Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Transcriptome على من التنميط Published: January 30, 2017 doi: 10.3791/53754
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2, 3, 1
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval
* These authors contributed equally

Introduction

فقدان الجنينية المبكرة في الأبقار المنتجة العالية هي واحدة من التحديات الرئيسية في صناعة الالبان 1 و 2. أصبح الأبقار نموذج مثير للاهتمام لدراسة تطور سابق للانغراس الجنين الإنسان بسبب عملية تنموية مماثلة من 3 و 4. ومع ذلك، مطلوب مزيد من البحوث لدينا فهم أفضل عن جينات لها دور في التطور الجنيني المبكر البقري.

بعد عشرين عاما على تكنولوجيا متطورة للالأولى وضعت في عام 1995 5، وتطوير التكنولوجيا التحقيق تلفيق تقليل أخطاء الطباعة أكثر تطورا وتقلبه من رقائق مجموعة داخل وبين منصات ميكروأري مختلفة 6. وأسفرت تحسين تكنولوجيا متطورة في تطبيق على نطاق واسع لهذه التكنولوجيا في البحوث السريرية 7 و في الآونة الأخيرة، في ف الجنين في وقت مبكرتقييم ينشيء 8.

كمية كبيرة من المواد اللازمة لتكنولوجيا متطورة للهو السبب الرئيسي وراء فشل تكنولوجيا متطورة في البداية للدخول في عدد من المجالات البحثية مثل التطور الجنيني المبكر. وفي الآونة الأخيرة، تم تحسين أساليب RNA التضخيم لتضخيم خطيا RNA تصل إلى مستوى ميكروغرام من دون نانوغرام بدءا مادة RNA 9. هناك عدة مجموعات الحمض النووي الريبي التضخيم التجارية المتاحة في السوق. ومع ذلك، ترتبط أكثر شعبية في مجموعات متطورة لRIBO-واحدة التمهيدي متساوي التضخيم 10 و T7 المروج دفعت 11 الأساليب. يستخدم الأكثر شعبية التضخيم العقاقير الحمض النووي الريبي في النسخ المختبر مع جزئية DT التمهيدي ربط المروج T7 في "نهاية 12 5. وتسمح هذه التكنولوجيا الحفاظ على معظم النصوص مكافحة الشعور التمثيلية بعد الخطي التضخيم وأو صفائف التهجين 13. وقد تم تكييف هذا الأسلوب لتضخيم مستوى بيكو غرام من الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من الأبقار الجنين 8.

نظام الربط العالمي (ULS) هو طريقة وضع العلامات التي تضم بشكل مباشر على الحمض النووي الريبي أو تضخيم مع مرتبطة البلاتين صبغة الفلورسنت إما Cyanine 547 أو 647 Cyanine، من خلال تشكيل السندات التنسيقي على موقف N7 من جوانين 14. وقد تم تكييف هذه الطريقة في البحث الأجنة لتوليد أكثر استقرارا تضخيم آرنا دون تعديل بالمقارنة مع aminoallyl تعديل لآرنا الناتجة عن طريقة الأنزيمي 15. وقد تم تكييف أساليب كلا صبغ واحد واثنين من الأصباغ وصفها باستخدام نظام الربط العالمي في ميكروأري. وكانت دراسة مقارنات ميكروأري كبيرة أن هناك علاقة جيدة جودة البيانات بين منصات مجموعة واحدة وهما لونا 6.

في الآونة الأخيرة، على حد سواء T7 محرك المروجوقد تم تطوير أساليب ن العقاقير RNA التضخيم وULS وضع العلامات لتوفير بروتوكول أكثر موثوقية لتوليد كمية كافية من جودة عالية وصفت المواد آرنا لميكروأري التهجين 8 و 16. ولذلك، فإن هذه الدراسة على بروتوكول لإظهار بعض الخطوات الهامة من استخراج الحمض النووي الريبي لتحليل البيانات المشاركة في ميكروأري اللونين استخدام يوم واحد 7 أجنة الأبقار كمثال على ذلك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجري الجزء الحيواني من هذه الدراسة في وحدة أبحاث التمثيل الغذائي في جامعة ألبرتا، ادمونتون، كندا، مع كل الإجراءات التجريبية الحيوانية المعتمدة (بروتوكول # AUP00000131) من جامعة ألبرتا رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام، والحيوانات رعايتهم وفقا إلى المجلس الكندي للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان (1993).

