Introduction
Perte embryonnaire précoce chez les vaches laitières à forte production est l' un des principaux défis dans l'industrie laitière 1, 2. Bovine est devenu un modèle intéressant pour étudier le développement préimplantatoire d'embryons humains en raison de leur processus similaire de développement 3, 4. Cependant, plus de recherche est nécessaire pour avoir une meilleure compréhension des gènes impliqués dans le développement embryonnaire précoce bovine.
Après vingt ans depuis la première technologie de microréseau développé en 1995 5, le développement des plus sophistiqués technologie sonde de fabrication réduit les erreurs d'impression et de la variabilité des puces de réseau au sein et entre les différentes plates - formes de biopuces 6. La technologie des microréseaux améliorée a donné lieu à une large application de cette technologie dans la recherche clinique 7 et , plus récemment, au début de l' embryon qévaluation de la ualité 8.
La grande quantité de matériel nécessaire à la technologie des microréseaux est la principale raison pour laquelle la technologie des microréseaux d'abord échoué à entrer dans un certain nombre de domaines de recherche tels que le développement embryonnaire précoce. Plus récemment, des procédés d'amplification de l' ARN ont été améliorés pour amplifier de façon linéaire jusqu'à l' ARN microgrammes niveau de la sous-nanogramme matériau de départ d'ARN 9. Il existe plusieurs trousses d'amplification d'ARN disponibles dans le commerce sur le marché; cependant, les kits les plus populaires bien développés sont liés à Ribo-Single Primer Isotherme Amplification 10 et promoteur T7 entraînés 11 méthodes. L'amplification de l' ARN anti - sens le plus populaire utilise la transcription in vitro avec une amorce oligo dT liant à un promoteur T7 à l' extrémité 5 '12. Cette technologie permet le maintien de la plupart des transcriptions anti-sens représentatifs après amplification linéaire fou des réseaux d' hybridation 13. Cette méthode a été adaptée pour amplifier le niveau picogramme de l' ARN total extrait de bovin embryon 8.
Système d' attelage universel (ULS) est la méthode de marquage qui intègre directement l'ADN ou de l' ARN amplifié par un colorant fluorescent platine lié soit Cyanine 547 ou Cyanine 647, en formant une liaison de coordination sur la position N7 de la guanine 14. Cette méthode a été adaptée dans la recherche sur les embryons pour générer plus stable amplifié ARNa sans modification par rapport à la aminoallyl modifié ARNa généré par la méthode enzymatique 15. méthodes Les deux colorants unique et d'étiquetage des deux colorants ont été adaptés à l'aide système d'attelage universel dans microarray. Une vaste étude de comparaisons de puces à ADN était qu'il existe une bonne corrélation entre la qualité des données entre les plates - formes de réseau d' une ou deux couleurs 6.
Récemment, à la fois promoteur T7 entraînementméthodes n ARN antisens d'amplification et de marquage ULS ont été développés pour fournir un protocole plus fiable pour générer une quantité suffisante de haute qualité marqué matériaux Arna pour microarray hybridation 8, 16. Par conséquent, cette étude fournit un protocole pour démontrer certaines des étapes importantes de l'extraction de l'ARN à l'analyse des données impliquées dans deux couleurs microréseaux utilisant Jour 7 embryons de bovins, par exemple.
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Protocol
La partie animale de cette étude a été réalisée à l'Unité de recherche métabolique de l'Université de l'Alberta, Edmonton, Canada, avec tous les animaux des procédures expérimentales approuvé (Protocole # AUP00000131) de l'Université de l'Alberta Animal Care et utilisation Comité, et les animaux pris en charge selon au Conseil canadien des directives de protection des animaux (1993).
1. Embryon Production, purification d'ARN total et traitement DNase
- Pour animaux protocoles expérimentaux et collecte d'embryons se référer dans nos publications antérieures 17, 18.
- Piscine et enclenchez congeler des embryons de stade similaire de chaque vache dans de l'azote liquide, puis conserver à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'ARN.
