıza lamelleri monte edin.
- şeffaf tırnak cilası ile lamel ve mühür kenarlarından Vakum fazla montaj medya.
- 40X 1.4NA objektif, epifluorescent yetenekleri ve EM-CCD ters bir mikroskop widefield Epifloresans görüntüleri toplayın.
- El ile ImageJ kullanarak dallanma analiz. Penceresine dosya sürükleyerek veya> Aç> dosya adı (Şekil 4A inset 1) Dosya giderek ImageJ açın görüntü yığınları.
- Line> segmente hattını kullanarak, soma (- 3 Şekil 4A içerlek 2) uzanan en uzun akson olarak tanımlanan akson, iz.
- Analiz> Araçlar> ROI Manager'ı kullanarak, ilgi bir bölge olarak izleme akson kaydedin. Trace ve uzunluğu bir neurite ≥20 mikron olarak tanımlanan her akson dalı kaydedin. Analizi (- 4 Şekil 4A içerlek 3) 'de (doğrudan akson çimlenme çıkıntılar) yalnızca birincil dalları yer alır.
- Ü 'ilgi kaydedilen bölgeleri ölçmek ve mikron uzunluğunu hesaplamak için bir e-tabloya piksel uzunlukları aktarmak için.
- 100 mikron uzunluk başına akson şube sayısını elde etmek için 100 ile bölünmüş mikron akson uzunluğu, uzunluğu ≥20 mm akson şube sayısını bölün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro biyokimyasal teknikler kullanarak. Nöronların bir popülasyonda SDS-dirençli tuzak komplekslerinin miktarını tahlil Şekil 1 SNAP-25, syntaxin1A ve VAMP2 için incelenir SDS-dirençli tuzak kompleksi deneyinde elde edilen Western blot tamamlanmasının ardından göstermektedir.
Bazal hücre membranında TIRF mikroskopi tek hücre bireysel ekzositik füzyon olayları yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar. 2A VAMP2-pHluorin aracılı ekzositik olayları tanımlamak için görüntü analiz metodolojiyi göstermektedir Şekil. Vezikül füzyonu meydana gelir ve VAMP2-pHluorin plazma membranı içinde difüze olurken. Şekil 2B, kortikal nöron (saniye) zaman içinde meydana gelen bir ekzositik olayının bir örneğini gösterdiği gibi ilave tek ekzositik etkinliği gösterir. Zoomed insets soma, bir akson şube ve spati gösteren bir akson büyüme konisi belirtmekBu testin al yarar. Circles TIRF mikroskopi aracılığıyla görülebilir tek ekzositik füzyon olayları belirtir.
Netrin bir Timelapse DIC görüntüleme akson dallanma akson şube oluşumu zamanlamasını ortaya uyarılmış. 3 netrin uyarılmasını takiben gerçek zamanlı bir akson şube oluşumunu tasvir Şekil. Beyaz ok uçları şube sitesinden ilk çıkıntı belirtir. Siyah ok uçları şube ucuna ana akson ölçülmesi en azından 20 um'den bir tam oluşmuş, kararlı şube belirtmektedir. akson dallanma Netrin bağımlı artışlar ekzositik füzyon netrin bağımlı artışlar sonucu ortaya çıkmaktadır.
SNARE etkinliğinin farmakolojik engellenmesi ile birlikte sabit hücre immünositokimya tuzak aracılı ekzositozu kortikal akson dallanma için gerekli olduğunu göstermektedir. Şekil 4A, şube iz perfo aşaması süreci bir adım özetlemektedir içinde rmed ImageJ. Şekil 4B 3DIV kortikal nöronların temsili görüntüler gösterir. şöyle şartlar şunlardır: muamele edilmemiş, 250 ng / ml netrin ile uyarılmış veya Bontà 24 saat boyunca 250 ng / ml netrin ile işlemden geçirildi.