1. إنتاج الأجنة، عزل الحمض النووي الريبي مجموع والدناز العلاج

  1. لبروتوكولات التجريبية الحيوانية وجمع الأجنة الرجوع في المنشورات السابقة لدينا 17، 18.
  2. تجمع والمفاجئة تجميد الأجنة مرحلة مماثلة من كل بقرة في النيتروجين السائل ومن ثم الحفاظ على -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع طريق RNA عدة الاستخراج القائم على العمود الذي تمكن من استخراج الحمض النووي الريبي من عينات بيكو النطاق (مجموعة مواد متوفرة في قائمة المواد).
    تحتوي الموصى بها عدة: ملاحظة: تكييف العازلة، استخراج BUFفر، و 70٪ إيثانول، مخزن اغسل 1، مخزن اغسل 2، شطف العازلة، والأعمدة تنقية RNA مع أنابيب جمع وأنابيب microcentrifuge.
  4. إضافة 10 ميكرولتر استخراج العازلة إلى أنبوب يحتوي على الأجنة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 42 درجة مئوية. أنبوب الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 2 دقيقة لجمع استخراج الخلايا في أنبوب microcentrifuge.
  5. ماصة 250 ميكرولتر تكييف عازلة على الغشاء العمود تنقية التصفية. احتضان العمود تنقية RNA مع تكييف العازلة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي العمود تنقية في أنبوب جمع في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  6. ماصة 10 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في خليط من استخراج الحمض النووي الريبي العازلة والأجنة. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. خليط ماصة في العمود تنقية شروطا مسبقة.
  7. لربط الحمض النووي الريبي، الطرد المركزي العمود تنقية لمدة 2 دقيقة في 100 x ج وتابع على الفور من قبل الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 30 ثانية لإزالة التدفق من خلال.
  8. ماصة 10081؛ ل من الاحتياطي اغسل 1 في العمود تنقية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8000 ز س.
    ويوصى الدناز العلاج إذا أداء النسخ العكسي أو التضخيم بعد عزل الحمض النووي الريبي: ملاحظة.
  9. هضم الحمض النووي الجيني الحق بعد خطوة 1.8.
    ملاحظة: الموصى به عدة الدناز متوفرة في قائمة المواد. يحتوي على عدة الموصى بها: أنا الدناز محلول المخزون والاحتياطي.
  10. إعداد الدناز حضانة خليط طريق خلط 5 ميكرولتر الدناز أنا حل الأسهم مع 35 ميكرولتر العازلة. مزيج من قبل قلب بلطف.
  11. ماصة ميكرولتر الدناز حضانة خليط 40 مباشرة في غشاء عمود تنقية. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  12. ماصة 40 ميكرولتر غسل العازلة 1 في غشاء عمود تنقية ثم الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 15 ثانية.
  13. ماصة 100 ميكرولتر غسل العازلة 2 في العمود تنقية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8000 ز س.
  14. ماصة آخر 100 ميكرولتر غسل العازلة 2 في العمود تنقية وأجهزة الطرد المركزيلمدة 2 دقيقة في 16000 ز س.
  15. نقل العمود تنقية ل0.5 أنبوب جديد مل microcentrifuge. ماصة 11 ميكرولتر من شطف العازلة مباشرة على الغشاء العمود تنقية. لضمان أقصى قدر من الاستيعاب للشطف العازلة في غشاء، لمس بلطف غيض من ماصة على سطح الغشاء في حين الاستغناء عن شطف العازلة.
  16. احتضان العمود لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي العمود لمدة 1 دقيقة في 1000 x ج لتوزيع الاحتياطي شطف في العمود، ثم تدور لمدة 1 دقيقة في 16000 x ج لأزل الحمض النووي الريبي.
  17. استخدام أداة bioanalyzer وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لتقييم نوعية الحمض النووي الريبي وكمية 19.
  18. تخزين عينة الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. الحمض النووي الريبي التضخيم وصفها لتحليل ميكروأري