- Extraire l' ARN total via un ARN kit d'extraction sur la base de la colonne, qui permet d'extraire l' ARN à partir d' échantillons pico-échelle (information kit est disponible dans la liste Matériel).
NOTE: Recommandé kit contient: Conditionnement tampon, Extraction Buffer, 70% d'éthanol, Wash Buffer 1, Wash Buffer 2, Elution Buffer, des colonnes de purification d'ARN avec des tubes collecteurs et des tubes de microcentrifugation. - Ajouter 10 ul Extraction Buffer à tubes contenant des embryons et incuber pendant 30 min à 42 ° C. Tube à centrifuger à 800 g pendant 2 min pour recueillir un extrait de cellules dans le tube à centrifuger.
- Introduire à la pipette 250 ul de tampon de conditionnement sur la membrane filtrante de la colonne de purification. Incuber la colonne de purification de l'ARN avec du tampon de conditionnement pendant 5 min à température ambiante. Centrifuger la colonne de purification dans le tube de prélèvement à 16 000 x g pendant 1 min.
- Pipette 10 ul de 70% d'éthanol dans le mélange d'ARN Extraction Buffer et embryons. Bien mélanger par pipetage de haut en bas. mélange Pipette dans la colonne de purification préconditionnés.
- Pour lier l'ARN, centrifuger la colonne de purification pendant 2 min à 100 xg et suivre immédiatement par une centrifugation à 16.000 xg pendant 30 s pour éliminer l'écoulement à travers.
- pipette 10081, L 1 de tampon de lavage dans la colonne d'épuration et centrifuger pendant 1 min à 8000 x g.
NOTE: DNase traitement est recommandé si effectuer la transcription inverse ou d'amplification après l'isolement de l'ARN. - Digest ADN génomique juste après l'étape 1.8.
NOTE: Recommandé kit DNase est disponible dans la liste Matériel. kit recommandé contient: DNase I solution mère et le tampon. - Préparer le mélange d'incubation de DNase en mélangeant 5 pi DNase I solution mère avec 35 pi de tampon. Mélanger en retournant doucement.
- Pipeter le mélange d'incubation 40 ul de DNase directement dans la membrane de la colonne d'épuration. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Pipette 40 pi de tampon de lavage 1 dans la membrane de la colonne de purification, puis centrifuger à 8000 xg pendant 15 s.
- Introduire à la pipette 100 ul de tampon de lavage 2 dans la colonne de purification et centrifuger pendant 1 min à 8000 x g.
- Pipeter une autre 100 ul de tampon de lavage 2 dans la colonne de purification et centrifugerpendant 2 minutes à 16 000 x g.
- Transférer la colonne de purification à un nouveau tube de 0,5 ml de microcentrifugation. Introduire à la pipette 11 ul de tampon d'élution directement sur la membrane de la colonne d'épuration. Pour assurer une absorption maximale du tampon d'élution dans la membrane, toucher doucement la pointe de la pipette à la surface de la membrane tout en distribuant le tampon d'élution.
- Incuber la colonne pendant 1 min à température ambiante. Centrifuger la colonne pendant 1 min à 1000 x g pour distribuer tampon d'élution dans la colonne, puis tourner pendant 1 min à 16 000 xg pour éluer l'ARN.
- Utilisez instrument Bioanalyseur selon les instructions du fabricant pour évaluer la qualité de l' ARN et la quantité 19.
- Stocker l'échantillon d'ARN à -80 ° C jusqu'à utilisation.
2. ARN Amplification et d'étiquetage pour l'analyse microarray
NOTE: Pour le premier utilisateur de temps de travail avec des procédures d'amplification d'ARN et d'étiquetage, utiliser cinq ng de pointe dans l'ARN along avec les échantillons réels Ärna pour surveiller la mesure de contrôle de la qualité de l'amplification de l'ARN et l'hybridation. La pointe en ARN mélange contient dix synthétisées, des transcriptions polyadénylés in vitro dans des rapports prédéterminés. Lorsque la procédure effectuée correctement, les transcripts marqués hybrident spécifiquement seulement à des sondes de contrôle complémentaires dans les tableaux et les données peuvent être numérisés pour suivre l'assurance de contrôle de la qualité avec soi minime ou hybridation croisée. Plus de détails Description en ce qui concerne la procédure à pointes-intensités de contrôle et de normalisation après la numérisation réseau et l' analyse des données est se référer à des publications précédentes 20, 21. La procédure suivante est donnée aux utilisateurs de puces à ADN de routine.
