Introduction
La pérdida embrionaria temprana en vacas lecheras de alta producción es uno de los principales retos en la industria láctea 1, 2. Bovina se ha convertido en un modelo interesante para estudiar el desarrollo de preimplantación de embriones humanos debido a su proceso de desarrollo similares 3, 4. Sin embargo, se requiere más investigación para tener una mejor comprensión acerca de los genes implicados en el desarrollo embrionario temprano bovina.
Después de veinte años desde la primera tecnología de microarrays desarrollaron en 1995 5, el desarrollo de más sofisticada tecnología de sonda de fabricación reducidos errores de impresión y la variabilidad de los chips de matriz dentro y entre las diferentes plataformas de microarrays 6. La tecnología de microarrays mejorada dio como resultado una amplia aplicación de esta tecnología en la investigación clínica 7 y, más recientemente, en embrión temprano qevaluación uality 8.
La gran cantidad de material necesario para la tecnología de microarrays es la razón principal por la que la tecnología de microarrays inicialmente no introduzca un número de campos de investigación tales como el desarrollo embrionario temprano. Más recientemente, los métodos de amplificación de ARN se han mejorado para amplificar linealmente ARN hasta el nivel de microgramos de sub-nanogramos material de partida 9 ARN. Hay varios kits de amplificación de ARN comerciales disponibles en el mercado; sin embargo, las más populares kits bien desarrollados están relacionados con Ribo-cebador único amplificación isotérmica 10 y 11 impulsadas promotor T7 métodos. El más popular de amplificación del ARN antisentido utiliza la transcripción in vitro con un cebador oligo dT que une a un promotor de T7 en el extremo 5 12. Esta tecnología permite mantener la mayor parte de las transcripciones antisentido representativas después de la amplificación lineal fo matrices de hibridación 13. Este método ha sido adaptado para amplificar el nivel de picogramos de ARN total extraído de embriones bovinos 8.
Sistema de elevador universal (ULS) es el método de marcaje que incorpora directamente el ADN o ARN amplificado con colorante fluorescente de platino ligado ya sea Cyanine 547 o Cyanine 647, formando un enlace de coordinación en la posición N7 de la guanina 14. Este método fue adaptado en la investigación de embriones para generar más estable amplificada Arna sin modificaciones en comparación con el aminoallyl modificó Arna generado por el método enzimático 15. Ambos métodos único colorante y etiquetado dos colorantes se han adaptado utilizando Sistema de Enlace Universal de microarrays. Un amplio estudio de microarrays comparaciones fue que existe una buena correlación entre la calidad de datos entre las plataformas de gama de uno y de dos colores 6.
Recientemente, tanto en coche T7 promotormétodos n RNA antisentido de amplificación y etiquetado ULS se han desarrollado para proporcionar un protocolo más fiable para generar una cantidad suficiente de materiales de alta calidad marcado ARNa para microarrays de hibridación 8, 16. Por lo tanto, este estudio proporciona un protocolo para demostrar algunas de las etapas importantes de la extracción de ARN para el análisis de datos de microarrays involucrado en dos colores usando Día 7 embriones bovinos como un ejemplo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La parte animal de este estudio se llevó a cabo en la Unidad de Investigación Metabólica de la Universidad de Alberta, Edmonton, Canadá, con todos los procedimientos experimentales animales aprobados (Protocolo # AUP00000131) por la Universidad de Alberta Cuidado de Animales y el empleo, y los animales atendidos de acuerdo al Consejo canadiense de manejo de estos animales (1993).
1. Embriones producción, aislamiento de ARN total y tratamiento con DNasa
- Para los protocolos experimentales animales y recogida de embriones consulte en nuestras publicaciones anteriores 17, 18.
- Piscina y congelamiento rápido embriones etapa similar de cada vaca en nitrógeno líquido y luego mantener a -80 ° C hasta la extracción de RNA.
- Extraer el ARN total a través de un kit de extracción de ARN basado en columnas, que permite extraer el ARN de muestras de pico-escala (kit de información está disponible en la lista de materiales).
NOTA: Se recomienda kit contiene: Tampón acondicionado, extracción Buffer, etanol al 70%, tampón de lavado 1, el tampón de lavado 2, tampón de elución, columnas de purificación de ARN con tubos de recogida y tubos de microcentrífuga. - Añadir 10 l tampón de extracción de embriones que contienen los tubos e incubar durante 30 minutos a 42 ° C. Tubo de centrífuga a 800 xg durante 2 min para recoger extracto de células en el tubo de microcentrífuga.
- Pipetear 250 l acondicionado Buffer sobre la membrana de filtro de la columna de purificación. Incubar la columna de purificación de ARN con acondicionado Buffer durante 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar la columna de purificación en el tubo de recogida a 16.000 xg durante 1 min.
- Pipeta de 10 l de 70% de etanol en la mezcla de tampón de extracción de ARN y embriones. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo. mezcla de la pipeta en la columna de purificación previo de adaptación.
- Para enlazar ARN, centrífuga de la columna de purificación de 2 min a 100 xg y seguir inmediatamente por una centrifugación a 16.000 xg durante 30 s para eliminar el flujo a través.
- Pipetear 10081; L de tampón de lavado 1 en la columna de purificación y centrifugar durante 1 min a 8.000 x g.
Se recomienda DNasa tratamiento si la realización de la transcripción inversa o amplificación después de aislamiento de ARN: NOTA. - Digerir el ADN genómico de la derecha después del paso 1.8.
NOTA: Se recomienda DNasa kit está disponible en la lista de materiales. Set recomendado contiene: DNasa I y solución madre de tampón. - Preparar la mezcla de incubación ADNasa mediante la mezcla de 5 l DNasa I de solución madre con 35 l de tampón. Mezclar suavemente por inversión.
- Pipetear la mezcla de incubación 40 l de DNasa directamente en la membrana de la columna de purificación. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
- Pipeta de 40 l de tampón de lavado 1 en la membrana de la columna de purificación y centrifugar a 8000 xg durante 15 s.
- Pipetear 100 l de tampón de lavado 2 a la columna de purificación y centrifugar durante 1 min a 8.000 x g.
- Pipetear otros 100 l de tampón de lavado 2 en la columna de purificación y centrifugardurante 2 minutos a 16.000 x g.
- Transferir la columna de purificación a un nuevo tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Pipetear 11 l de tampón de elución directamente sobre la membrana de la columna de purificación. Para asegurar la máxima absorción de tampón de elución en la membrana, toca suavemente la punta de la pipeta a la superficie de la membrana mientras dispensa el tampón de elución.
- Incubar la columna durante 1 min a temperatura ambiente. Centrifugar la columna durante 1 min a 1000 xg para distribuir tampón de elución en la columna, y luego girar durante 1 min a 16.000 xg para eluir el ARN.
- Utilice instrumento Bioanalyzer de acuerdo con las instrucciones del fabricante para evaluar la calidad y la cantidad 19 de ARN.
- Almacenar la muestra de ARN a -80 ° C hasta su uso.
2. La amplificación de ARN y etiquetado de los análisis de microarrays
NOTA: Para el usuario por primera vez que trabaja con procedimientos de amplificación de ARN y etiquetado, utilizar cinco ng de ARN espiga-en along con las muestras reales ARNa para supervisar la medición de control de calidad de la amplificación del ARN y la hibridación. La espiga-en la mezcla de ARN contiene diez sintetizados, polyadenylated transcripciones in vitro en relaciones predeterminadas. Cuando el procedimiento se realiza correctamente, los transcritos marcados se hibridan específicamente sólo para sondas de control complementarios en las matrices y los datos pueden ser escaneados para realizar un seguimiento de garantía de control de calidad con auto mínima o la hibridación cruzada. Más detalles sobre el procedimiento descripción de pinchos-en intensidades de control y normalización después de escanear la matriz y el análisis de datos se refiere a las publicaciones anteriores 20, 21. El siguiente procedimiento se da a los usuarios de microarrays de rutina.
- Preparar (valor de número de RNA de Integridad (RIN) al menos> 7,0) 100 pg de alta calidad de la muestra de ARN en un volumen total de 10 - 11 l.
- Amplificar las muestras de ARN con un kit de amplificación de podertrabajar con muestras de pico-escala (tan poco como 100 pg).
NOTA: Se recomienda kit de amplificación de la información está disponible en la lista de materiales y sigue las instrucciones del fabricante, sin ninguna modificación. - Utilice una cuantificación basada en fluorescencia para evaluar el perfil de la gama de tamaños de la ARNa amplificado.
- Utilizar el aparato espectrofotómetro (basado en la absorbancia a 260 y 280 nm) para medir la concentración del ARNa amplificado.
- Almacenar el ARNa amplificado a -80 ° C hasta que esté listo para el etiquetado.
- Utilizar 2 g de ARN amplificado para el marcaje fluorescente de acuerdo con ULS Arna guía de usuario del equipo de etiquetado.
NOTA: Desde Cyanine 547 y 647 de tinte de cianina son sensibles a la fotodegradación y Cyanine 647 colorante se degrada fácilmente por el ozono, el procedimiento se lleva a cabo el etiquetado en una cantidad mínima de luz y bajo un ambiente libre de ozono. - Encienda la caja de ozono (Figura 1A) hasta que el nivel de ozono es de 0.001 ppm.
- Mezclar suavemente y se incuban los tubos en un termociclador a 85 ° C durante 15 min. Colocar las muestras en hielo durante al menos 1 min. Centrifugar para recoger el contenido de los tubos antes de proceder con el kit de extracción de ARN, excepto pasos relacionados con el tratamiento de DNasa (1,9 a 1,11), para limpiar el ARN amplificado marcado con Cy-tinte.
- Utilizar el aparato espectrofotómetro para medir y determinar la concentración de ARN amplificado marcado y mantener el ARNa marcado a -80 ° C como máximo durante 3 días antes de su uso.
3. microarrays de hibridación y lavado
NOTA: Los siguientes pasos importantes se adaptan de acuerdo a protocolo de análisis de dos colores basados en microarrays de expresión de genes (versión6.5, mayo de 2010).
- Añadir la misma cantidad de 825 ng de cada Cyanine 547- 647 y Cyanine marcado con Arna y mezclar con 25x 10x fragmentación y tampones de bloqueo.
- Se calienta la mezcla a 60 ° C durante 15 minutos y dejar enfriar sobre hielo durante 1 min.
- Añadir la misma cantidad de tampón de hibridación 2x y mezclar bien.
- Centrifugar a 13.000 rpm, a continuación, la mezcla está lista para la hibridación.
- Cargar 100 l de la mezcla sobre el portaobjetos matriz y sellar la diapositiva dentro de la cámara de hibridación.
- Carga de la cámara montada en el horno de hibridación durante 17 horas a 65 ° C que gira a 10 rpm en el horno.
- Se lavan las matrices de acuerdo con el protocolo de tratamiento con la protección del ozono mediante la sumersión en la estabilización y la solución de secar durante 30 s.
- Retire las matrices de la solución y asegúrese de que la superficie de la matriz es seco, sin partículas de polvo
4. Digitalización de microarrays de diapositivas
- Mantenga las matrices en un lugar oscuro y encienda scanner hasta que está listo para usar (15 min tiempo de espera).
- Cargar el código de barras de matriz a la izquierda, en el escáner y comenzar a escanear. Hacer el análisis in situ conforme a la guía de usuario del software y guardar los datos como (GPR) formato de archivo.
5. Análisis estadístico
- Descargar el software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Haga clic en "datos en bruto de importación" y cargar los archivos gpr en FlexArray.
- Realizar la normalización y el análisis estadístico si es necesario siguiendo las instrucciones. Nota: Se calcula el umbral para la selección punto positivo en este estudio, ya que se ha descrito previamente 22.
- Seleccione el menú desplegable manual desde el visor gráfico de la FlexArray para ver todos los puntos híbridas, y las señales de fondo. Nota: Un cuadro similar de pinchos en los controles después de la hibridación de la micromatriz se puede ver en estudio previo 8.
- Seleccione unloess normalización dentro de la matriz siguiente por un cuantil entre el proceso de normalización de las matrices de la FlexArray desplegable manual de consecuencia.
- Exportar todos los datos normalizados de FlexArray en un archivo Excel para su posterior uso.
6. Análisis de Bioinformática
La anotación original de las secuencias de la sonda a partir de transcritos específicos de embrión bovino (BESTv1) microarray se ha descrito previamente 8. En este estudio, se obtuvieron 20.403 símbolos de genes únicos (GS) ( Suplemento archivo1 ) a través de la información de laboratorio Sistema de Gestión de EmbryoGENE (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Una lista de los 6.765 genes únicos ( Suplemento archivo2 fue seleccionado) y correspondió a las señales positivas después de todo proceso de normalización de microarrays (paso 50.5) de bovino Día 7 gen embriones perfil de expresión. Umbral de señal positiva se calculó basándose en la publicación permeable 16 de la intensidad de la señal de un valor A.
- Para realizar el análisis funcional con PANTHER (análisis de proteínas a través Relaciones Evolutivas) Clasificación del Sistema 23, 24, abra el siguiente enlace (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
- Sube una lista de 6.765 GS específicos del embrión para identificar los procesos biológicos específicos durante el desarrollo embrionario mediante la prueba estadística excesiva y utilizar configuración predeterminada de Bos taurus (todos los genes en la base de datos) como lista de referencia 25.
NOTA: Esto permite la identificación de los procesos relacionados con el desarrollo de la GO términos que son estadísticamente excesiva o insuficiente expresado mediante una prueba binomial. - Establecer el umbral de valor P a <0,05 como valor predeterminado del software. Los datos pueden descargarse y exposiciónrted en un archivo de Excel para su posterior selección 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un resultado representativo de ARN total y se amplificó ARNa desde el día 7 embriones bovinos se muestra en la Figura 3 y resume en la Tabla 1.
integridad y el perfil de ARN pueden ser evaluados después de la extracción de RNA. Evaluación de la calidad del ARN podría hacerse mediante documento Bioanalyzer (Figura 3A) y sólo las muestras con valor superior a 7,0 RIN está calificado para ser utilizado para la amplificación (Tabla 1).
La calidad y la cantidad de ARN amplificado deben ser evaluados después de la amplificación. La similitud del perfil de ARN amplificado y el rango de tamaño adecuado son los principales factores para el control de calidad (Figura 3B). Después de la amplificación en la segunda ronda, los fragmentos de ARN amplificados son muy similares en tamaño, que oscila entre 200 y 800 pb (Figura 3B) ytodos los ARNa de rango similar tamaño se seleccionan para su posterior etiquetado de fluorescencia. También, una amplificación exitosa del RNA total original producir al menos más de un millar de veces de incremento de ARNa (Tabla 1).
eficiencia de marcaje de fluorescencia se puede calcular de acuerdo con el grado de relación de etiquetado. La fórmula está disponible en la guía de usuario del equipo de etiquetado ULS Arna. La guía del usuario indica el grado de relación de etiquetado debe ser de 1,0 - 3,6%, lo que indica que un promedio de 1 - 3,6 moléculas por cada 100 nucleótidos de la ULS.
Los archivos de imagen después de la hibridación y la digitalización se pueden ver desde FlexArray. Una imagen escaneada de buena calidad después de la hibridación de microarrays y de lavado se muestra en la Figura 4A. Si los materiales marcados son inferiores o superiores a este rango, las señales serán demasiado baja para detectar o serán detectado altos niveles de fondo después de scanning (Figura 4B).
En el estudio actual, el umbral de señal positiva se fijó en 7,6 (señal de la sonda superior a 7,6 o de fondo <7.6 considera positiva). Aproximadamente el 46% de la sonda fija en representación de 20826 puntos positivos se indican en color rojo en el Día 7 embriones de bovino (Figura 5). Después de retirar los símbolos de genes no anotada y duplicado, sólo 6.765 símbolos de genes únicos se deja para el análisis PANTHER.
Estos 6.765 genes representan las transcripciones de ARN únicas expresadas en el blastocisto bovina Día 7. Con el fin de encontrar el proceso biológico específico a blastocisto bovina, PANTHER Sobrerrepresentación de prueba se lleva a cabo. Los ID plazo top 10 de ontología de genes (GO) con el índice más alto de enriquecimiento veces se ha seleccionado (Figura 6). En general, estos términos GO específicos representan en gran medida el proceso de división celular activa, tal como mitosis y la segregación cromosómica, la regulación del ciclo celular y la iniciación de la traducción citoplásmica y mitocondrial.
Figura 1: El ozono-libre de la caja (A) y matriz de reacción de marcaje (B). A) El ozono libre de la caja consta de una unidad de convertidor catalítico que recicla el aire y destruye la capa de ozono y un sensor de ozono altamente sensible para controlar el nivel de ozono dentro de la caja durante la ejecución de microarrays. B) Procedimiento de etiquetado y la gama de hibridación realizan dentro de la caja para evitar la degradación fluorescente Cyanine 647 tinte por el ozono. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de genes PANTHER lista. Las flechas rojas indican el área necesita ser llenado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un representante Bioanalyzer electroferograma de ARN total (A) y el gel de Image Amplified RNA (B). A) Mostrando resultado global con un valor de RIN, la concentración de ARN y la relación de ARNr. B) El perfil del ARN amplificado después de la amplificación de dos vueltas. Se espera que los fragmentos de ARN amplificados para estar en un rango entre 200 y 800 pb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen de la matriz de Intensidad mapa. Una buena imagen de una diapositiva de matriz que muestra el canal verde y rojo corresponden a cianina 547 y Cyanine 647 señales después de escanearlos con alta intensidad de punto (indicado a la izquierda con el color verde azul) y un fondo bajo (A) (indicado a la derecha con azul oscuro color). Una mala imagen de una diapositiva de serie de imágenes muy alto fondo del canal rojo que muestra (B) (indicada en el panel superior con el color verde azul similar a partir de la imagen de 647 Cyanine intensidad in situ). carta de colores indica la intensidad de la señal con valores numéricos correspondientes a diferentes colores. El valor de la intensidad de la señal es el más bajo de la gama de color azul oscuro. Haga clic aquí para ver una granr Versión de esta figura.
Figura 5: Parcela MA para el día 7 de Embriones Bovinos perfil de expresión de genes. 20.826 puntos rojos representan señales positivas por encima de las señales de fondo. manchas de fondo se resaltan en color negro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Los ID Plazo Top 10 de ontología de genes (GO) con mayor Índice de Enriquecimiento Fold. Estos GO términos específicos representan en gran medida el proceso de división celular activo, tal como la mitosis y la segregación de cromosomas, la regulación del ciclo celular y la iniciación de citoplásmica y mitocondrial transmento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestra | Número de embrión | Tipo | Calidad morfológica de embriones | La concentración de ARN (pg / l) | RIN | ARN total utilizado para la amplificación (pg) | La concentración de ARN amplificado (ng / l) | ||||||||
| S1 | 4 | blastocisto | Grado 1 y 2 | 101 | 8.6 | 858,5 | 3498.4 | ||||||||
| S2 | 1 | blastocisto | Grado 2 | 142 | 7.4 | 1207 | 1682.4 | S3 | 2 | blastocisto | Grado 1 | 135 | 8.8 | 1147.5 | 3185.3 |
| S4 | 3 | blastocisto | Grado 1 | 177 | 9 | 1504.5 | 2906.4 | ||||||||
| S5 | 5 | blastocisto | Grado 1 | 636 | 8.3 | 5406 | 3437.5 | ||||||||
| S6 | 3 | blastocisto | Grado 1 y 2 | 159 | 9.1 | 1351.5 | 1689.8 | ||||||||
| S7 | 3 | blastocisto | Grado 1 | 154 | 9 | 1309 | 4507.1 | ||||||||
| S8 | 4 | blastocisto | Grado 1 | 304 | 8.5 | 2584 | 3089.3 | ||||||||
| S9 | 5 | blastocisto | Grado 1 | 282 | 9.1 | 2397 | 3917.8 | ||||||||
| S10 | 6 | blastocisto | Grado 1 y 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | blastocisto | Grado 1 | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | blastocisto | Grado 1 | 206 | 9 | 1751 | 2567.9 |
Tabla 1: Muestra la información y ARN. La concentración y la calidad del ARN deben ser evaluados después de la extracción. La integridad del ARN y la concentración pueden ser evaluados por cualquier Bioanalyzer. número integridad del ARN debe ser más de 7,0. La concentración de ARN debe ser examinado por instrumento espectrofotómetro después de la amplificación. EmbrySe evaluó la calidad o de acuerdo con el Manual de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (3ª ed., Savoy, IL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El primer problema para llevar a cabo el análisis de microarrays utilizando Día 7 embriones bovinos no está recibiendo cantidades suficientes de ARN de alta calidad para el estudio de la expresión génica. Tradicional fenol / cloroformo extracción de RNA y método de precipitación con etanol, no se recomienda para el día 7 embriones, lo que resulta en un bajo rendimiento y la posible inhibición de fenol restos de reacción de amplificación de ARN. En lugar de ello, un método basado en la columna estándar es mejor para aislar el ARN total y después eluir el ARN con tampón de elución mínima para aumentar la concentración. Un promedio de 780 pg de ARN total por embrión se obtiene en el estudio actual, que es comparable con otros informes utilizando una metodología idéntica 26 y el kit de extracción de ARN misma 27, 28 se utilizan actualmente. Para la extracción de ARN, se recomienda disolver precipitado antes de su uso mezclando a fondo o calentar el vial de tampón de extracción para volver a disolver el tampón de extracción antesusar. Por otra parte, el tiempo de incubación es también importante para el rendimiento de RNA en el paso de extracción. El tiempo de incubación a menos de 30 min completa a 42 ° C redujo el rendimiento de ARN.
En la columna digestión DNasa es necesario para eliminar la contaminación de ADN genómico durante la purificación de ARN total. La enzima DNasa es muy sensible a vórtice y se centrifuga. Por lo tanto, DNasa y tampón se deben mezclar suavemente por inversión.
La calidad del ARN es muy importante en el análisis de microarrays y muestras con un RIN inferior a 7 no deben ser considerados para la hibridación. En el estudio actual, los perfiles de ARN totales obtenidos por el Bioanalyzer son similares a los observados previamente en estudios de blastocistos bovinos 26, 27. Vale la pena hacer notar que cuando el uso de embriones pre-eclosionados, especialmente el ARN preparado a partir de oocitos y embriones antes de la materna a la transición embrionario, el valor RIN es a menudo inferior a 7 en comparaciónpara el RNA total a partir del día 7 embriones y esto es debido a una variación en la relación 28S / 18S rRNA 27.
La cantidad de ARN extraído de embriones bovinos no es suficiente para la hibridación de la plataforma, por lo tanto, se requiere la amplificación del ARN. Hay varios métodos disponibles para la amplificación de ARN tales como la PCR, la transcripción in vitro (IVT), y Ribo-SPIA (amplificación isotérmica único cebador). Aunque este último método es más rápido y en un solo día proporciona material suficiente para las matrices, se requiere al menos 5 ng como material de partida 29. Por lo tanto, se optó por el método IVT que es capaz de trabajar con materiales de partida bajos 12 (tan poco como 100 pg). Por otra parte, ya se ha probado para amplificar ARN total extraído de embriones bovinos con éxito 29. En el estudio actual, nuestro método de amplificación produjo ~ 28 g ARN amplificado por embrión a partir de ARN total 598 pg por embrión. additiofinalmente, después de la amplificación de dos vueltas, nuestras muestras mostraron un perfil similar y rango de tamaño apropiado (entre 200 y 800 pb), que están de acuerdo con estudios previos 13, 15.
En este protocolo, se utilizó una cianina platino ligado protocolo de marcaje no enzimática, (Cyanine 547 y Cyanine 647) colorantes. Este método permite el etiquetado de ARN amplificado o no amplificado. Tener etapa de amplificación antes del marcaje permite el uso de nucleótidos naturales, lo que lleva a mayores rendimientos de ARN amplificados, reducir el sesgo y generar fragmentos más largos en comparación con el método enzimático. Los Cyanine 547 y 647 Cyanine colorantes son comunes tintes fluorescentes recomiendan para la matriz de dos colores. Sin embargo, Cyanine 647 colorante es sensible a la degradación de ozono. monitor de ozono de mano se debe utilizar para asegurarse de que el nivel de ozono por debajo de 2 ppb. Además, el medio ambiente libre de polvo es necesaria para evitar las partículas de polvo que cae en solución de hibridación o during escaneo.
experimento de microarrays se puede diseñar de enfoque de una o dos color. Cada enfoque experimental tiene algunas ventajas y desventajas. El uso de diseños de dos colores reduce el ruido de fondo y la variabilidad, permite la comparación directa y para el bucle diseños con la definición de una muestra de referencia común. A pesar de los sesgos en colorantes específicos pueden afectar sustancialmente a los resultados cuando los experimentos se realizaron con diseños de dos colores, estos sesgos pueden ser mitigados mediante la realización de canjes de tinte. Dicha técnica de replicación se suma a los costos experimentales, pero puede mejorar la precisión y la sensibilidad en la medición de la expresión diferencial 31.
Compare con otros software de bioinformática (como gorilla) PANTHER permite la comparación con el conjunto de datos del genoma Bos taurus como referencia. Nuestros resultados indican que durante el Día 7 bovina desarrollo embrionario los siguientes componentes biológicos y funciones están involucrados: regulación de la metafase / anaptransición hase del ciclo celular, la regulación de la transición mitótico en metafase / anafase, la regulación de la segregación cromosómica, traducción mitocondrial, la proteína ubiquitinación K48-vinculada, ER al Golgi transporte de vesículas mediada, proceso catabólico ARNm nuclear transcrito, iniciación de la traducción, la hermana mitótico cromátida la segregación , la división del núcleo mitótico.
Los protocolos presentados en este documento, desde el marcaje fluorescente de la amplificación de ARN para la exploración de las matrices deben ser ejecutados con la conciencia adicional de los factores ambientales anteriores para mantener datos de alta calidad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M.
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf (2016).
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