İn Vitro bir Ölçülebilir Metrik tuzak Formasyonu olarak tuzak Kompleksleri SDS Direnç kullanarak Şekil 1.. Tuzak karmaşık üyeleri VAMP2, Syntaxin1A ve SNAP-25 ve yükleme kontrol BIII tübülin için tanınacak bir temsilci western blot. Hem karmaşık ve tanımlanabilir monomerlerin proteinler gösterilmektedir SNARE. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
pg "/>
Şekil 2. canlı hücre Görüntüleme ve ekzositik vezikül füzyon görüntü analizi aşaması anahat Kortikal nöronlar ekzositik veziküllü Füzyon Olayların miktarının belirlenmesi. Adım (a) elle ImageJ kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Zaman içinde meydana geldiği gibi (B) ilave paneller tek VAMP2-pHlourin vezikül füzyon olayı gösterir. 2DIV de VAMP2-pHlourin ifade eden bütün kortikal nöron bir TIRF mikroskopi görüntü sunan ikinci panel. soma, akson şube ve bir akson büyüme konisi: aşağıda gösterildiği gibi noktalı çizgi kutuları ilgi alanları ifade etmektedir. Ilgi bölgeleri ile Circles tek vezikül füzyon olayları ifade etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Uzun Vadeli Canlı Hücre DIC Görüntüleme netrin uyarılara yanıt olarak akson dalları oluşumunu gösteren bir kortikal nöron Netrin-1 Bağımlı Axon dallanma. DIC canlı hücre görüntüleri Zamanlama ortaya çıkarır. Beyaz ok uçları önce uzunluğu 20 mikron ulaşan akson başlangıç çıkıntı noktalarını ifade etmektedir. Siyah ok uçları Bonafide dalları (uzunluk ≥20 mm) ifade etmektedir. Zaman saat olarak ifade. Min bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ekzositoz Toksin inhibisyonu ile birleştiğinde Şekil 4. Sabit Hücre İmmünofloresan Ekzositoz İçin Gerekli olduğunu gösterir netrin-1 Bağımlı Akson dallanma. (A) netrin dallanma akson ölçümü için izleme ve analiz aşamalarının Anahat 3DIV kortikal nöron uyarılmış. (B) her deneysel koşul arasında 3DIV kortikal nöronlar Örnek görüntüler: tedavi edilmemiş, 250 ng / ml netrin, ya da 10 nM BoNTA toksin + 250 ng / ml netrin ile muamele ile uyarılır. Yeşil F-Aktin (faloidin), kırmızı βIIItubulin olmasıdır. Oklar akson dalları uzunluğunda ≥20 mikron noktaları göstermek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Çözüm | yemek tarifi |
| homojenleştirme tamponu | 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4,150 mM NaCl, 1 mM EGTA. hücre tipine bağlıdır Ayrıca, gerekli proteaz ve fosfataz inhibitörleri |
| 2x Numune tampon | 60 mM Tris-HCl, pH 6.75,% 5 (h / h) Fi-merkaptoetanol,% 2 (ağ / hac) SDS,% 10 (ağırlık / hacim) gliserol,% 0.007 (ağ /V) bromfenol mavisi |
| PHEM fiksatif | 60 mM PIPES pH 7.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 10 mM EGTA, pH 8.0, 2 mM MgCl2, 0.12 M sukroz,% 4 PFA |
| montaj Medya | 20 mM Tris pH 8.0,% 0.5 N-propil-galat,% 90, yüksek kaliteli gliserol, MilliQ H2O |
| Buffer Running 10X SDS | Tris baz 30.0 g, glisin 144.0 g ve H2O 1.000 ml, pH 8.3 SDS 10.0 g çözündürülür. 1x seyreltin. |
| 10X Transferi Tampon | 250 mM için 30.3 g Tris ve 1 LH 2 O 1.92 M çözelti için 144.1 g Glisin çözülür; (1 L 1x tamponu 200 mi MeOH ve 700 ml soğuk DI H2O 100ml 10x solüsyonu ekleyin) |
| Serum Free Media (SOY) | 50 mi: 0.5 mi L-glutamin, 1 mi B27, 48.5 mi Neurobasal Medya |
| Tripsin Quenching Medya (TKY) | 50 mi: 0.5 mi L-glutamin, 2.5 ml FBS, 47 mL Neurobasal Medya |
| Tris Tamponlu Tuz | 50 mM Tris-CI, pH 7.5, 1 LH 2 O 150 mM NaCI; (TBS-T için 1 ml Tween-20 ekleyin) |
Tablo 1. Çözüm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
RO1-GM108970 (SLG) ve F31-NS087837 (CW): Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
- Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
- Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
- Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).