- Préparer 100 pg de haute qualité échantillon d'ARN (nombre ARN Integrity (RIN) valeur au moins> 7,0) dans un volume total de 10 - 11 pi.
- Amplifier les échantillons d'ARN avec un kit d'amplification pouvanttravailler avec des échantillons pico-échelle (aussi peu que 100 pg).
NOTE: Recommandé informations de kit d'amplification est disponible dans la liste des matériaux et suit les instructions du fabricant, sans aucune modification. - Utiliser une analyse quantitative à base de fluorescence pour évaluer le profil de la plage de taille de l'ARNa amplifié.
- Utiliser l'instrument de spectrophotomètre (sur la base de l'absorbance à 260 et 280 nm) pour mesurer la concentration de l'ARNa amplifié.
- Stocker le ARNa amplifié à -80 ° C jusqu'au moment de l'étiquetage.
- Utilisez 2 pg d'ARN amplifié pour le marquage fluorescent selon ULS ARNa kit de marquage mode d'emploi.
NOTE: Depuis Cyanine 547 et 647 Cyanine colorant sont sensibles à la photo-dégradation et Cyanine 647 colorant est facilement dégradé par l'ozone, la procédure d'étiquetage a lieu dans une quantité minimale de lumière et sous un environnement exempt d'ozone. - Allumez le boîtier d'ozone (figure 1A) jusqu'à ce que le niveau d'ozone est de 0,001 ppm.
- Mélanger doucement et on incube les tubes dans un thermocycleur à 85 ° C pendant 15 min. Placer les échantillons sur la glace pendant au moins 1 min. Isoler pour recueillir le contenu des tubes avant de poursuivre avec le kit d'extraction d'ARN, à l'exception des mesures liées au traitement DNase (1,9 à 1,11), pour nettoyer l'ARN amplifié Cy-marqué par un colorant.
- Utilisez l'instrument de spectrophotomètre pour mesurer et déterminer la concentration d'ARN amplifié marqué et maintenir le ARNa marqué à -80 ° C maximum pendant 3 jours avant utilisation.
3. Microarray Hybridation et laver
REMARQUE: Les étapes importantes suivantes sont adaptées selon le protocole d'analyse à deux couleurs à base de microréseaux Gene Expression (version6.5, mai 2010).
- Ajouter la même quantité de 825 ng de chaque Cyanine 547- et Cyanine 647 marqué ARNa et mélanger avec 25x et 10x fragmentation des tampons de blocage.
- Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 15 minutes et laisser refroidir sur la glace pendant 1 min.
- Ajouter la même quantité de tampon d'hybridation 2x et bien mélanger.
- Centrifuger à 13 000 tpm, puis le mélange est prêt pour l'hybridation.
- Charger 100 ul du mélange sur la lame de matrice et sceller le coulisseau intérieur de la chambre d'hybridation.
- Charger la chambre assemblé dans le four d'hybridation pendant 17 heures à 65 ° C tournant à 10 tours par minute dans le four.
- Laver les tableaux selon le protocole avec le traitement de la protection de l'ozone par immersion dans la stabilisation et la solution de séchage pendant 30 s.
- Retirez les tableaux de la solution et assurez-vous que la surface du tableau est sec, sans particules de poussière
4. Numérisation Microarray Glisser
- Gardez les tableaux dans un endroit sombre et tourner sur scanner jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi (15 min temps d'attente).
- Chargez le code à barres de tableau sur la gauche, dans le scanner et lancer la numérisation. Faites l'analyse de la place selon le mode d'emploi du logiciel et enregistrer les données que (GPR) format de fichier.
