Introduction
Tidlig embryonale tab i høje-producerende malkekøer er en af de største udfordringer i mejeriindustrien 1, 2. Bovin er blevet en interessant model til at studere human preimplantation embryo udvikling på grund af deres lignende udviklingsproces 3, 4. Men der kræves mere forskning for at få en bedre forståelse om gener involveret i kvæg tidlig fosterudvikling.
Efter tyve år siden den første microarray teknologi udviklet i 1995 5, udvikling af mere sofistikerede sonde fabrikation teknologi reducerede trykfejl og variabilitet-chips inden for og mellem forskellige microarray platforme 6. Forbedret microarray teknologi resulterede i en udbredt anvendelse af denne teknologi i klinisk forskning 7 og senest i begyndelsen af embryo qVALITET vurdering 8.
Den store mængde af nødvendige materiale til microarray teknologi er den vigtigste grund til, at microarray teknologi oprindeligt undladt at indtaste en række forskningsfelter såsom tidlige fosterudvikling. For nylig er RNA amplifikationsmetoder blevet forbedret til lineært amplificere RNA op til mikrogram niveau fra sub-nanogram udgangsmateriale RNA materiale 9. Der er flere kommercielle RNA forstærkning kits til rådighed på markedet; imidlertid er mere populære veludviklede kits relateret til Ribo-Single Primer Isoterm Amplification 10 og T7 promoter drevet 11 metoder. Den mest populære antisense-RNA-amplifikation anvender in vitro transkription med en oligo dT primer linker til en T7-promotor ved 5'-enden 12. Denne teknologi gør det muligt at opretholde den mest repræsentative anti-sense udskrifter efter lineær forstærkning feller arrays hybridisering 13. Denne metode er blevet indrettet til at forstærke picogram niveau af totalt RNA ekstraheret fra bovin embryo 8.
Universal Linkage System (ULS) er mærkningen metode, som direkte inkorporerer DNA eller forstærkede RNA med platin-linked fluorescerende farvestof enten Cyanin 547 eller Cyanin 647, ved at danne en koordinerende obligation på N7-positionen i guanin 14. Denne fremgangsmåde blev tilpasset med embryoner forskning for at generere mere stabilt amplificeret aRNA uden ændringer i forhold til aminoallyl modificeret aRNA genereret ved enzymatisk metode 15. Både enkelt farvestof og to farvestoffer mærkning metoder er blevet tilpasset ved hjælp af Universal Linkage System i microarray. En stor microarray sammenligninger undersøgelsen var, at der er en god korrelation af datakvaliteten mellem en- og to-farvet array-platforme 6.
For nylig, både T7-promotor-drevetn antisense RNA amplifikation og ULS mærkning metoder er blevet udviklet til at give en mere pålidelig protokol til at generere en tilstrækkelig mængde af høj kvalitet mærket Arna materialer til microarray hybridisering 8, 16. Derfor er denne undersøgelse giver en protokol til at demonstrere nogle af de vigtige skridt fra RNA ekstraktion til dataanalyse involveret i tofarvede microarray hjælp Dag 7 bovine embryoner som eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyret del af denne undersøgelse blev udført på det metaboliske Forskningsenheden for University of Alberta, Edmonton, Canada, med alle animalske eksperimentelle procedurer godkendt (Protokol # AUP00000131) ved University of Alberta Animal Care og brug Udvalg, og dyr passet efter til den canadiske Råd Animal Care retningslinjer (1993).
1. Embryo Produktion, Isolering af Total RNA og DNase Behandling
- For dyr eksperimentelle protokoller og embryonindsamlingsteam refererer i vores tidligere udgivelser 17, 18.
- Pool og snap fryse lignende embryoner etape fra hver ko i flydende nitrogen og derefter holde ved -80 ° C indtil RNA ekstraktion.
- Uddrag total RNA via en kolonne-baserede RNA ekstraktion kit, som gør det muligt at udtrække RNA fra pico-skala prøver (kit oplysninger i Material List).
BEMÆRK: Anbefalet kit indeholder: Conditioning Buffer, Extraction Buffer, 70% Ethanol, vaskebuffer 1, vaskebuffer 2, elueringspuffer, RNA rensning kolonner med indsamling rør og mikrocentrifugerør. - Tilsæt 10 pi Extraction Buffer til rør indeholdende embryoner og inkuberes i 30 minutter ved 42 ° C. Centrifugerør ved 800 x g i 2 min for at opsamle celleekstrakt i mikrocentrifugerør.
- Pipettere 250 pi Conditioning Buffer onto oprensningssøjle filtermembranen. Inkubér RNA oprensning søjlen med Conditioning Buffer i 5 minutter ved stuetemperatur. Centrifugeres oprensningen kolonne i opsamlingsrøret ved 16.000 x g i 1 min.
- Afpipetteres 10 pi af 70% ethanol i blandingen af RNA Extraction Buffer og embryoner. Bland godt ved pipettering op og ned. Pipette blandingen i prækonditioneret oprensningssøjle.
- At binde RNA, centrifuge oprensningen kolonnen i 2 minutter ved 100 xg og umiddelbart følge af en centrifugering ved 16.000 xg i 30 s for at fjerne strømmen gennem.
- Tilsæt 10081; L vaskebuffer 1 ind i oprensningskolonne og centrifugeres i 1 min ved 8000 x g.
BEMÆRK: DNase-behandling anbefales, hvis udførelse revers transkription eller amplifikation efter RNA-isolering. - Fordøje genomisk DNA lige efter trin 1.8.
BEMÆRK: Anbefalet DNase kit er tilgængelig i Material List. Anbefalet kit indeholder: DNase I stamopløsning og buffer. - Forbered inkubationsblandingen DNase ved at blande 5 uL DNase I stamopløsning med 35 uL Buffer. Bland ved forsigtigt at vende.
- Pipettere det pi DNase inkubationsblandingen 40 direkte ind i oprensningssøjle membran. Der inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Pipetten 40 pi vaskebuffer 1 ind i oprensningskolonne membran og centrifugeres ved 8000 xg i 15 s.
- Tilsæt 100 pi vaskebuffer 2 ind i oprensningskolonne og centrifugeres i 1 min ved 8000 x g.
- Pipettere yderligere 100 pi vaskebuffer 2 ind i oprensningssøjle og centrifugeri 2 minutter ved 16.000 x g.
- Overfør oprensningen kolonne til en ny 0,5 ml mikrocentrifugerør. Pipetter 11 pi elueringspuffer direkte på membranen af oprensningen kolonnen. For at sikre maksimal absorption elueringsbuffer i membranen, blidt røre spidsen af pipetten til overfladen af membranen, mens dispensering elueringspufferen.
- Inkubér søjlen i 1 min ved stuetemperatur. Centrifugeres søjlen i 1 min ved 1.000 xg til at distribuere elueringspuffer i kolonnen, og derefter spinde i 1 min ved 16.000 xg til eluering RNA.
- Brug Bioanalyzer instrument ifølge producentens instruktioner til at vurdere RNA kvalitet og kvantitet 19.
- Opbevar RNA-prøven ved -80 ° C indtil anvendelse.
2. RNA Amplification og mærkning for microarray analyse
BEMÆRK: For første gang brugeren arbejder med RNA forstærkning og mærkning, bruge fem ng spike-i RNA along med den faktiske Arna prøver at overvåge kvaliteten kontrolmåling af RNA forstærkning og hybridisering. Piggen-i RNA mix indeholder ti in vitro syntetiserede, polyadenylerede transkripter i forudbestemte forhold. Når fremgangsmåden udføres korrekt, de mærkede transkripter specifikt hybridiserer kun til komplementære kontrol prober i arrays og dataene kan scannes til at spore kvalitetskontrol vished med minimal selv- eller krydshybridisering. Flere detaljer beskrivelse vedrørende den spidse-in kontrol intensiteter og normaliseringsproceduren efter scanning af array og dataanalyse er refererer til tidligere udgivelser 20, 21. Følgende procedure er givet til de rutinemæssige microarray brugere.
- Forbered 100 pg høj kvalitet RNA-prøven (RNA Integrity nummer (RIN) værdi mindst> 7,0) i et totalt volumen på 10 - 11 uL.
- Opformere RNA-prøver med en forstærkning kit er i stand tilarbejde med pico målestok prøver (så lidt som 100 pg).
BEMÆRK: Anbefalet forstærkning kit oplysninger findes i Material List og følger producentens anvisninger uden ændringer. - Brug en fluorescens-baseret mængdebestemmelse at evaluere profil størrelsesområdet af det amplificerede aRNA.
- Brug spektrofotometer instrument (baseret på absorbans ved 260 og 280 nm) til måling af koncentrationen af det amplificerede aRNA.
- Opbevar forstærkede aRNA ved -80 ° C indtil den er klar til mærkning.
- Brug 2 ug forstærket RNA for fluorescerende mærkning i henhold til ULS aRNA etikettering kit brugervejledning.
BEMÆRK: Da Cyanin 547 og Cyanin 647 farvestof er følsomme over for fotonedbrydning og Cyanin 647 farvestof let nedbrydes af ozon, mærkningsproceduren finder sted i en minimal mængde af lys og under en ozon-frit miljø. - Tænd for ozon (Figur 1A), indtil niveauet af ozon er 0,001 ppm.
- Bland forsigtigt og inkuberes rørene i en thermocycler ved 85 ° C i 15 min. Anbring prøverne på is i mindst 1 min. Spin ned for at indsamle indhold af rør inden der fortsættes med RNA-ekstraktion kit, undtagen trin i forbindelse med DNase-behandling (fra 1.9 til 1.11), at rydde op i Cy-farvestof-mærket amplificeret RNA.
- Brug spektrofotometer instrument til at måle og bestemme koncentrationen af mærket amplificeret RNA og holde den mærkede aRNA ved -80 ° C maksimum i 3 dage før anvendelse.
3. Microarray hybridisering og vask
BEMÆRK: Følgende vigtige skridt er tilpasset efter To farver Microarray-baserede Gene Expression Analysis Protocol (version6.5, maj 2010).
- Tilføj tilsvarende mængde 825 ng fra hver Cyanin 547- og Cyanin 647-mærket aRNA og blandes med 25x fragmentering og 10x blokerer buffere.
- Opvarm blandingen ved 60 ° C i 15 minutter og afkøles på is i 1 min.
- Tilføj lige så stor mængde 2x hybridiseringspuffer og bland godt.
- Centrifugeres ved 13.000 rpm, hvorefter blandingen er klar til hybridisering.
- Indlæse 100 pi fra blandingen på array dias og forsegle glide inden hybridiseringskammeret.
- Indlæse den samlede kammeret ind hybridiseringen ovn i 17 timer ved 65 ° C roterer med 10 omdrejninger i ovnen.
- Vask arrays ifølge protokol med beskyttelse ozon behandling ved at dyppe i stabilisering og tørring løsning i 30 s.
- Fjern arrays fra opløsningen, og sørg array overfladen er tør uden støvpartikler
4. Scanning Microarray Slide
- Hold arrays i mørkt sted, og tænd scannis, indtil det er klar til brug (15 min ventetid).
- Læg array stregkode på venstre, ind i scanneren og starte scanning. Gør stedet analyse i henhold til den software brugervejledningen og gemme dataene som (GPR) filformat.
5. Statistisk analyse
- Download FlexArray software http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Klik på "import rå data" og indlæse GPR filer i FlexArray.
- Udfør normalisering og statistisk analyse om nødvendigt ved at følge instruktionen. Bemærk: Beregn tærsklen for positiv plet selektion i denne undersøgelse, som det blev beskrevet tidligere 22.
- Vælg drop down manual fra plottet seeren af FlexArray at se alle de hybridiserede pletter og baggrund signaler. Bemærk: Et lignende billede af spiket i kontrollen efter hybridisering til microarray kan ses i tidligere undersøgelse 8.
- Vælg enLøss normalisering inden opstilling efter med en fraktil mellem arrays normalisering processen fra FlexArray drop down manual i overensstemmelse hermed.
- Eksporter alle de normaliserede data fra FlexArray i en Excel-fil til videre brug.
6. Bioinformatik Analyse
Den oprindelige annotation af sonden sekvenser fra kvæg embryo-specifikke Udskrifter (BESTv1) microarray tidligere er blevet 8 beskrevet. I nærværende undersøgelse blev 20,403 unikke Gene Symboler (GS) opnået ( Supplement file1 ) gennem EmbryoGENE Laboratory Information Management System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). En liste over 6.765 unikke gener ( Supplement FIL2 ) blev udvalgt og svarede til alle positive signaler efter microarray normalisering proces (trin 5.5) Fra bovin Dag 7 embryoner genekspressionsprofil. Tærskel positivt signal blev beregnet på grundlag gennemtrængelige publikation 16 fra signalintensiteten af en A-værdi.
- For at udføre funktionel analyse med PANTHER (proteinanalyse gennem Evolutionary Relationships) Classification System 23, 24, åbne følgende link (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
- Upload en liste over 6.765 embryo-specifikke GS til at identificere specifikke biologiske proces under fosterudviklingen ved hjælp af statistisk overrepræsentation test og bruge standardindstillingen Bos taurus (alle gener i databasen) som referenceliste 25.
BEMÆRK: Dette giver mulighed for identifikation af udviklingsmæssige-relaterede processer fra GO vilkår, der er statistisk over- eller under-udtrykt ved hjælp af en binomialtest. - Indstil tærskel P-værdi på <0,05 som software standard. Data kan downloades og exported i Excel-fil til yderligere udvælgelse 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt resultat af total RNA og amplificeret aRNA fra dag 7 bovine embryoner er vist i figur 3 og opsummeret i tabel 1.
RNA integritet og profil kan vurderes efter RNA ekstraktion. Kvalitetsvurdering af RNA kunne ske ved Bioanalyzer instrument (figur 3A) og kun de prøver med RIN værdi højere end 7,0 er kvalificeret til at blive anvendt til amplifikation (tabel 1).
Kvaliteten og kvantiteten af forstærket RNA bør evalueres efter forstærkning. Ligheden af amplificeret RNA profil og passende størrelsesområde er de vigtigste faktorer for kvalitetskontrol (figur 3B). Efter to runder amplifikation, de amplificerede RNA-fragmenter er meget ens i størrelse, i området mellem 200 og 800 bp (figur 3B) ogalle Arnas af lignende størrelsesorden udvælges til yderligere fluorescens mærkning. Desuden vil en vellykket amplifikation af de oprindelige samlede RNA give mindst mere end tusinde gange forøgelse af aRNA (tabel 1).
Fluorescens mærkning effektivitet kan beregnes i henhold til graden af forholdet mærkning. Formlen er tilgængelig i ULS aRNA etikettering kit brugervejledning. Brugervejledningen antyder graden af forholdet mærkning bør 1,0 - 3,6%, hvilket indikerer, at et gennemsnit på 1 - 3,6 ULS molekyler pr 100 nukleotider.
Billedfilerne efter hybridisering og scanning kan ses fra FlexArray. En god kvalitet scannede billede efter microarray hybridisering og vask er vist i figur 4A. Hvis mærkede materialer er lavere eller højere end dette interval, vil signalerne være for lav til at opdage eller høje baggrundsniveauer vil blive opdaget efter scanning (figur 4B).
I aktuelle undersøgelse blev tærskel positivt signal sat til 7,6 (sonde signal højere end 7,6 eller baggrund <7,6 betragtes som positivt). Ca. 46% af probe sæt repræsenterer 20826 positive pletter er angivet i rød farve hos kvæg Dag 7 embryoner (figur 5). Efter fjernelse-kommenteret og to eksemplarer gen symboler, er kun 6765 unikke gen symboler tilbage til PANTHER analyse.
Disse 6.765 gener repræsenterer de unikke RNA-transkripter udtrykt i Dag 7 bovine blastocyst. For at finde den biologiske proces er specifik for bovine blastocyst, er PANTHER overrepræsentation Test udført. De øverste 10 Gene ontologi (GO) sigt id'er med den højeste fold berigelse indeks er valgt (figur 6). Generelt er disse specifikke GO vilkår i vid udstrækning repræsenterer den aktive celledeling proces som mitosis og kromosom segregering, regulering af cellecyklus og initiering af cytoplasmatisk og mitokondrie oversættelse.
Figur 1: Ozon-fri Box (A) og Array Labeling Reaction (B). A) Ozon Free Box består af en katalytisk konverterenhed, som genbruger luften og ødelægger ozon og en meget følsom ozonsensoren at overvåge ozon niveau inde i kassen under microarray ydeevne. B) Mærkning procedure og array hybridisering udføre inde i boksen for at undgå fluorescerende Cyanin 647 farvestof nedbrydning af ozon. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: PANTHER Gene List Analysis. Røde pile angiver det område, der skal besættes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: En repræsentant Bioanalyzer elektroferogram af Total RNA (A) og Gel Billede af amplificeret RNA (B). A) Viser samlede resultat med RIN værdi, RNA koncentration og rRNA-forhold. B) Det Profil af amplificeret RNA efter to-round forstærkning. Amplificerede RNA-fragmenter forventes at ligge i et område mellem 200 og 800 bp. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Billede af Array Intensitet Kort. (A) En god billede af et array dias viser grøn og rød kanal svarer til Cyanin 547 og Cyanin 647 signaler efter scanning med høj stedet intensitet (angivet til venstre med blå grøn farve) og lav baggrund (angivet til højre med mørkeblå farve). (B) En dårlig billede af et array slide viser meget høj baggrundsbillede fra røde kanal (angivet fra det øverste panel med tilsvarende grøn farve fra billedet af Cyanin 647 spot intensitet). Farvekort angiver intensiteten af signalet med numeriske værdier svarende til forskellige farver. Værdien af signalintensiteten er den laveste i området fra mørkeblå farve. Klik her for at se et stortr version af dette tal.
Figur 5: MA Grund til Dag 7 Bovin Embryo Gene Expression Profile. 20,826 røde pletter repræsenterede positive signaler over baggrundssignaler. Baggrund pletter er fremhævet med sort farve. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Top 10 Gene ontologi (GO) Term-id'er med højeste Fold Enrichment Index. Disse specifikke GO vilkår i høj grad repræsenterer den aktive celledeling proces som mitose og kromosom segregering, regulering af cellecyklus og initiering af cytoplasmatisk og mitokondrie transning. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Prøve | Antal embryo | Type | Embryo morfologiske kvalitet | RNA-koncentrationen (pg / pl) | RIN | Brugt total RNA til amplifikation (s) | Amplificeret RNA-koncentrationen (ng / uL) | ||||||||
| S1 | 4 | blastocyst | Grade 1 & 2 | 101 | 8.6 | 858,5 | 3498,4 | ||||||||
| S2 | 1 | blastocyst | Grade 2 | 142 | 7.4 | 1207 | 1682,4 | S3 | 2 | blastocyst | Grade 1 | 135 | 8.8 | 1147,5 | 3185,3 |
| S4 | 3 | blastocyst | Grade 1 | 177 | 9 | 1504,5 | 2906,4 | ||||||||
| S5 | 5 | blastocyst | Grade 1 | 636 | 8.3 | 5406 | 3437,5 | ||||||||
| S6 | 3 | blastocyst | Grade 1 & 2 | 159 | 9.1 | 1351,5 | 1689,8 | ||||||||
| S7 | 3 | blastocyst | Grade 1 | 154 | 9 | 1309 | 4507,1 | ||||||||
| S8 | 4 | blastocyst | Grade 1 | 304 | 8.5 | 2584 | 3089,3 | ||||||||
| S9 | 5 | blastocyst | Grade 1 | 282 | 9.1 | 2397 | 3917,8 | ||||||||
| S10 | 6 | blastocyst | Grade 1 & 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | blastocyst | Grade 1 | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | blastocyst | Grade 1 | 206 | 9 | 1751 | 2567,9 |
Tabel 1: Sample og RNA information. Koncentrationen og kvaliteten af RNA bør evalueres efter ekstraktion. RNA integritet og koncentration kan vurderes ved enhver Bioanalyzer. RNA integritet nummer bør være mere end 7,0. RNA-koncentrationen bør undersøges af spektrofotometer instrument efter forstærkning. Embryo kvalitet blev evalueret i overensstemmelse med Manual of International Embryo Transfer Society (3. udg., Savoy, IL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det første problem at udføre microarray analyse ved hjælp Dag 7 bovine embryoner er ikke at få tilstrækkelige mængder af høj kvalitet RNA til at studere genekspression. Traditionelle phenol / chloroform RNA ekstraktion og ethanolfældning metode anbefales ikke til dag 7 embryoner, hvilket resulterer i lavt udbytte og mulige sidesten phenol hæmme RNA amplifikationsreaktion. I stedet en standard kolonne-baserede metode er bedre at isolere total RNA og derefter eluere RNA'et med minimum elueringsbuffer at forøge koncentrationen. Et gennemsnit på 780 pg totalt RNA pr embryo opnås i aktuelle undersøgelse, der er sammenlignelig med andre rapporter under anvendelse af en identisk metode 26 og den samme RNA-ekstraktion kit 27, 28 anvendes i øjeblikket. Til RNA-ekstraktion, anbefales det at opløse præcipitatet før anvendelse ved blanding grundigt eller varme udvinding bufferhætteglasset at genopløse udvinding buffer førat bruge. Endvidere inkubationstid er også vigtigt for RNA udbytte i ekstraktionstrin. Inkubationstid mindre end en fuld 30 min ved 42 ° C reducerede RNA udbytte.
På søjle er nødvendigt DNase-fordøjelse for at fjerne genomisk DNA forurening under total RNA oprensning. DNase enzymet er meget følsom over for vortex og centrifuger. Derfor bør DNase og buffer blandes ved forsigtigt at vende.
Kvaliteten af RNA er meget vigtig i microarray analyse og prøver med en RIN lavere end 7 ikke bør overvejes til hybridisering. I aktuelle undersøgelse, det totale RNA profiler opnået ved Bioanalyzer svarer til de tidligere er observeret i undersøgelser fra bovine blastocyster 26, 27. Det er værd at bemærkes, at når der anvendes for-skraverede embryoer, især RNA fremstillet fra oocyter og embryoer før den maternelle til embryonale overgang, RIN-værdi er ofte lavere end 7 sammenlignettil det totale RNA fra dag 7 embryoner og dette skyldes en variation i 28S / 18S rRNA-forhold 27.
Mængden af ekstraheret RNA fra kvægembryoner ikke er tilstrækkelig til platform hybridisering dermed er RNA forstærkning påkrævet. Der er flere metoder til rådighed for RNA-amplifikation, såsom PCR, in vitro transkription (IVT), og Ribo-SPIA (enkelt primer isotermisk amplifikation). Skønt sidstnævnte metode er hurtigere og på én dag giver tilstrækkeligt materiale til arrays, det kræves mindst 5 ng som udgangsmateriale 29. Derfor valgte vi IVT metode, som er i stand til at arbejde med lave udgangsmaterialer 12 (så lidt som 100 pg). Endvidere er det allerede blevet testet for at amplificere totalt RNA ekstraheret fra bovin embryo held 29. I aktuelle undersøgelse, vores amplifikationsmetode produceret ~ 28 ug amplificeret RNA pr embryo fra 598 pg totalt RNA pr embryo. Additioendeligt, efter at to-round forstærkning, viste vores prøver en lignende profil og passende størrelse (mellem 200 og 800 bp), som er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser 13, 15.
I denne protokol, brugte vi en ikke-enzymatisk mærkning protokol, platin-linked cyanin (Cyanin 547 og Cyanin 647) farvestoffer. Denne fremgangsmåde tillader mærkning af amplificeret eller ikke-amplificeret RNA. Under forstærkning skridt forud for mærkning tillader ved hjælp af naturlige nukleotider, hvilket fører til højere udbytter forstærkede RNA, reducere fordomme og generere længere fragmenter i forhold til enzymatisk metode. Cyanin 547 og Cyanin 647 farvestoffer er fælles fluorescerende farvestoffer anbefale til tofarvet array. Imidlertid Cyanin 647 farvestof er følsom over for ozon nedbrydning. Håndholdt ozon monitor skal bruges til at sikre niveauet af ozon under 2 ppb. Desuden støvfrit miljø er nødvendigt at undgå støvpartikler falde i hybridiseringsopløsning eller during scanning.
Microarray eksperiment kan udformes i en- eller to-farvet tilgang. Hvert eksperimentelle fremgangsmåde har nogle fordele og ulemper. Brug tofarvede design reducerer variabilitet og baggrundsstøj, giver mulighed for direkte sammenligning og for-løkke designs med at definere en fælles reference prøve. Selvom farvestof-specifikke fordomme væsentligt kan påvirke resultaterne, når der udføres forsøg med to-farve design, kan disse fordomme afbødes ved at udføre farvestof swaps. En sådan teknisk replikation øger eksperimentelle omkostninger, men kan forbedre både nøjagtighed og følsomhed i måling differential udtryk 31.
Sammenlign med andre bioinformatik software (såsom gorilla) PANTHER tillader sammenligning af datasæt med Bos taurus genom som reference. Vores resultater viser, at i løbet af Dag 7 bovine embryonale udvikling følgende biologiske komponenter og funktioner er involveret: regulering af metafase / ANAPhase overgang cellecyklus, regulering af mitotisk metafase / anafase overgang, regulering af kromosom adskillelse, mitokondrie oversættelse, protein K48-linked ubiquitinering, ER til Golgi vesikel-medieret transport, nuklear-transskriberede mRNA kataboliske proces, translationel initiering, mitotisk søsterkromatid adskillelse , mitotiske kernedeling.
Protokollerne præsenteret i dette papir, fra fluorescerende mærkning af den forstærkede RNA til scanning af arrays skal udføres med ekstra opmærksomhed på de ovennævnte miljøfaktorer at vedligeholde data af høj kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf (2016).
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