ملاحظة: للحصول على أول المستخدم وقت العمل للإجراءات التضخيم RNA ووضع العلامات، واستخدام خمسة نانوغرام من ارتفاع في الحمض النووي الريبي الونانوغرام مع العينات آرنا الفعلية لمراقبة وقياس ومراقبة الجودة لتضخيم الحمض النووي الريبي والتهجين. ارتفاع في مزيج RNA يحتوي على عشرة في المختبر توليفها، ونصوص مذيل بعديد الأدينيلات في نسب محددة مسبقا. عندما إجراء العملية بشكل صحيح، والنصوص وصفت هجن خصيصا فقط لتحقيقات الرقابة التكميلية في المصفوفات ويمكن تفحص بيانات لتتبع ضمان مراقبة الجودة مع الحد الأدنى الذاتي أو عبر التهجين. مزيد من التفاصيل وصف بشأن إجراء ارتفعت في شدة الرقابة والتطبيع بعد مسح تحليل مجموعة والبيانات الرجوع إلى الإصدارات السابقة 20 و 21. وبالنظر إلى الإجراء التالي لمستخدمي ميكروأري الروتيني.

  1. إعداد 100 خريج جودة عالية عينة الحمض النووي الريبي (RNA عدد النزاهة (رين) القيمة على الأقل> 7.0) في إجمالي حجم 10-11 ميكرولتر.
  2. تضخيم عينات الحمض النووي الريبي مع عدة التضخيم أن تكون قادرة علىالعمل مع عينات بيكو الحجم (اقل من 100 خريج).
    ينصح المعلومات عدة التضخيم المتاحة في قائمة المواد ويتبع تعليمات الشركة الصانعة دون أي تعديل: ملاحظة.
  3. استخدام الكميات القائم على مضان لتقييم الملف الشخصى نطاق حجم آرنا تضخيمها.
  4. استخدام أداة طيفي (استنادا إلى الامتصاصية في 260 و 280 نانومتر) لقياس تركيز آرنا تضخيمها.
  5. تخزين آرنا تضخيمها في -80 درجة مئوية حتى على استعداد لوضع العلامات.
  6. استخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي تضخيمها لوضع العلامات الفلورية وفقا لدليل المستخدم ULS آرنا العلامات عدة.
    ملاحظة: منذ Cyanine 547 و 647 Cyanine صبغة حساسة للالصور التدهور وCyanine 647 صبغ تتحلل بسهولة عن طريق الأوزون، وإجراء وسم تجري في كمية ضئيلة من الضوء وتحت بيئة خالية من الأوزون.
  7. بدوره على مربع الأوزون (الشكل 1A) حتى مستوى الأوزون هو 0.001 جزء من المليون.
    8. (الشكل 1B) وذلك بإضافة 2 ميكرولتر من Cyanine 547 أو Cyanine 647، 2 ميكرولتر من العازلة وضع العلامات، ومن ثم التكيف مع الحجم النهائي من 20 ميكرولتر مع ريبونوكلياز خالية من المياه تحت safelight. إضافة فلتر غرفة مظلمة لمصدر الضوء.
  8. المزيج بلطف واحتضان الأنابيب في thermocycler في 85 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. مكان عينات على الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل. تدور باستمرار لجمع المحتوى من الأنابيب قبل الشروع في عدة استخراج الحمض النووي الريبي، باستثناء الخطوات المتعلقة العلاج الدناز (1،9 حتي 1،11)، لتنظيف الحمض النووي الريبي تضخيمها وصفت قبرصي صبغ.
  9. استخدام أداة معمل لقياس وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي تضخيمها وصفت والحفاظ على آرنا المسمى في -80 درجة مئوية كحد أقصى لمدة 3 أيام قبل الاستخدام.

3. ميكروأري التهجين وغسل

ملاحظة: يتم تكييفها الخطوات الهامة التالية وفقا لبروتوكول تحليل اللونين القائم على ميكروأري التعبير الجيني (الإصدار6.5، مايو 2010).