5. Analyse statistique
- Télécharger le logiciel FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Cliquez sur "données brutes import" et charger les fichiers GPR dans FlexArray.
- Effectuer la normalisation et l'analyse statistique, si nécessaire en suivant les instructions. Remarque: Calculer le seuil de sélection spot positif dans cette étude comme il a été décrit précédemment 22.
- Sélectionnez le menu déroulant manuel de l'observateur de traçage du FlexArray pour afficher toutes les taches hybridées et les signaux de fond. Remarque: Une image similaire de dopés dans les contrôles après hybridation à la puce peut être vu dans l' étude précédente 8.
- Sélectionner unnormalisation Loess au sein tableau suivant par un quantile entre le processus de normalisation des tableaux de la FlexArray déroulant manuel en conséquence.
- Exporter toutes les données normalisées de FlexArray dans un fichier Excel pour une utilisation ultérieure.
6. Bioinformatique Analyse
L'annotation originale des séquences de sondes de Transcriptions spécifiques Embryon bovine (BESTv1) microarray a été décrit précédemment 8. Dans cette étude, 20,403 Symboles de gènes uniques (GS) ont été obtenus ( Supplément File1 ) par l'intermédiaire du Laboratory Information Management System EmbryoGENE (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Une liste de 6.765 gènes uniques ( Supplément File2 ) a été sélectionné et correspond aux signaux tous positifs après processus microarray de normalisation (étape 5.5) De bovins Jour 7 gène embryons profil d'expression. Seuil de signal positif a été calculé sur la base de la publication 16 de la perméable intensité du signal d'une valeur de A.
- Pour effectuer l' analyse fonctionnelle avec PANTHER (Protein analyse via évolutionnaires Relations) Système de classification 23, 24, ouvrir le lien suivant (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
- Ajouter une liste de 6.765 GS spécifiques pour identifier les embryons processus biologique spécifique pendant le développement embryonnaire en utilisant le test de surreprésentation statistique et utiliser le paramètre par défaut de Bos taurus (tous les gènes dans la base de données) comme liste de référence 25.
NOTE: Ceci permet l'identification des processus de développement liés à des termes GO qui sont statistiquement sur- ou sous-exprimées à l'aide d'un test binomial. - Régler le seuil P-valeur à <0,05 en tant que logiciel par défaut. Les données peuvent être téléchargées et exported dans un fichier Excel pour une sélection 16.
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Representative Results
Un résultat représentatif de l' ARN total et amplifiés à partir ARNa Jour 7 embryons de bovins est représenté sur la figure 3 et résumés dans le tableau 1.
l'intégrité de l'ARN et le profil peuvent être évalués après l'extraction de l'ARN. Évaluation de la qualité de l' ARN pourrait être fait par instrument Bioanalyseur (Figure 3A) et seuls les échantillons ayant une valeur supérieure à 7,0 RIN sont qualifiés pour être utilisés pour l' amplification (tableau 1).
La qualité et la quantité d'ARN amplifié devraient être évalués après amplification. La similitude de profil d'ARN amplifié et la gamme de taille appropriée sont les principaux facteurs de contrôle de la qualité (figure 3B). Après l'amplification à deux tours, les fragments d'ARN amplifiés sont très similaires en taille, comprise entre 200 et 800 pb (figure 3B) ettous les Arnas de la gamme de taille similaire sont sélectionnés pour plus marquage par fluorescence. En outre, une amplification réussie de l'ARN total initial donnera au moins plus d'un millier de fois plus ARNa (tableau 1).
Efficacité de marquage par fluorescence peut être calculée en fonction du degré de taux de marquage. La formule est disponible dans le kit de marquage notice ULS ARNa. Le mode d'emploi indique le degré de rapport d'étiquetage devrait être de 1,0 - 3,6%, ce qui indique qu'une moyenne de 1 - 3,6 ULS molécules par 100 nucléotides.
