Introduction
Vroeg embryonaal verlies in hoogproductieve melkkoeien is een van de belangrijkste uitdagingen in de zuivelindustrie 1, 2. Bovine is uitgegroeid tot een interessant model voor pre-implantatie embryo-ontwikkeling van het menselijk studeren omdat ze gelijkaardige ontwikkelingsproces 3, 4. Er is echter meer onderzoek nodig om beter inzicht te krijgen over de genen die betrokken zijn bij runderen vroege embryonale ontwikkeling.
Na twintig jaar sinds de eerste microarray technologie ontwikkeld in 1995 5, de ontwikkeling van verfijndere probe fabricagetechnologie verminderd drukfouten en variabiliteit van de array chips binnen en tussen verschillende microarray platforms 6. Verbeterde microarray technologie geleid tot een wijd toepassing van deze technologie in klinisch onderzoek 7 en meer recent, in vroege embryo quality assessment 8.
De grote hoeveelheid benodigde materiaal voor de microarray technologie is de belangrijkste reden waarom de microarray technologie in eerste instantie niet aan een aantal onderzoeksgebieden in te voeren, zoals de vroege embryonale ontwikkeling. Meer recent zijn RNA amplificatiewerkwijzen verbeterd lineair amplificeren van RNA tot microgram niveau van sub-nanogram vanaf RNA materiaal 9. Er zijn verschillende commerciële RNA amplificatie kits op de markt; Echter, hoe meer populair goed ontwikkeld kits soortgelijk aan Ribo-Single Primer isothermische amplificatie 10 en T7-promoter gedreven 11 methoden. De meest populaire antisense RNA-amplificatie gebruikt in vitro transcriptie met oligo dT primer koppelen aan een T7 promoter 5 'einde 12. Deze technologie maakt het handhaven van de meest representatieve anti-sense transcripten na lineaire versterking fof hybridisatie arrays 13. Deze werkwijze is aangepast aan picogram niveau van totaal RNA geëxtraheerd uit runder embryo 8 amplificeren.
Universele verbindingssysteem (ULS) de labelingsmethode die rechtstreeks opgenomen het DNA of RNA geamplificeerd met platina gebonden fluorescerende kleurstof ofwel Cyanine 547 of 647 Cyanine, door vorming van een coördinatieve binding op positie N7 van guanine 14. Deze werkwijze werd aangepast embryo onderzoek stabieler aRNA geamplificeerd ongewijzigd vergeleken met de gemodificeerde aminoallyl ARNA gegenereerd door enzymatische methode 15 te genereren. Zowel single kleurstof en twee kleurstoffen etikettering methoden zijn aangepast met behulp van Universal Linkage System in microarray. Een grote microarray vergelijkingen studie was dat er een goede correlatie datakwaliteit tussen één- en twee-color matrix platforms 6.
Onlangs, zowel T7 promotor rijdenn antisense RNA amplificatie en labeling ULS werkwijzen ontwikkeld om een meer betrouwbare protocol bij een voldoende hoge kwaliteit gemerkt aRNA materialen voor microarray hybridisatie 8, 16 te genereren. Daarom is deze studie geeft een protocol om een aantal van de belangrijke stappen van RNA-extractie tot data-analyse betrokken zijn in twee kleuren microarray met behulp van dag 7 embryo's van runderen als voorbeeld te tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het dier deel van deze studie werd uitgevoerd bij de Metabolic Research Unit van de Universiteit van Alberta, Edmonton, Canada, met alle dierlijke experimentele procedures goedgekeurd (Protocol # AUP00000131) van de Universiteit van Alberta Animal Care en gebruik Comite, en de dieren verzorgd volgens aan de Canadese Raad van Animal Care richtlijnen (1993).
1. Embryo Productie, Isolatie van Totaal RNA en DNase behandeling
- Voor dierlijke experimentele protocollen en embryo verwijzen in onze vorige publicaties 17, 18.
- Pool en snap bevriezen soortgelijke embryo's van elke koe in vloeibare stikstof en vervolgens laten -80 ° C tot RNA-extractie.