  1. إضافة كمية مساوية من 825 نانوغرام من كل Cyanine 547- وCyanine 647 المسمى آرنا وتخلط مع 25X تجزئة و 10x مخازن الحجب.
  2. تسخين الخليط في 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وباردة على الجليد لمدة 1 دقيقة.
  3. إضافة مبلغ مساو من العازلة التهجين 2X و تخلط جيدا.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة، ثم خليط جاهز للتهجين.
  5. تحميل 100 ميكرولتر من الخليط على الشريحة مجموعة وختم الشريحة داخل غرفة التهجين.
  6. تحميل غرفة تجميعها في الفرن التهجين لمدة 17 ساعة عند 65 درجة مئوية الدورية في 10 دورة في الدقيقة في الفرن.
  7. غسل المصفوفات وفقا لبروتوكول العلاج حماية طبقة الأوزون عن طريق غمس في تحقيق الاستقرار وتجفيف حل لمدة 30 ثانية.
  8. إزالة صفائف من الحل وتأكد من أن السطح مجموعة جاف مع عدم وجود جزيئات الغبار

4. الضوئي ميكروأري الشريحة

  1. الحفاظ على المصفوفات في مكان مظلم وتشغيل scannإيه حتى انها مستعدة لاستخدام (15 دقيقة وقت الانتظار).
  2. تحميل الباركود مجموعة على اليسار، في الماسح الضوئي وبدء المسح الضوئي. هل تحليل البقعة وفقا لدليل مستخدم البرنامج وحفظ البيانات و(GPR) تنسيق الملف.

5. التحليل الإحصائي

  1. تحميل البرنامج FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php انقر على "البيانات الخام استيراد" وتحميل الملفات GPR إلى FlexArray.
  2. إجراء تطبيع والتحليل الإحصائي إذا لزم الأمر عن طريق اتباع التعليمات. ملاحظة: احسب عتبة لاختيار بقعة إيجابية في هذه الدراسة كما وصفه سابقا 22.
  3. حدد المنسدلة دليل من المشاهد مؤامرة من FlexArray لعرض جميع البقع المهجنة والإشارات الخلفية. ملاحظة: صورة مماثلة من ارتفعت في الضوابط بعد التهجين لميكروأري يمكن أن ينظر في دراسة سابقة (8).
  4. اخترتطبيع اللوس ضمن مجموعة التالية من قبل quantile بين عملية صفائف التطبيع من FlexArray المنسدلة دليل وفقا لذلك.
  5. تصدير جميع البيانات تطبيع من FlexArray إلى ملف إكسل لمزيد من الاستخدام.

6. تحليل المعلومات البيولوجية

الشرح الأصلي للتسلسل التحقيق من النصوص-جنين محدد الأبقار وقد وصفت (BESTv1) ميكروأري قبل 8. في الدراسة الحالية، تم الحصول على 20403 الرموز جين فريدة (ع) ( الملحق FILE1 ) من خلال مختبر نظام إدارة المعلومات EmbryoGENE (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). قائمة 6765 الجينات الفريدة ( الملحق FILE2 تم اختيار) ويتفق مع الإشارات كلها إيجابية بعد عملية ميكروأري التطبيع (الخطوة 50.5) من الأبقار يوم 7 أجنة الجينات الشخصية التعبير. تم حساب عتبة إشارة إيجابية على أساس نشر الأسبق 16 من قوة إشارة قيمة A.

  1. لإجراء تحليل وظيفي مع كوجر (البروتين خلال تحليل التطوري العلاقات) نظام تصنيف 23، 24، افتح الرابط التالي (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
  2. تحميل قائمة من 6765 GS-جنين محددة لتحديد عملية بيولوجية معينة أثناء التطور الجنيني باستخدام اختبار زيادة تمثيل الإحصائي واستخدام الإعداد الافتراضي لبوس الثور (جميع الجينات في قاعدة البيانات) عن قائمة مرجعية 25.
    ملاحظة: هذا يسمح تحديد العمليات المتعلقة التنموية، من حيث GO التي هي الإفراط إحصائيا أو تحت أعرب باستخدام اختبار ذي الحدين.
  3. تعيين عتبة ف قيمة في <0.05 كما الافتراضية البرمجيات. البيانات التي يمكن تحميلها والمعرضrted إلى ملف إكسل لمزيد من اختيار 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد نتيجة ممثل من الحمض النووي الريبي مجموع وتضخيمها آرنا من يوم 7 أجنة الأبقار في الشكل (3) وتلخيصها في الجدول 1.

