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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

के Transcriptome प्रोफाइलिंग Published: January 30, 2017 doi: 10.3791/53754
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2, 3, 1
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval
* These authors contributed equally

Introduction

उच्च उत्पादक डेयरी गायों में जल्दी भ्रूण नुकसान डेयरी उद्योग 1, 2 में मुख्य चुनौतियों में से एक है। गोजातीय उनके समान विकास की प्रक्रिया 3, 4 के कारण मानव preimplantation भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प मॉडल बन गया है। हालाँकि, और अधिक अनुसंधान गोजातीय जल्दी भ्रूण के विकास में शामिल जीनों के बारे में बेहतर समझ के लिए आवश्यक है।

और अधिक परिष्कृत जांच निर्माण प्रौद्योगिकी कम हो मुद्रण त्रुटियों और भीतर और विभिन्न प्लेटफार्मों माइक्रोएरे 6 के बीच सरणी चिप्स की परिवर्तनशीलता के विकास के बाद पहली माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी के बाद से बीस वर्ष 1995 5 में विकसित किया है। सुधार माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी और अधिक हाल ही में एक व्यापक रूप से नैदानिक अनुसंधान 7 और में इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग में हुई, जल्दी भ्रूण क्ष मेंuality आकलन 8।

माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी के लिए आवश्यक सामग्री की बड़ी राशि मुख्य कारण है कि माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी शुरू में इस तरह जल्दी भ्रूण के विकास के रूप में अनुसंधान क्षेत्रों की संख्या में प्रवेश करने में विफल रहा है। हाल ही में, आरएनए प्रवर्धन तरीकों रैखिक आरएनए बढ़ाना उप nanogram आरएनए सामग्री 9 शुरू करने से माइक्रोग्राम स्तर तक सुधार किया गया है। वहाँ कई वाणिज्यिक आरएनए प्रवर्धन बाजार पर उपलब्ध किट हैं; हालांकि, अधिक लोकप्रिय अच्छी तरह से विकसित किट ribo-एकल प्राइमर इज़ोटेर्माल प्रवर्धन 10 से जुड़े हुए हैं और T7 प्रमोटर 11 तरीकों संचालित है। सबसे लोकप्रिय antisense शाही सेना प्रवर्धन एक oligo डीटी प्राइमर 5 'अंत 12 पर एक T7 प्रमोटर को जोड़ने के साथ इन विट्रो प्रतिलेखन में उपयोग करता है। इस तकनीक के बाद रैखिक प्रवर्धन च प्रतिनिधि विरोधी भावना टेप के सबसे को बनाए रखने की अनुमति देता हैया सरणियों संकरण 13। इस विधि कुल शाही सेना गोजातीय भ्रूण 8 से निकाले के picogram स्तर बढ़ाना करने के लिए अनुकूलित किया गया है।

यूनिवर्सल उठाना प्रणाली (ULS) लेबलिंग विधि है जो सीधे डीएनए या प्लैटिनम से जुड़े फ्लोरोसेंट रंजक या तो जाती 547 या 647 जाती साथ प्रवर्धित आरएनए को शामिल किया गया, गुआनिन 14 के N7 स्थिति पर एक coordinative बांड बनाने के द्वारा होता है। इस विधि भ्रूण अनुसंधान के क्षेत्र में अनुकूलित किया गया था और अधिक स्थिर संशोधन के बिना प्रवर्धित Arna aminoallyl संशोधित Arna एंजाइमी विधि 15 के द्वारा उत्पन्न की तुलना में उत्पन्न करने के लिए। दोनों एकल डाई और दो रंगों लेबलिंग तरीकों माइक्रोएरे में यूनिवर्सल उठाना प्रणाली का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है। एक बड़ी माइक्रोएरे तुलना अध्ययन एक और दो रंग सरणी प्लेटफार्मों 6 के बीच डेटा की गुणवत्ता का एक अच्छा संबंध है कि नहीं था।

हाल ही में, दोनों T7 प्रमोटर ड्राइवn antisense शाही सेना प्रवर्धन और ULS लेबलिंग तरीकों माइक्रोएरे संकरण 8, 16 के लिए लेबल Arna सामग्री उच्च गुणवत्ता के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न करने के लिए एक और अधिक विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है। इसलिए, इस अध्ययन के एक उदाहरण के रूप में 7 दिन गोजातीय भ्रूण का उपयोग दो रंग माइक्रोएरे में शामिल डेटा विश्लेषण करने के लिए शाही सेना निष्कर्षण से महत्वपूर्ण कदमों में से कुछ को प्रदर्शित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

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Protocol

इस अध्ययन के पशु हिस्सा अलबर्टा, एडमोंटन, कनाडा के विश्वविद्यालय के चयापचय रिसर्च यूनिट में आयोजित किया गया, सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को मंजूरी दी (प्रोटोकॉल # AUP00000131) अलबर्टा पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा के साथ, और जानवरों के लिए परवाह अनुसार पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों के कनाडा परिषद (1993) के लिए।