Les fichiers d'image après l'hybridation et la numérisation peuvent être consultés à partir FlexArray. Une bonne qualité d' image numérisée après microarray hybridation et de lavage est représenté sur la figure 4A. Si les matériaux marqués sont inférieures ou supérieures à cette gamme, les signaux seront trop faibles pour détecter ou les niveaux de fond élevés seront détectés après scanning (figure 4B).
Dans l'étude actuelle, le seuil de signal positif a été fixé à 7,6 (signal de la sonde supérieure à 7,6 ou de fond <7,6 considéré comme positif). Environ 46% des ensembles de sondes représentant 20826 points positifs sont indiqués en couleur rouge à la Journée bovine 7 embryons (Figure 5). Après avoir enlevé les symboles de gènes non annotée et en double, seuls 6.765 symboles de gènes uniques est laissée pour l'analyse de PANTHER.
Ces 6.765 gènes représentent les transcrits d'ARN uniques exprimées dans le bovin blastocyste Jour 7. Afin de trouver le processus biologique spécifique à blastocyste bovine, PANTHER Surreprésentation test est effectué. Le top 10 Gene Ontology (GO) ID terme avec le plus haut indice de pliage d'enrichissement est sélectionné (Figure 6). En général, ces termes spécifiques GO représentent en grande partie le processus de division cellulaire active, tels que mitosis et la ségrégation des chromosomes, la régulation du cycle cellulaire et initiation de la traduction cytoplasmique et mitochondrial.
Figure 1: sans ozone Box (A) et Array Étiquetage réaction (B). A) L' ozone Boîte libre se compose d'une unité de conversion catalytique qui recycle l'air et détruit l' ozone et un capteur d'ozone très sensible pour surveiller le niveau d'ozone à l' intérieur de la boîte lors de la réalisation de puces à ADN. B) Procédure d'étiquetage et le réseau d' hybridation effectuent à l' intérieur de la boîte pour éviter le fluorescent Cyanine 647 dégradation de colorant par l' ozone. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: PANTHER Liste Gene analyse. Les flèches rouges indiquent la région ont besoin d'être rempli. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Un représentant Bioanalyseur Electrophérogramme d'ARN total (A) et le Gel Image de Amplified ARN (B). A) Afficher résultat global avec la valeur RIN, la concentration de l' ARN et le rapport ARNr. B) Le profil de l' ARN amplifié après deux tours d' amplification. fragments d'ARN amplifiés sont censés être dans une plage comprise entre 200 et 800 pb. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Image de tableau Intensité Carte. (A) Une bonne image d'une lame de tableau montrant le canal vert et rouge correspondent à cyanine 547 et Cyanine 647 signaux après une numérisation avec une forte intensité du spot (indiqué sur la gauche avec la couleur bleu - vert) et faible bruit de fond (indiqué sur la droite avec bleu foncé Couleur). (B) Une mauvaise image d'une diapositive de tableau montrant l' image très élevée de fond du canal rouge (indiqué dans le panneau supérieur avec le bleu couleur verte semblable à l'image de Cyanine 647 intensité de la tache). Nuancier indique l'intensité du signal avec des valeurs numériques correspondant à des couleurs différentes. La valeur de l'intensité du signal est le plus bas dans la gamme de couleur bleu foncé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un grandversion r de ce chiffre.