ويمكن تقييم سلامة الحمض النووي الريبي والشخصية بعد استخراج الحمض النووي الريبي. يمكن أن يتم تقييم نوعية الحمض النووي الريبي أداة bioanalyzer (الشكل 3A) وفقط تلك العينات مع قيمة رين أعلى من 7.0 مؤهلون لاستخدامها لتضخيم (الجدول 1).

وينبغي تقييم نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي تضخيمها بعد التضخيم. تشابه الشخصية RNA تضخيم ومجموعة الحجم المناسب هي العوامل الرئيسية لمراقبة الجودة (الشكل 3B). بعد التضخيم من جولتين، شظايا الحمض النووي الريبي تضخيمها متشابهة جدا في الحجم، والتي تتراوح بين 200 و 800 سنة مضت (الشكل 3B) وويتم اختيار جميع aRNAs نطاق حجم مماثل لمزيد من العلامات مضان. أيضا، فإن تضخيم الناجح لالحمض النووي الريبي مجموع الأصلي تسفر على الأقل أكثر من ألف أضعاف من آرنا (الجدول 1).

ويمكن حساب مضان كفاءة وضع العلامات وفقا لدرجة من نسبة وصفها. الصيغة المتاحة في دليل المستخدم ULS آرنا العلامات عدة. ويشير دليل المستخدم يجب أن يكون على درجة من نسبة العلامات 1،0-3،6٪، مشيرا إلى أن ما معدله 1-3،6 جزيئات ULS لكل 100 النيوكليوتيدات.

ملفات الصور بعد التهجين والمسح الضوئي ويمكن الاطلاع من FlexArray. ويرد جودة الصورة الممسوحة ضوئيا جيدة بعد التهجين ميكروأري والغسيل في الشكل 4A. إذا مواد المسمى أقل أو أعلى من هذا النطاق، فإن الإشارات تكون منخفضة للغاية للكشف أو سوف يتم الكشف عن مستويات عالية الخلفية بعد scanniنانوغرام (الشكل 4B).

في الدراسة الحالية، تم تعيين عتبة إشارة إيجابية في 7.6 (مسبار إشارة أعلى من 7.6 أو الخلفية <7.6 تعتبر إيجابية). حوالي يشار 46٪ من مجموعات التحقيق يمثلون 20826 النقاط الإيجابية في اللون الأحمر في يوم البقري 7 الأجنة (الشكل 5). بعد إزالة الرموز الجين غير المشروحة ومكررة، ويترك فقط 6765 حرف الجينات فريدة من نوعها لتحليل كوجر.

وتمثل هذه الجينات 6765 محاضر RNA الفريدة التي أعرب عنها في الأبقار الكيسة يوم 7. من أجل العثور على عملية بيولوجية محددة لالكيسة البقري، يتم تنفيذ كوجر زيادة تمثيل الاختبار. أفضل 10 جين علم الوجود (GO) معرفات الأمد مع أعلى مؤشر تخصيب أضعاف يتم تحديد (الشكل 6). بشكل عام، هذه الشروط GO محددة تمثل إلى حد كبير عملية الانقسام الخلوي النشطة مثل mitosiالصورة وكروموسوم العزل، وتنظيم دورة الخلية وبدء الترجمة حشوية والميتوكوندريا.