1. भ्रूण उत्पादन, कुल शाही सेना और DNase उपचार के अलगाव

  1. पशु प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और भ्रूण संग्रह के लिए हमारे पिछले प्रकाशनों 17, 18 में उल्लेख है।
  2. पूल और तरल नाइट्रोजन में प्रत्येक गाय से समान चरण भ्रूण फ्रीज तस्वीर और उसके बाद शाही सेना निष्कर्षण तक डिग्री सेल्सियस -80 में रहते हैं।
  3. एक स्तंभ आधारित शाही सेना निकासी किट जो (किट जानकारी में सामग्री सूची उपलब्ध है) पिको पैमाने पर नमूनों से शाही सेना को निकालने के लिए सक्षम बनाता है के माध्यम से कुल शाही सेना निकालें।
    नोट: अनुशंसित किट शामिल हैं: कंडीशनिंग बफर, निष्कर्षण BufFer, 70% इथेनॉल, धो बफर 1, धो बफर 2, क्षालन बफर, संग्रह ट्यूब और microcentrifuge ट्यूबों के साथ शाही सेना शुद्धि कॉलम।
  4. ट्यूब युक्त भ्रूण को 10 μL निष्कर्षण बफर जोड़ें और 42 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। 2 मिनट के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब microcentrifuge ट्यूब में सेल निकालने इकट्ठा करने के लिए।
  5. शुद्धि स्तंभ फिल्टर झिल्ली पर पिपेट 250 μL कंडीशनिंग बफर। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कंडीशनिंग बफर के साथ शाही सेना शुद्धि स्तंभ सेते हैं। 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर संग्रह ट्यूब में शुद्धि स्तंभ अपकेंद्रित्र।
  6. पिपेट आरएनए निष्कर्षण बफर और भ्रूण के मिश्रण में 70% इथेनॉल के 10 μL। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। preconditioned शुद्धि स्तंभ में पिपेट मिश्रण।
  7. 100 XG पर शाही सेना, सेंट्रीफ्यूज शुद्धि स्तंभ बाध्य करने के लिए 2 मिनट के लिए और तुरंत माध्यम से प्रवाह को हटाने के लिए 30 एस के लिए 16,000 XG पर एक centrifugation द्वारा पालन करें।
  8. पिपेट 10081; शुद्धि स्तंभ और 8000 x जी 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में धो बफर 1 के एल।
    नोट: DNase उपचार यदि शाही सेना के अलगाव के बाद रिवर्स प्रतिलेखन या प्रवर्धन प्रदर्शन की सिफारिश की है।
  9. सही कदम 1.8 के बाद जीनोमिक डीएनए डाइजेस्ट।
    नोट: अनुशंसित DNase किट में सामग्री सूची उपलब्ध है। अनुशंसित किट शामिल हैं: DNase मैं शेयर समाधान और बफर।
  10. 5 35 μL बफर के साथ μL DNase मैं शेयर समाधान के मिश्रण से DNase ऊष्मायन मिश्रण तैयार करें। धीरे inverting द्वारा मिक्स।
  11. 40 μL DNase ऊष्मायन मिश्रण शुद्धि स्तंभ झिल्ली में सीधे पिपेट। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  12. शुद्धि स्तंभ झिल्ली में पिपेट 40 μL धो बफर 1 और फिर 15 S के लिए 8000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  13. शुद्धि स्तंभ और 8000 x जी 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में पिपेट 100 μL धो बफर 2।
  14. शुद्धि स्तंभ और अपकेंद्रित्र में एक और 100 μL धो बफर 2 पिपेटपर 16,000 एक्स जी 2 मिनट के लिए।
  15. एक नया 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब शुद्धि स्तंभ स्थानांतरण। पिपेट 11 सीधे शुद्धि स्तंभ की झिल्ली पर क्षालन बफर के μL। झिल्ली में क्षालन बफर की अधिकतम अवशोषण सुनिश्चित करने के लिए, धीरे जबकि क्षालन बफर वितरण झिल्ली की सतह के लिए पिपेट की नोक स्पर्श करें।
  16. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए स्तंभ सेते हैं। 1,000 XG पर 1 मिनट के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र स्तंभ में क्षालन बफर वितरित करने के लिए है, और फिर elute करने के लिए शाही सेना को 16,000 XG पर 1 मिनट के लिए स्पिन।
  17. निर्माता के निर्देशों आरएनए गुणवत्ता और मात्रा 19 का मूल्यांकन करने के अनुसार bioanalyzer साधन का प्रयोग करें।
  18. -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक शाही सेना के नमूने संग्रहित करें।