Figure 5: MA Plot pour le Jour 7 Bovine Embryo Gene Expression Profil. 20,826 points rouges représentent des signaux positifs au-dessus des signaux d'arrière-plan. taches de fond sont mis en évidence en couleur noire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Les Top 10 Gene Ontology (GO) ID à terme avec l'indice le plus élevé d' enrichissement Fold. Ces termes spécifiques GO représentent en grande partie le processus de division cellulaire active, tels que la mitose et la ségrégation des chromosomes, la régulation du cycle cellulaire et l'initiation de cytoplasmique et mitochondrial translation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Échantillon | Nombre d'embryons | Type | Embryo qualité morphologique | La concentration de l' ARN (pg / pl) | RIN | ARN total utilisé pour l' amplification (p) | La concentration de l' ARN amplifié (ng / ul) | ||||||||
| S1 | 4 | Blastocyste | Grade 1 & 2 | 101 | 8.6 | 858,5 | 3498,4 | ||||||||
| S2 | 1 | Blastocyste | grade 2 | 142 | 7.4 | 1207 | 1682,4 | S3 | 2 | Blastocyste | grade 1 | 135 | 8.8 | 1147,5 | 3185,3 |
| S4 | 3 | Blastocyste | grade 1 | 177 | 9 | 1504,5 | 2906,4 | ||||||||
| S5 | 5 | Blastocyste | grade 1 | 636 | 8.3 | 5406 | 3437,5 | ||||||||
| S6 | 3 | Blastocyste | Grade 1 & 2 | 159 | 9.1 | 1351,5 | 1689,8 | ||||||||
| S7 | 3 | Blastocyste | grade 1 | 154 | 9 | 1309 | 4507,1 | ||||||||
| S8 | 4 | Blastocyste | grade 1 | 304 | 8.5 | 2584 | 3089,3 | ||||||||
| S9 | 5 | Blastocyste | grade 1 | 282 | 9.1 | 2397 | 3917,8 | ||||||||
| S10 | 6 | Blastocyste | Grade 1 & 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | Blastocyste | grade 1 | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | Blastocyste | grade 1 | 206 | 9 | 1751 | 2567,9 |
Tableau 1: Echantillon et informations ARN. La concentration et la qualité de l'ARN doit être évaluée après extraction. l'intégrité de l'ARN et la concentration peuvent être évaluées par toute bioanalyser. ARN numéro de l'intégrité devrait être plus que 7,0. La concentration d'ARN devrait être examiné par instrument spectrophotomètre après amplification. Embryo la qualité a été évaluée selon le Manuel de la Société internationale de transfert d' embryons (3 e éd., Savoie, IL).
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Discussion
Le premier problème à effectuer l'analyse des microréseaux utilisant Jour 7 embryons de bovins est de ne pas obtenir des quantités suffisantes d'ARN de haute qualité pour l'étude de l'expression des gènes. extraction de l'ARN phénol traditionnel / chloroforme et la méthode de précipitation à l'éthanol ne sont pas recommandés pour Jour 7 embryons, ce qui entraîne un faible rendement et possible phénol restes inhiber la réaction d'amplification d'ARN. Au lieu de cela, une méthode basée sur colonne standard est préférable d'isoler l'ARN total, puis éluer l'ARN avec du tampon d'élution au minimum pour augmenter la concentration. Une moyenne de 780 pg d'ARN total par embryon est obtenu dans l' étude actuelle , qui est comparable à d' autres rapports en utilisant une méthodologie identique 26 et le kit d'extraction d'ARN même 27, 28 actuellement utilisé. Pour l'extraction de l'ARN, il est recommandé de dissoudre le précipité avant l'utilisation en mélangeant intimement ou réchauffer le flacon de tampon d'extraction pour redissoudre le tampon d'extraction avantutiliser. De plus, le temps d'incubation est également important pour le rendement de l'ARN dans l'étape d'extraction. durée inférieure à une pleine 30 minutes à 42 ° C d'incubation réduit le rendement en ARN.
Sur une colonne de digestion par la DNase est nécessaire pour éliminer la contamination d'ADN génomique au cours de la purification de l'ARN total. L'enzyme ADNase est très sensible à vortex et centrifugation. Par conséquent, DNase et le tampon doivent être mélangés en retournant doucement.
La qualité de l'ARN est très importante dans l'analyse de puces à ADN et des échantillons avec un RIN inférieur à 7 ne doit pas être pris en considération pour l'hybridation. Dans l' étude actuelle, les profils d'ARN totaux obtenus par Bioanalyseur sont similaires à ceux observés précédemment dans les études à partir de blastocystes bovins 26, 27. Il est intéressant de noter que lors de l'utilisation d'embryons pré-hachurés, en particulier l'ARN préparé à partir d'ovocytes et d'embryons avant la maternelle à la transition embryonnaire, la valeur RIN est souvent inférieur à 7 par rapportl'ARN total à partir d' embryons de 7 jours, ce qui est dû à une variation du rapport 28S / 18S 27.