شكل 1
الشكل 1: خالية من الأوزون صندوق (A) وصفيف وصفها رد الفعل (B). أ) يتكون الأوزون صندوق حر وحدة المحول الحفاز الذي بتدوير الهواء ويدمر طبقة الأوزون، وجهاز استشعار الأوزون حساسة للغاية لمراقبة مستوى الأوزون داخل منطقة الجزاء أثناء أداء ميكروأري. ب) إجراء صفها والتهجين مجموعة أداء داخل منطقة الجزاء لتجنب الفلورسنت Cyanine 647 تدهور صبغ بالأوزون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2الشكل 2: PANTHER جين قائمة تحليل. وتشير السهام الحمراء المنطقة تحتاج إلى شغلها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: الممثل Bioanalyzer رحلاني من الحمض النووي الريبي مجموع (A) وصورة جل من أسهب RNA (B). أ) عرض النتيجة الاجمالية مع قيمة رين، تركيز الحمض النووي الريبي، ونسبة الريباسي. ب) الملف من الحمض النووي الريبي تضخيمها بعد جولتين التضخيم. ومن المتوقع أن تكون في نطاق بين 200 و 800 نقطة أساس شظايا الحمض النووي الريبي تضخيمها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: صورة خريطة صفيف كثافة. (أ) صورة جيدة من شريحة مجموعة تظهر قناة الخضراء والحمراء تتوافق مع Cyanine 547 و Cyanine 647 الإشارات بعد المسح مع كثافة عالية بقعة (المشار إليها على اليسار مع اللون الأزرق والأخضر) وخلفية منخفضة (المشار إليها على اليمين مع الأزرق الداكن اللون). (ب) صورة سيئة لشريحة مجموعة تظهر صورة خلفية عالية جدا من القناة الحمراء (المشار إليها من لوحة العلوي مع اللون الأزرق والأخضر مماثل من صورة Cyanine 647 كثافة البقعة). لون الرسم البياني يشير إلى كثافة إشارة مع القيم العددية المقابلة لألوان مختلفة. قيمة كثافة إشارة هي الأدنى في نطاق اللون الأزرق الداكن. الرجاء انقر هنا لعرض كبيرةنسخة ص من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: MA مؤامرة ليوم 7 البقري الأجنة جين الملف التعبير. 20826 بقع حمراء تمثل إشارات إيجابية فوق الإشارات الخلفية. ويسلط الضوء على النقاط الأساسية في اللون الأسود. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: أفضل 10 جين علم الوجود (GO) معرفات الأجل مع مؤشر إثراء أعلى أضعاف. هذه الشروط GO محددة تمثل إلى حد كبير عملية الانقسام الخلوي النشطة مثل الانقسام والتفرقة كروموسوم، وتنظيم دورة الخلية وبدء حشوية والميتوكوندريا العابرةlation. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عينة عدد من جنين اكتب جنين نوعية المورفولوجية تركيز الحمض النووي الريبي (ص / ميكرولتر) رين الحمض النووي الريبي مجموع مستعملة لتضخيم (ص) تركيز الحمض النووي الريبي تضخيمها (نانوغرام / ميكرولتر)
S1 4 الكيسة الصف 1 و 2 101 8.6 858.5 3498.4
S2 1 الكيسة الصف 2 142 7.4 1207 1682.4 S3 2 الكيسة الصف 1 135 8.8 1147.5 3185.3
4 س 3 الكيسة الصف 1 177 9 1504.5 2906.4
S5 5 الكيسة الصف 1 636 8.3 5406 3437.5
S6 3 الكيسة الصف 1 و 2 159 9.1 1351.5 1689.8
S7 3 الكيسة الصف 1 154 9 1309 4507.1
S8 4 الكيسة الصف 1 304 8.5 2584 3089.3
S9 5 الكيسة الصف 1 282 9.1 2397 3917.8
S10 6 الكيسة الصف 1 و 2 374 9.4 3179 2979
S11 5 الكيسة الصف 1 272 9.3 2312 2576
S12 3 الكيسة الصف 1 206 9 1751 2567.9

الجدول 1: نموذج والمعلومات الحمض النووي الريبي. وينبغي تقييم التركيز ونوعية من الحمض النووي الريبي بعد الاستخراج. سلامة الحمض النووي الريبي وتركيز يمكن تقييمها من قبل أي bioanalyzer. وينبغي أن يكون RNA عدد النزاهة أكثر من 7.0. يجب أن يتم فحص تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق أداة طيفي بعد التضخيم. امبريتم تقييم الجودة س وفقا لدليل الجمعية نقل الأجنة الدولية (3 الثالثة الطبعه، سافوي، IL).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المشكلة الأولى لأداء تحليل ميكروأري استخدام يوم واحد 7 أجنة الأبقار هو عدم الحصول على كميات كافية من الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية لدراسة التعبير الجيني. لا ينصح استخراج الحمض النووي الريبي الفينول التقليدي / الكلوروفورم وطريقة الإيثانول هطول الأمطار ليوم 7 الأجنة، مما أدى إلى انخفاض المحصول والممكن الفينول بقايا تثبيط رد الفعل RNA التضخيم. بدلا من ذلك، وهو أسلوب قائم على العمود هو معيار أفضل لعزل الحمض النووي الريبي مجموع ثم أزل الحمض النووي الريبي مع الحد الأدنى من شطف العازلة لزيادة التركيز. يتم الحصول على ما معدله 780 خريج من الحمض النووي الريبي مجموع في جنين في الدراسة الحالية والتي هي قابلة للمقارنة مع غيرها من التقارير باستخدام منهجية مماثلة 26 ونفس الحمض النووي الريبي استخراج مجموعة 27، 28 المستخدمة حاليا. لاستخراج الحمض النووي الريبي، فمن المستحسن أن حل راسب قبل الاستخدام عن طريق خلط دقيق أو تدفئة قنينة استخراج العازلة لإعادة حل، قبل أن استخراج العازلةليستخدم. وعلاوة على ذلك، فترة حضانة مهم للالعائد الحمض النووي الريبي في خطوة الاستخراج أيضا. فترة حضانة أقل من 30 دقيقة كاملة في 42 درجة مئوية تخفيض العائد الحمض النووي الريبي.