2. आरएनए प्रवर्धन और लेबलिंग माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए

नोट: आरएनए प्रवर्धन और लेबलिंग प्रक्रियाओं के साथ काम करने के लिए पहली बार उपयोगकर्ता के लिए, के पांच एनजी का उपयोग आरएनए आलो कील मेंवास्तविक Arna के नमूनों के साथ एनजी शाही सेना प्रवर्धन और संकरण की गुणवत्ता नियंत्रण माप की निगरानी के लिए। कील में शाही सेना मिश्रण दस में इन विट्रो संश्लेषित, polyadenylated पूर्व निर्धारित अनुपात में टेप में शामिल है। जब प्रक्रिया ठीक से प्रदर्शन किया, लेबल टेप विशेष सरणियों में पूरक नियंत्रण जांच करने के लिए केवल संकरण और डेटा न्यूनतम स्वयं या पार संकरण के साथ गुणवत्ता नियंत्रण आश्वासन ट्रैक करने के लिए स्कैन किया जा सकता। अधिक जानकारी के लिए सरणी और डेटा विश्लेषण स्कैनिंग के बाद नुकीला में नियंत्रण तीव्रता और सामान्य प्रक्रिया के संबंध में विवरण पिछले प्रकाशनों 20, 21 का उल्लेख है। निम्नलिखित प्रक्रिया दिनचर्या माइक्रोएरे उपयोगकर्ताओं के लिए दिया जाता है।

  1. 11 μL - 10 की कुल मात्रा में 100 पीजी उच्च गुणवत्ता शाही सेना नमूना (आरएनए वफ़ादारी संख्या (Rin) मूल्य कम से कम> 7.0) तैयार करें।
  2. एक प्रवर्धन किट के लिए सक्षम होने के साथ शाही सेना के नमूने बढ़ानापिको पैमाने पर नमूनों के साथ काम करते हैं (लिटिल 100 के रूप में पीजी के रूप में)।
    नोट: अनुशंसित प्रवर्धन किट जानकारी में सामग्री सूची उपलब्ध है और किसी भी संशोधन के बिना निर्माता के निर्देशों का पालन करती है।
  3. प्रवर्धित Arna के आकार की सीमा की प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति आधारित quantitation का प्रयोग करें।
  4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साधन (260 और 280 एनएम पर absorbance के आधार पर) का उपयोग प्रवर्धित Arna की एकाग्रता को मापने के लिए।
  5. -80 डिग्री सेल्सियस लेबलिंग के लिए तैयार है जब तक पर परिलक्षित Arna स्टोर।
  6. ULS Arna लेबलिंग किट उपयोगकर्ता गाइड के अनुसार फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए परिलक्षित शाही सेना के 2 माइक्रोग्राम का प्रयोग करें।
    नोट: जाती 547 और जाती के बाद से 647 डाई तस्वीर-क्षरण और जाती 647 डाई के प्रति संवेदनशील आसानी से ओजोन द्वारा अपमानित किया जाता है, लेबलिंग प्रक्रिया प्रकाश की एक न्यूनतम राशि में और एक ओजोन मुक्त वातावरण के तहत जगह लेता है।
  7. ओजोन बॉक्स (चित्रा 1 ए) ओजोन के स्तर तक चालू करें 0.001 पीपीएम है।
    8. (चित्रा 1 बी) के अंदर प्रतिक्रिया स्थापना करना, और फिर एक अंतिम safelight तहत RNase मुक्त पानी के साथ 20 μL की मात्रा को समायोजित करें। प्रकाश स्रोत के लिए darkroom फ़िल्टर जोड़ें।
  8. धीरे मिक्स और 15 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर एक thermocycler में ट्यूबों सेते हैं। कम से कम 1 मिनट के लिए बर्फ पर जगह नमूने हैं। शाही सेना निकासी किट के साथ आगे बढ़ने DNase उपचार (1.9 से 1.11 के लिए) से संबंधित कदम को छोड़कर पहले ट्यूब की सामग्री इकट्ठा करने के लिए नीचे स्पिन, CY-डाई-लेबल परिलक्षित आरएनए को साफ करने के लिए।
  9. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साधन का प्रयोग करने के लिए उपाय और लेबल परिलक्षित शाही सेना की एकाग्रता का निर्धारण और उपयोग करने से पहले 3 दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस अधिकतम पर लेबल Arna रखने के लिए।

3. माइक्रोएरे संकरण और धुलाई

नोट: निम्न महत्वपूर्ण कदम दो रंग माइक्रोएरे आधारित जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण प्रोटोकॉल के अनुसार अनुकूलित कर रहे हैं (संस्करण6.5 मई 2010)।

  1. प्रत्येक जाती 547- और जाती 647 लेबल Arna से एनजी 825 के बराबर राशि जोड़ें और 25x विखंडन और 10x अवरुद्ध buffers के साथ मिश्रण।
  2. 15 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण गर्मी और 1 मिनट के लिए बर्फ पर शांत।
  3. 2x संकरण बफर के बराबर राशि जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
  4. 13,000 rpm पर अपकेंद्रित्र, तो मिश्रण संकरण के लिए तैयार है।
  5. सरणी स्लाइड पर मिश्रण से 100 μL लोड और संकरण कक्ष के अंदर स्लाइड सील।
  6. 65 डिग्री सेल्सियस पर 17 घंटे के लिए संकरण ओवन में इकट्ठे चैम्बर लोड ओवन में 10 rpm पर घूर्णन।
  7. स्थिरीकरण में सूई और 30 एस के लिए समाधान सुखाने के द्वारा ओजोन संरक्षण उपचार के साथ प्रोटोकॉल के अनुसार सरणियों धो लें।
  8. समाधान से सरणियों निकालें और कोई धूल कणों के साथ यकीन है कि सरणी सतह सूखी है

4. स्कैनिंग माइक्रोएरे स्लाइड

  1. अंधेरी जगह में सरणियों रखें और scann पर बारीएर जब तक इसका इस्तेमाल करने के लिए तैयार है (15 मिनट इंतजार के समय)।
  2. छोड़ दिया पर लोड सरणी बारकोड, स्कैनर में और स्कैनिंग शुरू करते हैं। सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता गाइड के अनुसार मौके विश्लेषण करते हैं और (जीपीआर) फ़ाइल स्वरूप के रूप में डेटा को बचाने के।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. FlexArray सॉफ्टवेयर http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php "आयात कच्चे डेटा" पर क्लिक करें और FlexArray में जीपीआर फ़ाइलों को लोड करें।
  2. यदि आवश्यक अनुदेश का पालन करते हुए सामान्य बनाने और सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं। नोट: इस अध्ययन में सकारात्मक स्थान चयन के लिए सीमा की गणना के रूप में यह पहले से 22 में वर्णित किया गया था।
  3. सभी संकरित धब्बे और पृष्ठभूमि संकेतों को देखना FlexArray की साजिश दर्शक से मार्गदर्शन ड्रॉप डाउन का चयन करें। नोट: माइक्रोएरे संकरण के बाद नियंत्रण में नुकीला की एक ऐसी ही तस्वीर पिछले अध्ययन 8 में देखा जा सकता है।
  4. एक चयन करेंसरणी के भीतर लेस सामान्य बनाने FlexArray से सरणियों सामान्य बनाने की प्रक्रिया के बीच एक quantile द्वारा निम्न तदनुसार मैनुअल ड्रॉप डाउन।
  5. आगे उपयोग के लिए दायर एक एक्सेल में FlexArray से सभी सामान्यीकृत डेटा निर्यात करें।

6. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

गोजातीय भ्रूण-विशिष्ट टेप से जांच दृश्यों के मूल एनोटेशन (BESTv1) माइक्रोएरे पहले 8 वर्णित किया गया है। वर्तमान अध्ययन में, 20,403 अद्वितीय जीन चिह्न (जीएस) (प्राप्त किया गया अनुपूरक File1 ) EmbryoGENE प्रयोगशाला सूचना प्रबंधन प्रणाली (LIMS) Elma (http://elma.embryo-gene.ca) के माध्यम से। 6765 अनूठी जीन (की एक सूची अनुपूरक File2 ) चुना गया था और माइक्रोएरे सामान्य बनाने की प्रक्रिया के बाद सभी सकारात्मक संकेतों (चरण 5 के लिए corresponded.5) गोजातीय 7 दिन भ्रूण जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल से। सकारात्मक संकेत सीमा एक एक मूल्य के संकेत तीव्रता से प्रवेशक प्रकाशन 16 के आधार पर गणना की गई।

  1. (विकास के संबंधों के माध्यम से प्रोटीन विश्लेषण) पैंथर के साथ कार्यात्मक विश्लेषण करने के लिए वर्गीकरण प्रणाली 23, 24, नीचे दिए गए लिंक (http://www.pantherdb.org/about.jsp) खुला।
  2. सांख्यिकीय overrepresentation परीक्षण का उपयोग भ्रूण के विकास के दौरान विशिष्ट जैविक प्रक्रिया की पहचान करने और संदर्भ सूची 25 के रूप में बोस वृषभ की डिफ़ॉल्ट सेटिंग (डेटाबेस में सभी जीनों) का उपयोग करने के लिए 6765 भ्रूण-विशिष्ट जी एस की एक सूची अपलोड करें।
    नोट: यह जाने कि सांख्यिकीय दृष्टि से अधिक या कम-से व्यक्त एक द्विपद परीक्षण का उपयोग कर रहे हैं से विकास से संबंधित प्रक्रियाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है।
  3. <0.05 पर पी-मूल्य सीमा सॉफ्टवेयर डिफ़ॉल्ट के रूप में सेट करें। डेटा डाउनलोड किया जा सकता और प्रदर्शनीआगे चयन 16 के लिए एक्सेल फाइल में rted।

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Representative Results

कुल शाही सेना और 7 दिन गोजातीय भ्रूण से परिलक्षित Arna का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में दिखाया गया है और तालिका 1 में संक्षेप।

आरएनए अखंडता और प्रोफ़ाइल आरएनए निकासी के बाद का आकलन किया जा सकता है। शाही सेना की गुणवत्ता के आकलन bioanalyzer साधन (चित्रा 3 ए) और केवल RIN मूल्य के साथ उन नमूनों की तुलना में अधिक 7.0 प्रवर्धन (तालिका 1) के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए योग्य हैं के द्वारा किया जा सकता है।

गुणवत्ता और प्रवर्धित शाही सेना की मात्रा प्रवर्धन के बाद मूल्यांकन किया जाना चाहिए। प्रवर्धित आरएनए प्रोफ़ाइल और उचित आकार सीमा की समानता गुणवत्ता नियंत्रण (चित्रा 3 बी) के लिए मुख्य कारक हैं। दो दौर प्रवर्धन के बाद, प्रवर्धित शाही सेना के टुकड़े आकार में बहुत समान हैं, 200 और 800 के बीच बीपी (चित्रा 3 बी) लेकर औरसमान आकार रेंज के सभी अरनास आगे प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए चुने गए हैं। इसके अलावा, मूल कुल शाही सेना के एक सफल प्रवर्धन Arna (तालिका 1) के कम से कम एक हजार से अधिक गुना वृद्धि निकलेगा।

प्रतिदीप्ति लेबलिंग दक्षता लेबलिंग अनुपात की डिग्री के अनुसार गणना की जा सकती है। सूत्र ULS Arna लेबलिंग किट उपयोगकर्ता के गाइड में उपलब्ध है। , 3.6% का संकेत है कि 1 के एक औसत - - उपयोगकर्ता गाइड का सुझाव लेबलिंग अनुपात की डिग्री 1.0 होना चाहिए 100 न्यूक्लियोटाइड प्रति 3.6 ULS अणुओं।

संकरण और स्कैनिंग के बाद छवि फ़ाइलों FlexArray से देखी जा सकती है। माइक्रोएरे संकरण और धोने के बाद एक अच्छी गुणवत्ता स्कैन की गई छवि चित्रा -4 ए में दिखाया गया है। लेबल सामग्री कम या इस सीमा से अधिक कर रहे हैं, संकेतों का पता लगाने के लिए या उच्च स्तर पृष्ठभूमि scanni के बाद पता लगाया जाएगा बहुत कम हो जाएगाएनजी (चित्रा 4 बी)।

वर्तमान अध्ययन में, सकारात्मक संकेत सीमा 7.6 (जांच संकेत 7.6 या पृष्ठभूमि <7.6 सकारात्मक माना जाता से अधिक) में स्थापित किया गया था। लगभग जांच सेट 20,826 सकारात्मक स्पॉट का प्रतिनिधित्व करने के 46% गोजातीय 7 दिन भ्रूण (चित्रा 5) में लाल रंग में संकेत कर रहे हैं। unannotated और डुप्लिकेट जीन प्रतीकों को हटाने के बाद, केवल 6765 अनूठी जीन प्रतीकों PANTHER विश्लेषण के लिए छोड़ दिया है।

ये 6765 जीनों 7 दिन गोजातीय ब्लास्टोसिस्ट में व्यक्त अद्वितीय शाही सेना टेप प्रतिनिधित्व करते हैं। आदेश में जैविक प्रक्रिया गोजातीय ब्लास्टोसिस्ट के लिए विशिष्ट लगता है, पैंथर overrepresentation टेस्ट किया जाता है। शीर्ष 10 जीन (जाओ) आंटलजी उच्चतम गुना संवर्धन सूचकांक के साथ अवधि आईडी (चित्रा 6) का चयन किया गया है। सामान्य में, इन विशिष्ट जाओ शर्तों को काफी हद तक इस तरह के mitosi के रूप में सक्रिय सेलुलर विभाजन की प्रक्रिया का प्रतिनिधित्वऔर गुणसूत्र अलगाव, सेल चक्र और cytoplasmic और mitochondrial अनुवाद की दीक्षा का विनियमन।

आकृति 1
चित्रा 1: ओजोन-मुक्त बॉक्स (ए) और ऐरे लेबलिंग प्रतिक्रिया (बी)। ए) ओजोन फ्री बॉक्स एक उत्प्रेरक कनवर्टर इकाई है जो हवा recycles और ओजोन और एक बेहद संवेदनशील सेंसर ओजोन माइक्रोएरे प्रदर्शन के दौरान बॉक्स के अंदर ओजोन स्तर पर नजर रखने के लिए नष्ट कर देता है के होते हैं। बी) लेबलिंग प्रक्रिया और सरणी संकरण बॉक्स के अंदर प्रदर्शन ओजोन द्वारा फ्लोरोसेंट जाती 647 डाई गिरावट से बचने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: PANTHER जीन सूची विश्लेषण। लाल तीर से संकेत मिलता क्षेत्र भरे जाने की जरूरत है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: कुल शाही सेना के एक प्रतिनिधि Bioanalyzer electropherogram (ए) और प्रवर्धित आरएनए (बी) की जेल छवि। ए) RIN मूल्य, आरएनए एकाग्रता और rRNA अनुपात के साथ समग्र परिणाम दिखा रहा है। बी) के दो दौर के बाद प्रवर्धन परिलक्षित शाही सेना के प्रोफ़ाइल। प्रवर्धित शाही सेना के टुकड़े 200 और 800 बीपी के बीच एक दायरे में रहने की उम्मीद कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: ऐरे तीव्रता मानचित्र की छवि। (ए) दिखा हरे और लाल चैनल उच्च स्थान तीव्रता (नीले, हरे रंग के साथ छोड़ दिया पर संकेत दिया) और कम पृष्ठभूमि के साथ स्कैनिंग के बाद 547 और 647 जाती संकेतों जाती के अनुरूप एक सरणी स्लाइड की एक अच्छी छवि (गहरे नीले रंग के साथ सही पर संकेत रंग)। (बी) के एक सरणी स्लाइड की एक खराब छवि लाल चैनल से बहुत अधिक पृष्ठभूमि छवि दिखा (647 जाती मौके तीव्रता की छवि से समान नीले हरे रंग के साथ ऊपरी पैनल से संकेत)। रंग चार्ट अलग अलग रंग के लिए इसी संख्यात्मक मूल्यों के साथ संकेत की तीव्रता को इंगित करता है। संकेत तीव्रता का मूल्य गहरे नीले रंग की रेंज में सबसे कम है। एक बड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की आर संस्करण।

चित्रा 5
चित्रा 5: 7 दिन गोजातीय भ्रूण जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल के लिए एमए प्लॉट। 20,826 लाल धब्बे पृष्ठभूमि संकेतों के ऊपर सकारात्मक संकेतों का प्रतिनिधित्व किया। पृष्ठभूमि धब्बे काले रंग में डाला जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: उच्चतम गुना संवर्धन सूचकांक के साथ शीर्ष 10 जीन (जाओ) आंटलजी टर्म आईडी। ये विशिष्ट जाओ शर्तों को काफी हद तक इस तरह के बँटवारा और गुणसूत्र अलगाव, सेल चक्र के विनियमन और दीक्षा के रूप में सक्रिय सेलुलर विभाजन की प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व cytoplasmic और mitochondrial ट्रांसआबादी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना भ्रूण की संख्या प्रकार भ्रूण रूपात्मक गुणवत्ता आरएनए एकाग्रता (पीजी / μL) RIN प्रवर्धन के लिए खेतों में कुल शाही सेना (पीजी) प्रवर्धित आरएनए एकाग्रता (एनजी / μL)
एस 1 4 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 और 2 101 8.6 858.5 3498.4
S2 1 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 2 142 7.4 1207 1682.4 S3 2 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 135 8.8 1147.5 3185.3
एस 4 3 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 177 9 1504.5 2906.4
S5 5 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 636 8.3 5406 3437.5
S6 3 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 और 2 159 9.1 1351.5 1689.8
S7 3 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 154 9 1309 4507.1
S8 4 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 304 8.5 2584 3089.3
S9 5 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 282 9.1 2397 3917.8
S10 6 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 और 2 374 9.4 3179 2979
S11 5 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 272 9.3 2312 2576
S12 3 ब्लास्टोसिस्ट ग्रेड 1 206 9 1751 2567.9

तालिका 1: नमूना और आरएनए जानकारी। एकाग्रता और शाही सेना की गुणवत्ता निकासी के बाद मूल्यांकन किया जाना चाहिए। आरएनए अखंडता और एकाग्रता किसी भी bioanalyzer द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। आरएनए अखंडता नंबर 7.0 से अधिक होना चाहिए। आरएनए एकाग्रता प्रवर्धन के बाद स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साधन द्वारा जांच की जानी चाहिए। Embryओ गुणवत्ता अंतरराष्ट्रीय भ्रूण स्थानांतरण सोसायटी के मैनुअल के अनुसार मूल्यांकन किया गया था (3 एड।, सेवॉय, आईएल)।

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Discussion

पहली समस्या 7 दिन गोजातीय भ्रूण का उपयोग जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए उच्च गुणवत्ता शाही सेना की पर्याप्त मात्रा में नहीं मिल रहा है माइक्रोएरे विश्लेषण करने के लिए। पारंपरिक फिनोल / क्लोरोफॉर्म आरएनए निष्कर्षण और इथेनॉल विधि 7 दिन भ्रूण के लिए सिफारिश नहीं है, कम उपज और संभव बचे हुए फिनोल बाधा आरएनए प्रवर्धन प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप। इसके बजाय, एक मानक स्तंभ आधारित पद्धति कुल शाही सेना को अलग करने के लिए और फिर न्यूनतम क्षालन बफर एकाग्रता बढ़ाने के लिए के साथ शाही सेना elute बेहतर है। भ्रूण प्रति कुल शाही सेना के 780 पीजी की एक औसत वर्तमान अध्ययन है जो एक समान कार्यप्रणाली 26 और एक ही शाही सेना निकासी किट 27, 28 वर्तमान में प्रयोग किया जाता है का उपयोग अन्य रिपोर्ट के साथ तुलनीय है में प्राप्त की है। शाही सेना निष्कर्षण के लिए, यह अच्छी तरह से मिश्रण से उपयोग करें या फिर से भंग करने की निकासी बफर से पहले निकासी बफर शीशी को गर्म करने के वेग से पहले भंग करने की सिफारिश की हैउपयोग करने के लिए। इसके अलावा, ऊष्मायन समय भी निकासी कदम में शाही सेना उपज के लिए महत्वपूर्ण है। ऊष्मायन समय 42 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्ण 30 मिनट से भी कम समय शाही सेना उपज कम हो।

स्तंभ पर DNase पाचन कुल शाही सेना शुद्धि के दौरान जीनोमिक डीएनए संक्रमण को दूर करने के लिए आवश्यक है। DNase एंजाइम भंवर और सेंट्रीफ्यूज के लिए बहुत संवेदनशील है। इसलिए, DNase और बफर धीरे inverting से मिलाया जाना चाहिए।

शाही सेना की गुणवत्ता माइक्रोएरे विश्लेषण और एक RIN के साथ नमूनों में बहुत महत्वपूर्ण से कम 7 संकरण के लिए विचार नहीं किया जाना चाहिए। वर्तमान अध्ययन में, कुल शाही सेना bioanalyzer द्वारा प्राप्त प्रोफाइल गोजातीय ब्लास्टोसिस्ट्स 26, 27 से पढ़ाई में पहले से मनाया उन लोगों के लिए समान हैं। उल्लेखनीय यह है कि जब पूर्व रची भ्रूण उपयोग के लायक है, विशेष रूप से oocytes और भ्रूण भ्रूण संक्रमण के लिए मातृ पहले से तैयार आरएनए, Rin मूल्य अक्सर तुलना में 7 से कम है7 दिन भ्रूण से कुल शाही सेना और इस के लिए 28S / 18S rRNA अनुपात 27 में एक भिन्नता की वजह से है।

गोजातीय भ्रूण से निकाले शाही सेना की राशि मंच संकरण के लिए पर्याप्त नहीं है, इसलिए, आरएनए प्रवर्धन की आवश्यकता है। वहाँ कई ऐसे पीसीआर प्रवर्धन रूप में शाही सेना के लिए उपलब्ध तरीके हैं, इन विट्रो प्रतिलेखन (IVT), और ribo-SPIA (एकल प्राइमर इज़ोटेर्माल प्रवर्धन)। हालांकि बाद विधि तेजी से होता है और एक दिन में सरणियों के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करता है, यह आवश्यक कम से कम 5 सामग्री 29 से शुरू होने के रूप में एनजी। इसलिए, हम IVT विधि है जो कम मूल्य उस सामग्री 12 के साथ काम करने में सक्षम है (छोटी सी के रूप में 100 पीजी) के रूप में चुना है। इसके अलावा, यह पहले से ही कुल शाही सेना गोजातीय भ्रूण सफलतापूर्वक 29 से निकाला बढ़ाना परीक्षण किया गया है। वर्तमान अध्ययन में, हमारे प्रवर्धन विधि उत्पादित ~ 28 माइक्रोग्राम प्रति भ्रूण परिलक्षित आरएनए भ्रूण प्रति 598 पीजी कुल शाही सेना से। additionally, दो दौर प्रवर्धन के बाद, हमारे नमूने एक समान प्रोफ़ाइल और उचित आकार रेंज है जो पिछले अध्ययनों 13, 15 के साथ समझौता कर रहे हैं (200 और 800 के बीच बीपी) से पता चला।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक गैर एंजाइमी लेबलिंग प्रोटोकॉल, प्लेटिनम से जुड़े जाती (547 जाती है और जाती 647) रंगों का इस्तेमाल किया। इस विधि को परिलक्षित या गैर प्रवर्धित शाही सेना की लेबलिंग की अनुमति देता है। लेबलिंग से पहले होने प्रवर्धन कदम प्राकृतिक न्यूक्लियोटाइड का उपयोग कर की अनुमति देता है, प्रवर्धित आरएनए अधिक पैदावार के लिए अग्रणी, पूर्वाग्रह को कम करने और एंजाइमी विधि की तुलना में लंबे समय तक टुकड़े उत्पन्न करते हैं। जाती 547 और 647 जाती रंगों आम फ्लोरोसेंट रंगों दो रंग सरणी के लिए सिफारिश कर रहे हैं। हालांकि, जाती 647 डाई ओजोन क्षरण के प्रति संवेदनशील है। हाथ आयोजित ओजोन की निगरानी 2 पीपीबी से नीचे यकीन है कि ओजोन का स्तर बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, धूल मुक्त वातावरण संकरण समाधान में या ड्यूरिन गिरने धूल के कणों से बचने के लिए आवश्यक हैजी स्कैनिंग।

माइक्रोएरे प्रयोग एक या दो रंग दृष्टिकोण में बनाया जा सकता है। प्रत्येक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण कुछ फायदे और नुकसान है। दो रंग डिजाइन का उपयोग परिवर्तनशीलता और पृष्ठभूमि शोर कम कर देता है, प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है और पाश के लिए एक आम संदर्भ नमूना परिभाषित करने के साथ डिजाइन। डाई-विशिष्ट पूर्वाग्रहों काफी परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं हालांकि जब प्रयोगों दो रंग डिजाइन का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं, इन पूर्वाग्रहों डाई स्वैप के प्रदर्शन से कम किया जा सकता है। इस तरह के तकनीकी प्रतिकृति प्रयोगात्मक लागत के लिए कहते हैं, लेकिन अंतर अभिव्यक्ति 31 को मापने में दोनों सटीकता और संवेदनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं।

अन्य जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर (जैसे गोरिल्ला के रूप में) PANTHER संदर्भ के रूप में बोस वृषभ जीनोम के साथ डाटासेट की तुलना की अनुमति देता करने के लिए की तुलना करें। हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि 7 दिन गोजातीय भ्रूण विकास के दौरान जैविक घटकों के बाद और कार्यों शामिल कर रहे हैं: metaphase / anap के विनियमनसेल चक्र के HASE संक्रमण, mitotic metaphase / anaphase संक्रमण के विनियमन, गुणसूत्र अलगाव के विनियमन, mitochondrial अनुवाद, प्रोटीन K48 से जुड़े ubiquitination, ईआर पुटिका की मध्यस्थता परिवहन, परमाणु लिखित mRNA catabolic प्रक्रिया, ट्रांसलेशनल दीक्षा, mitotic बहन chromatid अलगाव Golgi करने के लिए , mitotic परमाणु विभाजन।

सरणियों की स्कैनिंग को परिलक्षित शाही सेना के फ्लोरोसेंट लेबलिंग से इस अखबार में प्रस्तुत प्रोटोकॉल, ऊपर पर्यावरणीय कारकों के अतिरिक्त जागरूकता उच्च गुणवत्ता वाले डेटा को बनाए रखने के साथ निष्पादित किया जाना चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PicoPure RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT0204
RNase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit Applied Biosystems KIT0505
2100 Bioanalyzer Instruments Agilent Technologies G2940CA
RNA Screen Tape Agilent Technologies 5067-5576
ULS Fluorescent Labeling Kit Kreatech Diagnostics EA-021
Custom Gene Expression Microarrays Agilent Technologies G2514F
Agilent Gene Expression wash buffer 1 Agilent Technologies Part #5188-5325
Agilent Gene Expression wash buffer 2 Agilent Technologies Part #5188-5326
2x Hi-RPM Hybridization buffer Agilent Technologies  Part #5190-0403
25x Fragment buffer Agilent Technologies Part #5185-5974
10x GE Blocking Agent Agilent Technologies Part #5188-5281
Stabilization and drying solution Agilent Technologies  Part #5185-5979
Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy Agilent Technologies G2524-60012 Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide
Two-Color RNA Spike-In Kit Agilent Technologies  Cat# 5188-5279
GenePix 4000B array scanner Molecular Devices GENEPIX 4000B-U
Ozone Free Box BioTray OFB_100x200
GAL file Agilent Technologies -

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 119 भ्रूण आरएनए प्रवर्धन शाही सेना लेबलिंग दो रंग माइक्रोएरे ओजोन मुक्त वातावरण गोजातीय
के Transcriptome प्रोफाइलिंग<em&gt; इन विवो</em&gt; उत्पादित गोजातीय पूर्व आरोपण भ्रूण दो रंग माइक्रोएरे प्लेटफार्म का उपयोग
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