La quantité d'ARN extrait à partir d'embryons de bovins ne suffit pas pour l'hybridation plate-forme, par conséquent, l'amplification d'ARN est nécessaire. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour l'amplification d' ARN telles que la PCR, transcription in vitro (IVT), et Ribo-SPIA (amorce simple amplification isotherme). Bien que cette dernière méthode est plus rapide et en un jour fournit suffisamment de matériel pour les tableaux, il fallait au moins 5 ng comme matériau 29 de départ. Par conséquent, nous avons choisi la méthode IVT qui est capable de travailler avec des matériaux de départ faible 12 (aussi peu que 100 pg). Par ailleurs, il a déjà été testé pour amplifier l' ARN total extrait à partir d' embryons de bovins 29 avec succès. Dans l'étude actuelle, notre méthode d'amplification produite ~ 28 pg d'ARN amplifié par embryon de 598 pg d'ARN total par embryon. Additionalement, après l'amplification à deux tours, nos échantillons ont montré un profil similaire et la gamme de taille appropriée (entre 200 et 800 pb) qui sont en accord avec les études précédentes 13, 15.
Dans ce protocole, nous avons utilisé une cyanine de platine lié protocole de marquage non-enzymatique, (Cyanine 547 et Cyanine 647) colorants. Cette méthode permet l'étiquetage de l'ARN amplifié ou non amplifié. Ayant étape d'amplification avant l'étiquetage permet d'utiliser les nucléotides naturels, conduisant à des rendements plus élevés d'ARN amplifiés, réduire le biais et de générer des fragments plus longs par rapport à la méthode enzymatique. Les Cyanine 547 et Cyanine 647 colorants sont communs colorants fluorescents recommandent pour tableau à deux couleurs. Cependant, Cyanine 647 colorant est sensible à la dégradation par l'ozone. Hand held moniteur d'ozone devrait être utilisé pour assurer que le niveau d'ozone en dessous de 2 ppb. En outre, sans poussière est nécessaire pour éviter les particules de poussière tombant dans une solution d'hybridation ou durinbalayage g.
expérience de microréseau peut être conçu dans l'approche d'une ou deux couleurs. Chaque approche expérimentale a des avantages et des inconvénients. Utilisation de dessins en deux couleurs réduit le bruit de la variabilité et de fond, permet une comparaison directe et pour la boucle conçoit avec la définition d'un échantillon de référence commun. Bien que des biais spécifiques colorants peuvent considérablement affecter les résultats lors des expériences sont effectuées en utilisant des dessins en deux couleurs, ces préjugés peuvent être atténués en effectuant des swaps de colorant. Cette réplication technique ajoute aux coûts expérimentaux, mais peut améliorer la précision et la sensibilité dans la mesure de l' expression différentielle 31.
Comparer à d' autres logiciels de bioinformatique (comme gorilla) PANTHER permet de comparer les données avec Bos taurus génome comme référence. Nos résultats indiquent que lors de la Journée 7 bovine développement embryonnaire qui suit les composantes biologiques et les fonctions sont impliqués: la régulation de la métaphase / anaptransition hase du cycle cellulaire, la régulation de la transition métaphase mitotique / anaphase, la régulation de la ségrégation des chromosomes, la traduction mitochondriale, la protéine K48 liée ubiquitination, ER à Golgi transport vésiculaire médiation, processus catabolique ARNm nucléaire transcrit, initiation de la traduction, la soeur mitotique chromatides ségrégation , la division nucléaire mitotique.
Les protocoles présentés dans le présent document, de marquage fluorescent de l'ARN amplifié à balayage des ensembles doivent être exécutés avec la conscience supplémentaire des facteurs environnementaux ci-dessus pour conserver des données de haute qualité.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
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