على عمود ضروري الدناز الهضم لإزالة التلوث الحمض النووي الجيني أثناء إجمالي تنقية الحمض النووي الريبي. الإنزيم الدناز حساسة جدا لدوامة وأجهزة الطرد المركزي. لذلك، الدناز وعازلة يجب أن تكون مختلطة من قلب بلطف.

نوعية من الحمض النووي الريبي مهمة جدا في تحليل ميكروأري والعينات مع رين أقل من 7 لا ينبغي النظر لتهجين. في الدراسة الحالية، فإن مجموع التشكيلات RNA التي حصلت عليها bioanalyzer مماثلة لتلك التي لوحظت من قبل في الدراسات من الكيسات الأريمية البقري 26 و 27. ومن الجدير بالملاحظة أنه عند استخدام الأجنة قبل الفقس، وخاصة RNA أعدت من البويضات والأجنة قبل الأمهات إلى الانتقال الجنينية، وقيمة رين أقل في كثير من الأحيان من 7 مقارنةإلى الحمض النووي الريبي مجموع من يوم 7 أجنة وهذا يرجع إلى الاختلاف في نسبة 28S / 18S الريباسي 27.

كمية من الحمض النووي الريبي المستخرج من أجنة الأبقار ليست كافية لمنصة التهجين، وبالتالي، لا بد من الحمض النووي الريبي التضخيم. هناك العديد من الطرق المتاحة لتضخيم الحمض النووي الريبي مثل PCR، في النسخ المختبر (IVT)، وRIBO-SPIA (التمهيدي واحد متساوي الحرارة التضخيم). على الرغم من أن الأسلوب الأخير هو أسرع وفي يوم واحد يوفر مادة كافية لصفائف، فإنه مطلوب لا يقل عن 5 نانوغرام في بدء المواد 29. ومن هنا، اخترنا طريقة IVT التي هي قادرة على العمل مع المواد الأولية منخفضة 12 (اقل من 100 خريج). وعلاوة على ذلك، فقد تم اختباره لتضخيم الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من الأبقار الجنين بنجاح (29). في الدراسة الحالية، لدينا أسلوب التضخيم تنتج ~ 28 ميكروغرام RNA تضخيم في الجنين من 598 الحمض النووي الريبي مجموع خريج في جنين. Additioنالي، بعد جولتين التضخيم، وأظهرت عينات لدينا صورة مماثلة ومدى حجم المناسب (ما بين 200 و 800 سنة مضت) والتي تتفق مع الدراسات السابقة 13 و 15.

في هذا البروتوكول، استخدمنا غير الأنزيمية الوسم البروتوكول، cyanine المرتبطة البلاتين (Cyanine 547 و Cyanine 647) الأصباغ. وتسمح هذه الطريقة وضع العلامات من الحمض النووي الريبي تضخيمها أو غير تضخيم. بعد خطوة التضخيم قبل وضع العلامات يسمح باستخدام النيوكليوتيدات الطبيعية، مما يؤدي إلى زيادة الغلة تضخيم الحمض النووي الريبي، والحد من التحيز وتوليد شظايا أطول مقارنة مع طريقة الأنزيمية. وcyanine الأصباغ 547 و 647 Cyanine شائعة الأصباغ الفلورية يوصي لمجموعة اللونين. ومع ذلك، Cyanine 647 صبغة حساسة للتدهور طبقة الأوزون. ومن ناحية رصد الأوزون التي عقدت ينبغي أن تستخدم للتأكد من مستوى الأوزون أقل من 2 جزء في البليون. وبالإضافة إلى ذلك، والغبار بيئة خالية ضرورية لتجنب جزيئات الغبار الوقوع في الحل التهجين أو الزيتوز المسح.