- Extract totaal RNA via een kolom gebaseerde RNA extractie kit die toelaat om RNA te extraheren uit pico-schaal monsters (kit informatie beschikbaar in Laden List).
LET OP: Aanbevolen kit bevat: Conditioning Buffer, Extraction Buffer, 70% ethanol, Wash Buffer 1, Wash Buffer 2, Elution Buffer, RNA zuivering zuilen met collectie buizen en microcentrifugebuizen. - Voeg 10 ul Extraction Buffer om buis met embryo en incubeer gedurende 30 minuten bij 42 ° C. Centrifugebuis bij 800 xg gedurende 2 min celextract verzamelen in de microcentrifugebuis.
- Pipet 250 pi Conditioning Buffer op de zuivering kolom filter membraan. Incubeer de RNA zuiveringskolom met Conditioning buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de zuiveringskolom in de verzamelbuis bij 16.000 xg gedurende 1 min.
- Pipetteer 10 ul van 70% ethanol in het mengsel van RNA Extraction Buffer en embryo's. Meng goed door en neer te pipetteren. Pipetteer mengsel in de gepreconditioneerde zuiveringskolom.
- RNA gecentrifugeerd zuiveringskolom binden gedurende 2 min bij 100 xg en onmiddellijk volgen door een centrifugatie bij 16.000 xg gedurende 30 s tot doorstroming verwijderen.
- Pipette 10081, L wasbuffer 1 in de zuiveringskolom en centrifugeer gedurende 1 min bij 8000 x g.
LET OP: DNase behandeling wordt aanbevolen als het uitvoeren van reverse transcriptie of amplificatie na RNA-isolatie. - Digest genoom DNA direct na stap 1.8.
LET OP: Aanbevolen DNase kit is verkrijgbaar in Material List. Aanbevolen kit bevat: DNase I voorraad-oplossing en Buffer. - Bereid DNase incubatie mengsel door het mengen van 5 ul DNase I voorraad oplossing met 35 ul Buffer. Meng door voorzichtig omkeren.
- Pipetteer de 40 ul DNase incubatie mengsel direct in de zuiveringskolom membraan. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Pipetteer 40 ul Wash Buffer 1 in de zuiveringskolom membraan en centrifugeer vervolgens bij 8000 xg gedurende 15 s.
- Pipetteer 100 ul Wash Buffer 2 in de zuiveringskolom en centrifugeer gedurende 1 min bij 8000 x g.
- Pipetteer 100 ul ander Wash Buffer 2 in de zuiveringskolom en centrifugeergedurende 2 minuten bij 16.000 x g.
- Breng de zuiveringskolom een nieuwe 0,5 ml microcentrifugebuis. Pipetteer 11 ul elutiebuffer direct op het membraan van de zuiveringskolom. Om maximale extinctie elutiebuffer in het membraan verzekeren voorzichtig raakt de punt van de pipet op het oppervlak van het membraan tijdens het afgeven van de elutiebuffer.
- Incubeer de kolom gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Centrifugeer de kolom gedurende 1 min bij 1000 xg om Elution Buffer verdelen in de kolom, en draaien gedurende 1 min bij 16.000 xg RNA te elueren.
- Gebruik bioanalyzer instrument volgens de instructies van de fabrikant om de kwaliteit en kwantiteit van RNA 19 evalueren.
- Bewaar het RNA monster bij -80 ° C tot gebruik.
2. RNA amplificatie en Labeling voor microarray-analyse
LET OP: Voor de eerste keer dat de gebruiker werken met procedures RNA-amplificatie en etikettering, gebruik van vijf ng spike-in RNA along met de feitelijke ARNA monsters om de kwaliteit controlemeting van het RNA amplificatie en hybridisatie monitoren. De piek in RNA mix bevat tien in vitro gesynthetiseerd gepolyadenyleerde transcripten in vooraf bepaalde verhoudingen. Wanneer de procedure correct wordt uitgevoerd, specifiek het gelabelde transcripten alleen hybridiseren met complementaire probes control arrays en de gegevens kunnen worden gescand bijhouden kwaliteitscontrole zekerheid met minimale zelf- of kruis-hybridisatie. Meer details met betrekking tot de beschrijving spiked-controle intensiteiten en normalisatie procedure na het scannen van de array en data-analyse is verwijzen naar eerdere publicaties 20, 21. De volgende procedure wordt aan de routine microarray gebruikers.
- Bereid 100 pg kwaliteit RNA monster (RNA Integrity nummer (RIN) waarde tenminste> 7,0) in een totaal volume van 10-11 pl.
- Versterken de RNA monsters met een amplificatie kit te kunnenwerken met pico-schaal monsters (zo weinig als 100 pg).
LET OP: Aanbevolen versterking kit informatie is beschikbaar in Material List en volgt de instructies van de fabrikant, zonder enige wijziging. - Gebruik een fluorescentie gebaseerde kwantificatie het profiel van de orde van grootte van de geamplificeerde ARNA evalueren.
- Met de spectrofotometer instrument (gebaseerd op de absorptie bij 260 en 280 nm) bij de concentratie van het geamplificeerde ARNA meten.
- Bewaar de versterkte ARNA bij -80 ° C tot klaar voor de etikettering.
- Gebruik 2 ug versterkt RNA voor tl-labeling volgens ULS ARNA labeling kit handleiding.
LET OP: Aangezien Cyanine 547 en 647 Cyanine kleurstof zijn gevoelig voor foto-degradatie en Cyanine 647 kleurstof wordt gemakkelijk afgebroken door ozon, de etikettering procedure vindt plaats in een minimale hoeveelheid licht en onder een ozon-vrije omgeving. - Schakel de ozonlaag (Afbeelding 1A) totdat het niveau van ozon 0,001 ppm.
- Meng voorzichtig en incubeer de buizen in een thermocycler bij 85 ° C gedurende 15 minuten. Leg monsters op ijs gedurende ten minste 1 min. Spin down naar de inhoud van de buizen te verzamelen voordat u verder gaat met RNA-extractie kit, met uitzondering van maatregelen in verband met DNase behandeling (1,9-1,11), de sanering van de Cy-dye-gelabelde versterkt RNA.
- Met de spectrofotometer instrument voor het meten en bepalen van de concentratie van gemerkte geamplificeerde RNA en houd de gelabelde ARNA bij -80 ° C gedurende maximaal 3 dagen vóór gebruik.
3. Microarray hybridisatie en Wassen
OPMERKING: De volgende belangrijke stappen worden aangepast aan twee kleuren-microarray-based analyse van genexpressie Protocol (version6.5, mei 2010).
- Voeg gelijke hoeveelheid van 825 ng van elk Cyanine 547- en Cyanine 647-gelabeld ARNA en meng met 25x fragmentatie en 10x blokkerende buffers.
- Verwarm het mengsel bij 60 ° C gedurende 15 min en koel op ijs gedurende 1 minuut.
- Voeg gelijke hoeveelheid 2x hybridisatiebuffer en meng.
- Centrifugeer bij 13.000 rpm, waarna het mengsel gereed voor hybridisatie.
- Plaats 100 pi van het mengsel op de array glijbaan en verzegelen de dia in de hybridisatie kamer.
- Laad de gemonteerde kamer in de hybridisatie oven gedurende 17 uur bij 65 ° C roteren met 10 rpm in oven.
- Was de arrays volgens het protocol met de bescherming van de ozonlaag behandeling door dompelen in de stabilisatie en het drogen van oplossing voor de 30 s.
- Verwijder de arrays uit de oplossing en zorg ervoor dat de array oppervlak droog zonder stofdeeltjes
4. Scanning Microarray Slide
- Houd de arrays in donkere plaats en zet scanner totdat het klaar voor gebruik (15 min wachttijd).
- Laad de matrix barcode op links, in de scanner en start het scannen. Doe de plek analyse op basis van de software handleiding en de gegevens zoals (GPR) bestandsformaat op te slaan.
5. Statistische analyse
- Download de software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Klik op "import ruwe data" en laad de GPR-bestanden in FlexArray.
- Voer de normalisering en statistische analyse, indien nodig door het volgen van de instructie. Let op: Bereken de drempel voor positieve spot selectie in dit onderzoek als het eerder 22 beschreven.
- Selecteer de drop down handleiding van de plot kijker van de FlexArray om alle gehybridiseerde vlekken en achtergrond signalen te bekijken. Opmerking: Een soortgelijk beeld van spiked in controles na hybridisatie met de microarray blijkt uit eerder onderzoek 8.
- Selecteer eenLöss normalisering binnen matrix gevolgd door een kwantiel tussen arrays normaliseringsproces van het FlexArray drop-down handleiding dienovereenkomstig.
- Exporteer alle genormaliseerde gegevens van FlexArray in een Excel-bestand voor verder gebruik.
6. Bioinformatica Analyse
Het origineel annotatie van de sonde sequenties van Bovine Embryo-specifieke Afschriften (BESTv1) microarray is eerder 8 beschreven. In de huidige studie werden 20.403 unieke Gene Symbolen (GS) verkregen ( Supplement File1 ) door de EmbryoGENE Laboratory Information Management System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Een lijst van 6765 unieke genen ( Supplement File2 ) werd geselecteerd en kwam overeen met de al positieve signalen na microarray proces van normalisatie (Stap 50,5) van runderen Dag 7 embryo genexpressieprofiel. Positief signaal drempel is gebaseerd op doorlatende bekendmaking 16 van de signaalintensiteit van een A waarde.
- Om functionele analyse met PANTHER (eiwitanalyse door evolutionaire relaties) uit te voeren Classification System 23, 24, opent u de volgende link (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
- Upload een lijst met 6.765 embryo-specifieke GS om specifieke biologische processen te identificeren tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van statistische oververtegenwoordiging testen en gebruiken standaardinstelling van Bos taurus (alle genen in de database) als referentielijst 25.
LET OP: Dit maakt de identificatie van ontwikkelings-processen van de GO termen die statistisch over- of onder-expressie gebracht met behulp van een binomiaal-test zijn. - Stel P-drempelwaarde op <0,05 als software standaard. De gegevens kunnen worden gedownload en exported in Excel-bestand voor verdere selectie 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een representatief resultaat van totaal RNA geamplificeerd en aRNA vanaf dag 7 runderembryo's wordt getoond in Figuur 3 en samengevat in tabel 1.
RNA integriteit en profiel kan worden vastgesteld na RNA-extractie. Kwaliteitsbeoordeling RNA kan gebeuren door bioanalyzer instrument (figuur 3A) en slechts monsters met RIN waarde hoger dan 7,0 gekwalificeerd te worden gebruikt voor amplificatie (Tabel 1).
De kwaliteit en kwantiteit van RNA geamplificeerd moet worden na amplificatie. De gelijkenis van de versterkte RNA-profiel en de juiste grootte assortiment zijn de belangrijkste factoren voor de kwaliteitscontrole (Figuur 3B). Nadat de twee-round amplificatie, het geamplificeerde RNA fragmenten zijn zeer vergelijkbaar in grootte, variërend tussen 200 en 800 bp (Figuur 3B) enalle arnas van vergelijkbare grootte bereik worden geselecteerd voor verdere fluorescentie labeling. Ook zal een succesvolle amplificatie van het oorspronkelijke totale RNA in ieder geval meer dan duizend voudige toename van aRNA (tabel 1) werd verkregen.
Fluorescentie labelingsefficiëntie kan worden berekend op basis van de mate van labeling ratio. De formule is verkrijgbaar in de ULS ARNA labeling kit handleiding. De gebruikershandleiding stelt de mate van labeling verhouding moet 1,0 zijn - 3,6%, wat aangeeft dat gemiddeld 1 - 3,6 ULS moleculen per 100 nucleotiden.
De beeldbestanden na hybridisatie en scannen kunnen worden bekeken vanaf FlexArray. Een kwaliteit gescande afbeelding goed na microarray hybridisatie en wassen is weergegeven in figuur 4A. Als gelabelde materialen lager of hoger dan dit bereik, zal signalen te laag om te detecteren of hoge achtergrondniveaus wordt gedetecteerd nadat scanni zijnng (Figuur 4B).
In de huidige studie werd positief signaal drempel vastgesteld op 7,6 (sonde signaal hoger dan 7.6 of achtergrond <7.6 als positief te zijn). Ongeveer 46% van de probe sets die 20.826 positieve vlekken worden aangeduid in rode kleur van runderen Dag 7 embryo's (Figuur 5). Na het verwijderen van een annotatie en dubbele gen symbolen, is slechts 6765 unieke gen symbolen vertrokken voor PANTHER analyse.
Deze 6765 genen vertegenwoordigen de unieke RNA-transcripten uitgedrukt in de Dag 7 runderen blastocyst. Om het biologische proces specifiek voor runderen blastocyst vinden, wordt PANTHER Oververtegenwoordiging Test uitgevoerd. De top 10 Gene Ontology (GO) term id's met de hoogste vouw verrijking index is geselecteerd (figuur 6). In het algemeen, deze specifieke termen GO grotendeels vertegenwoordigt de actieve celdeling Werkwijze zoals mitosis en chromosoom segregatie, regulering van de celcyclus en initiatie van cytoplasma en mitochondriale vertaling.
Figuur 1: Ozon-free Box (A) en Array Labeling Reaction (B). A) Ozon Gratis Box bestaat uit een katalysator eenheid die de lucht recycleert en vernietigt ozon en een zeer gevoelige ozon sensor om de ozon niveau in de doos tijdens microarray prestaties te controleren. B) Labeling procedure en de vele hybridisatie uit te voeren in het vak aan de fluorescerende Cyanine 647 kleurstof afbraak door ozon te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: PANTHER Gene List Analysis. Rode pijlen geven het gebied moeten worden ingevuld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een vertegenwoordiger Bioanalyzer electropherogram totaal RNA (A) en de gel Image geamplificeerde RNA (B). A) Resultaat globale resultaat met RIN waarde, RNA-concentratie en rRNA ratio. B) Het Profiel van versterkte RNA na twee-round amplificatie. Geamplificeerde RNA fragmenten worden verwacht in een bereik tussen 200 en 800 bp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Beeld van Array Intensity Map. (A) Een goed beeld van een reeks dia blijkt groene en rode kanaal overeen met 547 en Cyanine 647 signalen Cyanine na het scannen met een hoge plek intensiteit (aangegeven aan de linkerkant met blauwgroene kleur) en lage achtergrond (aangegeven aan de rechterkant met donkerblauwe kleur). (B) Een slechte beeld van een reeks dia zeer hoge achtergrond afbeelding van rode kanaal te zien (aangegeven vanaf het bovenste paneel met de vergelijkbare blauwgroene kleur uit het beeld van Cyanine 647 spot intensiteit). Kleurenkaart geeft de intensiteit van het signaal met de numerieke waarden die overeenkomen met verschillende kleuren. De waarde van signaalintensiteit is het laagst in het traject van donkerblauwe kleur. Klik hier om een grote te bekijkenr versie van deze figuur.
Figuur 5: MA Plot voor Dag 7 Bovine Embryo genexpressieprofiel. 20.826 rode vlekken vertegenwoordigd positieve signalen boven de achtergrond signalen. Achtergrond plekken zijn gemarkeerd in de kleur zwart. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: De Top 10 Gene Ontology (GO) Term ID's met de hoogste Fold Enrichment Index. Deze specifieke GO termen grotendeels actieve celdeling proces vertegenwoordigen, zoals mitose en chromosoom segregatie, regulering van de celcyclus en initiatie van cytoplasma en mitochondriale transning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Monster | Aantal embryo | Type | Embryo morfologische kwaliteit | RNA-concentratie (pg / pl) | RIN | Gebruikte totaal RNA amplificatie (pg) | Geamplificeerd RNA-concentratie (ng / ul) | ||||||||
| S1 | 4 | blastocyst | Grade 1 & 2 | 101 | 8.6 | 858,5 | 3498,4 | ||||||||
| S2 | 1 | blastocyst | Grade 2 | 142 | 7.4 | 1207 | 1682,4 | S3 | 2 | blastocyst | Grade 1 | 135 | 8.8 | 1147,5 | 3185,3 |
| S4 | 3 | blastocyst | Grade 1 | 177 | 9 | 1504,5 | 2906,4 | ||||||||
| S5 | 5 | blastocyst | Grade 1 | 636 | 8.3 | 5406 | 3437,5 | ||||||||
| S6 | 3 | blastocyst | Grade 1 & 2 | 159 | 9.1 | 1351,5 | 1689,8 | ||||||||
| S7 | 3 | blastocyst | Grade 1 | 154 | 9 | 1309 | 4507,1 | ||||||||
| S8 | 4 | blastocyst | Grade 1 | 304 | 8.5 | 2584 | 3089,3 | ||||||||
| S9 | 5 | blastocyst | Grade 1 | 282 | 9.1 | 2397 | 3917,8 | ||||||||
| S10 | 6 | blastocyst | Grade 1 & 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | blastocyst | Grade 1 | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | blastocyst | Grade 1 | 206 | 9 | 1751 | 2567,9 |
Tabel 1: Voorbeeld en RNA informatie. De concentratie en kwaliteit van RNA worden geëvalueerd na extractie. RNA integriteit en concentratie kan worden bepaald door een bioanalyzer. RNA integriteit nummer moet meer dan 7,0 zijn. De RNA-concentratie moet worden onderzocht door spectrofotometer instrument na versterking. Embryo kwaliteit werd geëvalueerd volgens de gebruiksaanwijzing van de International Embryo Transfer Society (3e ed., Savoy, IL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het eerste probleem om microarray-analyse uit te voeren met behulp van de Dag 7 embryo's van runderen krijgt niet voldoende hoeveelheden van hoge kwaliteit RNA voor het bestuderen van genexpressie. Traditioneel fenol / chloroform RNA-extractie en ethanolprecipitatie methode wordt niet aanbevolen voor Dag 7 embryo's, wat resulteert in een lage opbrengst en mogelijke overgebleven fenol remmen RNA-amplificatie reactie. In plaats daarvan een standaardmethode kolommen gebaseerde beter om totaal RNA te isoleren en elueer het RNA met minimale elutiebuffer om de concentratie te verhogen. Een gemiddelde van 780 pg totaal RNA per embryo wordt verkregen in de huidige studie die vergelijkbaar is met andere rapporten met een identieke methode 26 en hetzelfde RNA extractie kit 27, 28 momenteel gebruikt. Voor RNA-extractie wordt aanbevolen om een neerslag op te lossen voordat het gebruik door het grondig mengen of verwarmen de extractiebuffer flacon opnieuw los de extractiebuffer voorafgaandegebruiken. Bovendien incubatietijd is ook belangrijk voor RNA opbrengst extractiestap. Incubatietijd minder dan een volle 30 minuten bij 42 ° C verlaagd RNA opbrengst.
Op column DNase spijsvertering is noodzakelijk om genomisch DNA contaminatie tijdens totaal RNA zuivering te verwijderen. Het DNase enzym zeer gevoelig voor vortex en gecentrifugeerd. Daarom moeten DNase buffer en gemengd door voorzichtig omkeren.
De kwaliteit van het RNA is zeer belangrijk in microarray analyse en monsters met RIN hoger dan 7 niet moet worden beschouwd voor hybridisatie. In de huidige studie, de totale RNA profielen verkregen bioanalyzer zijn vergelijkbaar met die eerder waargenomen in studies van runderen blastocysten 26, 27. Er zij op gewezen dat bij het gebruik van pre-gearceerde embryo, vooral RNA bereid uit eicellen en embryo voordat het moederlijke embryonale overgang RIN waarde is vaak lager dan 7 vergelekenhet totale RNA van dag 7 embryo's en dit komt door een variatie in de 28S / 18S rRNA verhouding 27.
De hoeveelheid geëxtraheerd RNA van runderembryo's niet voldoende platform hybridisatie daarmee RNA-amplificatie is vereist. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor RNA-amplificatie zoals PCR, in vitro transcriptie (IVT) en Ribo-SPIA (één primer isotherme amplificatie). Hoewel deze methode is sneller en op een dag voldoende informatie bevat om arrays, vereiste minstens 5 ng als uitgangsmateriaal 29. Daarom hebben we gekozen voor de IVT methode die in staat is om te werken met een lage uitgangsmaterialen 12 (zo weinig als 100 pg). Bovendien is reeds getest op totaal RNA geëxtraheerd uit runder embryo succes 29 amplificeren. In de huidige studie, onze amplificatiewerkwijze geproduceerd ~ 28 ug versterkt RNA per embryo van 598 pg totaal RNA per embryo. Additiotenslotte, na de twee-round amplificatie onze monsters vertoonden een vergelijkbaar profiel en de juiste grootte bereik (tussen 200 en 800 bp) die in overeenstemming met eerdere studies 13, 15.
In dit protocol, gebruikten we een niet-enzymatische labeling protocol, platina gebonden cyanine (Cyanine 547 en Cyanine 647) kleurstoffen. Deze methode maakt het kenmerken van versterkte of niet-versterkte RNA. Met amplificatiestap voorafgaand aan etikettering maakt gebruik van natuurlijke nucleotiden, wat leidt tot hogere opbrengsten geamplificeerd RNA, reduceer afwijkingen en genereren langere fragmenten vergeleken met enzymatische methode. De Cyanine 547 en 647 Cyanine kleurstoffen zijn vaak fluorescerende kleurstoffen aanraden voor twee kleuren array. Echter, Cyanine kleurstof 647 is gevoelig voor afbraak van ozon. Hand gehouden ozon-monitor moet worden gebruikt om er zeker van het niveau van ozon te maken dan 2 ppb. Bovendien, stofvrije omgeving is noodzakelijk om stofdeeltjes te voorkomen vallen in hybridisatie-oplossing of during scannen.
Microarray experiment kunnen op één- of twee-color benadering. Elke experimentele benadering heeft een aantal voordelen en nadelen. Met behulp van twee-color ontwerpen vermindert de variabiliteit en achtergrondruis, zorgt voor een directe vergelijking en lus ontwerpen met het definiëren van een gemeenschappelijk referentiekader monster. Hoewel dye-specifieke vooroordelen aanzienlijk resultaten kunnen beïnvloeden wanneer experimenten worden uitgevoerd met behulp van twee-color ontwerpen, kunnen deze vooroordelen worden verzacht door het uitvoeren van kleurstof swaps. Dergelijke technische replicatie draagt bij aan experimentele kosten, maar kan zowel de nauwkeurigheid en de gevoeligheid te verbeteren bij het meten van differentiële expressie 31.
Te vergelijken met andere bioinformatica software (zoals gorilla) PANTHER kunt het vergelijken dataset met Bos taurus genoom als referentie. Onze resultaten geven aan dat tijdens Dag 7 bovine embryonale ontwikkeling van de volgende biologische componenten en functies zijn betrokken: regulering van de metafase / ANAPhase overgang van de celcyclus, regulering van de mitotische metafase / anafase transitie, regulering van chromosoom segregatie, mitochondriale vertaling, eiwit-K48 gekoppeld ubiquitinatie, ER te Golgi-blaasje gemedieerd transport, nucleair-getranscribeerd mRNA katabole proces, translatie-initiatie, mitotische zusterchromatide segregatie , mitotische nucleaire divisie.
De in dit document protocollen van fluorescente labeling van de geamplificeerde RNA scan van arrays worden uitgevoerd met extra kennis van de bovengenoemde omgevingsfactoren gegevens van hoge kwaliteit te handhaven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M.
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf (2016).
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