ويمكن تصميم التجربة ميكروأري في نهج واحد أو اثنين من لون. كل المنهج التجريبي لديه بعض المزايا والعيوب. باستخدام تصاميم اللونين يقلل من التباين والضوضاء الخلفية، ويسمح للمقارنة المباشرة وحلقة التصاميم مع تحديد عينة مرجعية مشتركة. على الرغم من التحيزات صبغة محددة يمكن أن تؤثر إلى حد كبير النتائج عندما يتم تنفيذ التجارب باستخدام تصاميم اللونين، هذه التحيزات يمكن تخفيفها عن طريق إجراء مقايضة صبغ. هذا التكرار الفني ويضيف إلى تكاليف التجريبية، ولكن يمكن أن يعزز كلا من الدقة والحساسية في قياس الفارق التعبير 31.

مقارنة البرمجيات المعلوماتية الحيوية الأخرى (مثل الغوريلا) PANTHER يسمح بمقارنة بيانات مع بوس الجينوم الثور كمرجع. وتشير النتائج التي توصلنا إليها خلال يوم واحد 7 البقري التطور الجنيني ما يلي المكونات البيولوجية وتشارك وظائف: تنظيم الطورية / الوطن الامالانتقال HASE من دورة الخلية، وتنظيم انتقال الإنقسامية الطورية / طور الصعود، وتنظيم الفصل كروموسوم والترجمة الميتوكوندريا، والبروتين المرتبط K48 ubiquitination، ER إلى جولجي النقل بوساطة حويصلة، عملية الهدم مرنا كتب النووية، وبدء متعدية، شقيقة الإنقسامية كروماتيدي العزل والانقسام النووي الإنقسامية.

البروتوكولات المعروضة في هذه الورقة، من وضع العلامات الفلورية من الحمض النووي الريبي تضخيمها لمسح صفائف يجب أن يعدم مع الوعي اضافية من العوامل البيئية المذكورة أعلاه للحفاظ على بيانات عالية الجودة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PicoPure RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT0204
RNase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit Applied Biosystems KIT0505
2100 Bioanalyzer Instruments Agilent Technologies G2940CA
RNA Screen Tape Agilent Technologies 5067-5576
ULS Fluorescent Labeling Kit Kreatech Diagnostics EA-021
Custom Gene Expression Microarrays Agilent Technologies G2514F
Agilent Gene Expression wash buffer 1 Agilent Technologies Part #5188-5325
Agilent Gene Expression wash buffer 2 Agilent Technologies Part #5188-5326
2x Hi-RPM Hybridization buffer Agilent Technologies  Part #5190-0403
25x Fragment buffer Agilent Technologies Part #5185-5974
10x GE Blocking Agent Agilent Technologies Part #5188-5281
Stabilization and drying solution Agilent Technologies  Part #5185-5979
Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy Agilent Technologies G2524-60012 Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide
Two-Color RNA Spike-In Kit Agilent Technologies  Cat# 5188-5279
GenePix 4000B array scanner Molecular Devices GENEPIX 4000B-U
Ozone Free Box BioTray OFB_100x200
GAL file Agilent Technologies -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
  2. Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
  3. Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
  4. Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
  5. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  6. Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
  7. Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
  8. Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
  9. Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
  10. Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
  11. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
  12. Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
  13. Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
  14. Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
  15. Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
  16. Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
  17. Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
  18. Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
  19. Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf (2016).
  20. Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
  21. Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
  22. Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
  23. Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  24. Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
  25. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
  26. Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
  27. Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
  28. Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
  29. Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
  30. Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).
  31. Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 119، الأجنة، RNA التضخيم، RNA وضع العلامات، وهما لونا ميكروأري، بيئة خالية من الأوزون، البقري
Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salehi, R., Tsoi, S. C. M., Colazo,… More

Salehi, R., Tsoi, S. C. M., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Robert, C., Dyck, M. K. Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform. J. Vis. Exp. (119), e53754, doi:10.3791/53754 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter