Introduction
Tidlig embryo tap i høye produserende melkekyr er en av hovedutfordringene i meieriindustrien 1, 2. Bovine har blitt en interessant modell for å studere human preimplantation embryo utvikling på grunn av deres tilsvarende utviklingsprosess 3, 4. Men mer forskning er nødvendig for å få bedre forståelse om gener involvert i storfe tidlig embryoutvikling.
Etter tjue år siden den første mikromatriseteknologi utviklet i 1995 fem, utvikling av mer sofistikerte sonde fabrikasjon teknologi reduserte trykkfeil og variasjon av Array chips innen og mellom ulike microarray plattformer 6. Forbedret mikromatriseteknologi resulterte i et allment bruk av denne teknologien i klinisk forskning 7 og mer nylig, tidlig embryo qKVALITET vurdering 8.
Den store mengden av nødvendig materiale for microarray-teknologi er den viktigste årsaken til at mikromatriseteknologi i utgangspunktet ikke klarte å legge inn en rekke forskningsfelt som tidlig embryoutvikling. Mer nylig har RNA amplifikasjonsmetoder blitt forbedret for å forsterke lineært RNA opp til mikrogram nivå fra sub-nanogram RNA utgangsmateriale 9. Det finnes flere kommersielle RNA forsterkersett er tilgjengelig på markedet; derimot, er de mer populære velutviklet kits relatert til Ribo-Single Primer Isoterm Amplification 10 og T7 promoter drevet 11 metoder. Den mest populære antisense RNA forsterkning bruker in vitro transkripsjon med en oligo dT primer koble til en T7 promoter på 5 'enden 12. Denne teknologien gjør det mulig å opprettholde mest mulig av representative anti-sense transkripsjoner etter lineær forsterkning feller arrays hybridisering 13. Denne metode er blitt tilpasset for å forsterke pikogram nivå av total RNA ekstrahert fra bovine embryo 8.
Universal hydraulikksystem (ULS) er merking metode som direkte omfatter DNA eller forsterkes RNA med platina bundet fluorescerende fargestoff enten cyanine 547 eller cyanine 647, ved å danne en koordinerende bånd på N7 posisjonen av guanin 14. Denne metoden ble tilrettelagt i embryo forskning for å generere mer stabil forsterket Arna uten forbehold i forhold til aminoallyl modifisert Arna generert ved enzymatisk metode 15. Både enkelt fargestoff og to fargestoffer merkemetoder er tilpasset bruker Universal hydraulikksystem i microarray. En stor microarray sammenligninger studien var at det er en god korrelasjon av datakvalitet mellom en- og to-farge matriseplattformer 6.
Nylig har både T7 promoter stasjonn antisens RNA forsterker og ULS merkingsmetoder er blitt utviklet for å tilveiebringe en mer pålitelig protokoll for å generere en tilstrekkelig mengde av høy kvalitet merket Arna materialer for microarray hybridisering 8, 16. Derfor denne studien gir en protokoll for å demonstrere noen av de viktige skritt fra RNA ekstraksjon til dataanalyse involvert i to farger microarray hjelp Dag 7 storfe embryoer som et eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyret del av denne studien ble gjennomført ved Metabolsk Research Unit ved University of Alberta, Edmonton, Canada, med alle dyre eksperimentelle prosedyrer godkjent (protokoll # AUP00000131) ved University of Alberta Animal Care og bruk komité, og dyr omsorg i henhold til den kanadiske Council of Animal Care retningslinjer (1993).
1. Embryo Produksjon, Isolering av Total RNA og DNase behandling
- For dyre eksperimentelle protokoller og embryoinnsamlings se i våre tidligere publikasjoner 17, 18.
- Basseng og knipse fryse lignende scene embryoer fra hver ku i flytende nitrogen og deretter holde ved -80 ° C til RNA ekstraksjon.
- Pakk total RNA via en kolonne-basert RNA ekstraksjon kit som gjør det mulig å trekke ut RNA fra pico-skjellprøver (kit informasjon er tilgjengelig i Material List).
MERK: Anbefalt kit inneholder: Badekar Buffer, Utvinning Buffer, 70% etanol, Wash Buffer 1, Wash Buffer 2, elueringsbuffer, RNA rensing kolonner med samling rør og mikrosentrifugerør. - Tilsett 10 mL Ekstraksjon buffer til rør inneholdende embryoer og inkuberes i 30 min ved 42 ° C. Sentrifugerør ved 800 xg i 2 min for å samle celleekstrakt inn i mikrosentrifugerør.
- Pipetter 250 ul Buffer Conditioning på rensekolonnen filtermembranen. Inkuber RNA-rensekolonnen med Conditioning buffer i 5 min ved romtemperatur. Sentrifuger rensekolonnen i oppsamlingsrøret ved 16.000 x g i 1 min.
- Pipetter 10 ul av 70% etanol i en blanding av RNA-ekstraksjon buffer og embryoer. Bland godt ved å pipettere opp og ned. Pipetter blandingen i forbehandlet rensekolonnen.
- For å binde RNA, sentrifuger rensekolonnen i 2 minutter ved 100 xg og umiddelbart følger etter en sentrifugering ved 16 000 xg i 30 s for å fjerne strømme gjennom.
- Pipetter 10081; L vaskebuffer 1 inn i rensekolonnen og sentrifuger i 1 min ved 8000 x g.
MERK: DNase-behandling anbefales hvis du utfører revers transkripsjon eller forsterkning etter RNA isolering. - Fordøye genomisk DNA rett etter trinn 1.8.
MERK: Anbefalt DNase kit er tilgjengelig i Material List. Anbefalt Settet inneholder: DNase I stamløsning og buffer. - Forbered DNase inkubasjon blanding ved å blande 5 mL DNase jeg lager løsning med 35 mL buffer. Bland forsiktig snu.
- Pipetter 40 ul DNase inkubasjonsblandingen direkte inn i rensekolonnen membranen. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Pipetter 40 ul vaskebuffer 1 inn i rensekolonnen membran og deretter sentrifuger ved 8000 xg i 15 sek.
- Pipetter 100 ul vaskebuffer 2 inn i rensekolonnen og sentrifuger i 1 min ved 8000 x g.
- Pipetter en annen 100 ul vaskebuffer 2 inn i rensekolonnen og sentrifugeri 2 minutter ved 16000 x g.
- Overføre rensekolonnen i et nytt 0,5 ml mikrosentrifugerør. Pipetter 11 ul elueringsbuffer direkte på membranen av rensekolonnen. For å sikre maksimal absorpsjon av elueringsbuffer inn i membranen, forsiktig berøre spissen av pipetten til overflaten av membranen, mens utleverings elueringsbufferen.
- Inkuber kolonnen i 1 minutt ved romtemperatur. Sentrifuger kolonnen i 1 min ved 1000 x g for å fordele elueringsbuffer i kolonnen, og så spinne i 1 min ved 16 000 x g for å eluere RNA.
- Bruk Bioanalyzer instrument i henhold til produsentens instruksjoner for å evaluere RNA kvalitet og kvantitet 19.
- Oppbevar RNA prøven ved -80 ° C inntil bruk.
2. RNA Amplification og merking for microarray analyse
MERK: For første gang bruker å jobbe med RNA forsterkning og merking prosedyrer, bruker fem ng av spike-in RNA along med selve Arna prøvene for å overvåke kvaliteten kontrollmåling av RNA amplifisering og hybridisering. Den spike-in RNA mix inneholder ti in vitro syntetisert, polyadenylerte transkripsjoner i forhåndsbestemte forhold. Når prosedyren utføres riktig, de merkede transkripsjoner spesifikt hybridiserer bare til utfyllende kontroll sonder i matriser og dataene kan skannes for å spore kvalitetskontroll kvalitetssikring med minimal selv eller kryss-hybridisering. Flere detaljer beskrivelse om nagler i kontroll intensiteter og normalisering prosedyre etter skanning av matrise og dataanalyse er å henvise til tidligere publikasjoner 20, 21. Følgende prosedyre er gitt til de rutinemessige microarray brukere.
- Forbered 100 pg av høy kvalitet RNA-prøve (RNA Integrity nummer (RIN) verdi på minst> 7,0) i et totalt volum på 10 - 11 ul.
- Amplifisere RNA prøver med et forsterkersett å kunnejobbe med pico-skjellprøver (så lite som 100 pg).
MERK: Anbefalt forsterkersett informasjon er tilgjengelig i materialliste og følger produsentens instruksjoner uten modifisering. - Bruk en fluorescens-basert kvantifisering for å evaluere profilen av størrelsesområde av det forsterkede Arna.
- Bruk spektrofotometeret instrument (basert på absorbansen ved 260 og 280 nm) for å måle konsentrasjonen av det amplifiserte Arna.
- Oppbevar forsterket Arna ved -80 ° C til de er klare for merking.
- Bruk to mikrogram forsterket RNA for fluorescerende merking i henhold til ULS Arna merking kit brukerhåndboken.
Merk Fordi cyanin 547 og 647 cyanin fargestoff er følsomme for foto-nedbrytning og cyanin 647 fargestoff er lett brytes ned av ozon, tar merkningsmetode sted i en minimal mengde av lys og under en ozonfritt miljø. - Slå på ozon boksen (figur 1A) inntil nivået av ozon er 0.001 ppm.
- Bland forsiktig og inkuber rørene i en thermocycler ved 85 ° C i 15 min. Plasser prøvene på is i minst ett min. Spinn ned for å samle innholdet i rørene før du fortsetter med RNA ekstraksjon kit, unntatt skritt i forbindelse med DNase-behandling (1,9 til 1,11), for å rydde opp i Cy-dye-merket forsterket RNA.
- Bruk spektrofotometeret instrument for å måle og bestemme konsentrasjonen av merket amplifisert RNA og holde den merkede Arna ved -80 ° C maksimum i 3 dager før bruk.
3. Microarray Hybridisering og Vask
MERK: Følgende viktige skritt er tilpasset i henhold til to-farge microarray-baserte Gene Expression Analysis Protocol (versjon6.5, mai 2010).
- Legg lik mengde 825 ng fra hvert cyanine 547- og cyanine 647-merket Arna og bland med 25x fragmentering og 10x blokkerer buffere.
- Oppvarm blandingen til 60 ° C i 15 min og avkjøl på is i 1 minutt.
- Legg til en lik mengde av 2 x hybridiseringsbuffer og bland godt.
- Sentrifuger ved 13.000 rpm, hvoretter blandingen er klar for hybridisering.
- Last 100 mL fra blandingen på tabellen lysbilde og forsegle raset inne i hybridisering kammeret.
- Laster den monterte kammeret og inn i ovnen hybridisering i 17 timer ved 65 ° C som roterte med 10 opm i ovnen.
- Vask arrays i henhold til protokoll med ozon beskyttelse behandling ved dypping i stabilisering og tørking løsning i 30 s.
- Fjern arrays fra løsningen og sørge for at matrisen overflaten er tørr uten støvpartikler
4. Skanning Microarray Slide
- Hold arrays i mørkt sted og slå på SCANNer før den er klar til bruk (15 min ventetid).
- Last matrisen strekkoden på venstre, inn i skanneren og begynne å skanne. Gjør stedet analyse i henhold til programvaren bruksanvisningen og lagre data (GPR) filformat.
5. Statistisk analyse
- Last ned FlexArray programvare http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Klikk på "import rådata" og laste GPR-filer til FlexArray.
- Utfør normalisering og statistisk analyse om nødvendig ved å følge instruksjonene. Merk: Beregn terskelen for positiv flekk utvalget i denne studien som det ble beskrevet tidligere 22.
- Velg rullegardin håndboken fra tomten betrakteren av FlexArray å vise alle de hybridiserte flekker og bakgrunnssignaler. Merk: Et lignende bilde av piggete i kontrollene etter hybridisering til microarray kan sees i forrige undersøkelse 8.
- Velg enLøss normalisering innen matrise følgende av en quantile mellom arrays normaliseringsprosessen fra FlexArray falle ned manualen tilsvarende.
- Eksportere alle de normaliserte data fra FlexArray i en Excel-fil for videre bruk.
6. Bioinformatikk Analysis
Den opprinnelige annotering av probesekvenser fra bovin embryo-spesifikk transkripsjoner (BESTv1) mikromatrise har blitt beskrevet tidligere 8. I denne studien ble det oppnådd 20,403 unike Gene symboler (GS) ( Supplement fil1 ) gjennom EmbryoGENE Laboratory Information Management System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). En liste over 6,765 unike gener ( Supplement fil2 ) ble valgt og tilsvarte alle positive signaler etter microarray normaliseringsprosessen (Trinn 50,5) fra storfe Dag 7 embryoer genuttrykk profil. Positivt signal terskel ble beregnet på grunnlag av gjennomtrengelige publikasjon 16 fra signalintensiteten av en A-verdi.
- For å utføre funksjonsanalyse med PANTHER (Protein analyse gjennom evolusjonære relasjoner) Classification System 23, 24, åpner følgende link (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
- Last opp en liste over 6,765 embryo-spesifikke GS for å identifisere spesifikke biologiske prosessen under embryonal utvikling ved hjelp av statistisk overrepresentasjon test og bruke standardinnstillingen Bos taurus (alle genene i databasen) som referanseliste 25.
MERK: Dette gjør at identifisering av utviklingsrelaterte prosesser fra GO vilkårene som er statistisk over- eller under uttrykkes ved hjelp av en binomisk test. - Sett P-verdi terskel på <0,05 som programvare standard. Data kan lastes ned og exported til Excel-fil for videre valg 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et representativt resultat av total RNA og amplifisert Arna fra dag 7 bovine embryoer er vist i figur 3 og oppsummert i tabell 1.
RNA integritet og profilen kan vurderes etter RNA ekstraksjon. Kvalitetsvurdering av RNA kan gjøres ved at Bioanalyzer instrument (figur 3A) og bare de prøver med RIN verdi som er høyere enn 7,0 er kvalifisert til å bli brukt for amplifisering (tabell 1).
Kvaliteten og kvantiteten av amplifisert RNA bør evalueres etter forsterkning. Likheten av amplifisert RNA profil og passende størrelsesområde er de viktigste faktorer for kvalitetskontroll (figur 3B). Etter to runde forsterkning, de amplifiserte RNA-fragmentene er svært like i størrelse, som varierer mellom 200 og 800 bp (figur 3B) ogalle Arnas av tilsvarende størrelse utvalg er valgt for videre fluorescens merking. Dessuten vil en vellykket amplifikasjon av den opprinnelige totale RNA gi minst mer enn et tusen ganger økning av Arna (tabell 1).
Fluorescens merking effektivitet kan beregnes i henhold til graden av merking forholdet. Formelen er tilgjengelig i ULS Arna merking kit brukerhåndboken. Bruksanvisning antyder graden av merking forholdet bør utgjør 1.0 - 3.6%, noe som indikerer at et gjennomsnitt på 1 - 3,6 ULS molekyler pr 100 nukleotider.
Bildefilene etter hybridisering og skanning kan sees fra FlexArray. En god kvalitet skannede bildet etter microarray hybridisering og vasking er vist i figur 4A. Hvis merket materialer er lavere eller høyere enn dette området, vil signalene være for lav til å oppdage eller høyt bakgrunnsnivå vil bli oppdaget etter scanning (figur 4B).
I denne studien ble positivt signal beløpsgrense på 7,6 (sonde signal høyere enn 7.6 eller bakgrunn <7,6 anses å være positiv). Omtrent 46% av sondesett som representerer 20826 positive flekker er angitt i rød farge i bovin dag 7 embryoer (figur 5). Etter å ha fjernet Umerket og duplikat genet symboler, er bare 6765 unike gener symboler venstre for PANTHER analyse.
Disse 6,765 genene representerer de unike RNA transkripsjoner uttrykt i Dag 7 storfe blastocyst. For å finne den biologiske prosessen som er spesifikk for storfe blastocyst er PANTHER overrepresentasjon Test utføres. De øverste 10 Gene ontologi (GO) varige IDer med høyest fold berikelse indeksen er valgt (figur 6). Generelt har disse spesifikke betingelser GO representere stort sett den aktive celledeling prosess, slik som mitosis og kromosom segregering, regulering av cellesyklus og initiering av cytoplasmisk og mitokondrielle oversettelse.
Figur 1: Ozon-free Box (A) og Array merking Reaksjon (B). A) Ozon Free Box består av en katalysator enhet som resirkulerer luften og ødelegger ozon og en svært følsom ozonsensor for å overvåke ozonnivået inne i boksen under microarray ytelse. B) Merking prosedyre og rekke hybridisering utføre inne i boksen for å unngå fluorescerende cyanine 647 fargestoff nedbrytning av ozon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: PANTHER Gene List Analysis. Røde piler angir området må fylles. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: En representant Bioanalyzer elektroferogrammet av Total RNA (A) og den Gel bilde av amplifiserte RNA (B). A) Viser samlede resultatet med RIN verdi, RNA konsentrasjon og rRNA-forhold. B) Profil av forsterket RNA etter to-runde forsterkning. Amplifiserte RNA-fragmenter er forventet å være i et område mellom 200 og 800 bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Bilde av Array Intensitet kart. (A) Et godt bilde av en rekke lysbilde som viser grønn og rød kanal tilsvarer cyanine 547 og cyanine 647 signaler etter skanning med høy flekk intensitet (angitt på venstre med blå grønn farge) og lav bakgrunn (angitt på riktig måte med mørk blå farge). (B) En dårlig bilde av en matrise lysbilde som viser svært høy bakgrunnsbilde fra røde kanalen (angitt fra øvre panel med lignende blå grønn farge fra bildet av cyanine 647 flekk intensitet). Fargekartet indikerer intensiteten av signalet med numeriske verdier som tilsvarer forskjellige farger. Verdien av signalintensiteten er den laveste i området fra mørk blå farge. Klikk her for å se et stortr versjon av denne figuren.
Figur 5: MA Plot for Dag 7 Bovine Embryo Gene Expression profil. 20,826 røde flekker representert positive signaler over bakgrunnssignaler. Bakgrunns flekker er markert med svart farge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Topp 10 Gene ontologi (GO) Term IDer med høyest Fold berikelse Index. Disse spesifikke GO termer representerer i stor grad aktiv celledeling prosess som mitose og kromosom segregering, regulering av cellesyklus og initiering av cytoplasma og mitokondrie transning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Prøve | Antall embryo | Type | Embryo morfologisk kvalitet | RNA konsentrasjon (pg / mL) | RIN | Brukt total RNA for forsterkning (s) | Amplified RNA konsentrasjon (ng / mL) | ||||||||
| S1 | 4 | blastocyst | Grad 1 & 2 | 101 | 8.6 | 858,5 | 3498,4 | ||||||||
| S2 | 1 | blastocyst | Grad 2 | 142 | 7.4 | 1207 | 1682,4 | S3 | 2 | blastocyst | Grad 1 | 135 | 8.8 | 1147,5 | 3185,3 |
| S4 | 3 | blastocyst | Grad 1 | 177 | 9 | 1504,5 | 2906,4 | ||||||||
| S5 | 5 | blastocyst | Grad 1 | 636 | 8.3 | 5406 | 3437,5 | ||||||||
| S6 | 3 | blastocyst | Grad 1 & 2 | 159 | 9.1 | 1351,5 | 1689,8 | ||||||||
| S7 | 3 | blastocyst | Grad 1 | 154 | 9 | 1309 | 4507,1 | ||||||||
| S8 | 4 | blastocyst | Grad 1 | 304 | 8.5 | 2584 | 3089,3 | ||||||||
| S9 | 5 | blastocyst | Grad 1 | 282 | 9.1 | 2397 | 3917,8 | ||||||||
| S10 | 6 | blastocyst | Grad 1 & 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | blastocyst | Grad 1 | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | blastocyst | Grad 1 | 206 | 9 | 1751 | 2567,9 |
Tabell 1: Eksempel og RNA informasjon. Konsentrasjonen og kvaliteten av RNA bør evalueres etter ekstraksjon. RNA integritet og konsentrasjonen kan bedømmes ved en hvilken som helst Bioanalyzer. RNA integritet nummer bør være mer enn 7,0. RNA konsentrasjonen bør undersøkes av spektrofotometer instrument etter forsterkning. Embryo kvalitet ble evaluert i henhold til Manual of International Embryo Transfer Society (3. utg., Savoy, IL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det første problemet å utføre mikromatriseanalyse ved anvendelse av dag 7 bovine embryoer er ikke å få tilstrekkelige mengder av høy kvalitet RNA for å studere genekspresjon. Tradisjonelle fenol / kloroform RNA ekstraksjon og etanol nedbør metoden anbefales ikke for Dag 7 embryoer, noe som resulterer i lavt utbytte og mulig left fenol hemme RNA forsterkning reaksjon. I stedet er en standard kolonne basert metode for bedre å isolere total RNA og deretter eluere den RNA med minimale elueringsbuffer for å øke konsentrasjonen. Et gjennomsnitt på 780 pg av total RNA pr embryo blir oppnådd i denne studien som er sammenlignbare med andre rapporter ved hjelp av en identisk metode 26 og det samme RNA-ekstraksjon sett 27, 28 som brukes for tiden. For RNA-ekstraksjon, er det anbefalt å oppløse bunnfallet før bruk ved å blande grundig eller varm ekstraksjonsbuffer hetteglasset til å re-ekstraksjonen oppløse buffer førå bruke. Videre er inkubasjonstid også viktig for RNA utbytte på ekstraksjonstrinn. Inkubasjonstid på mindre enn en full 30 min ved 42 ° C redusert RNA utbytte.
På kolonne DNase-behandling er nødvendig for å fjerne genomisk DNA-forurensning i løpet av total RNA rensing. DNase Enzymet er meget følsom for virvelen og sentrifuge. Derfor DNase og buffer skal blandes ved forsiktig å invertere.
Kvaliteten av RNA er meget viktig i mikromatriseanalyse og prøver med en RIN lavere enn 7 ikke bør vurderes for hybridisering. I denne studien, er den totale RNA-profilene oppnådd ved Bioanalyzer er lik de som ble observert i tidligere studier fra bovine blastocyster 26, 27. Det er verdt å være oppmerksom på at når du bruker pre-klekket embryoer, spesielt RNA forberedt fra egg og embryoer før mors til embryonale overgang, er ofte lavere enn 7 sammenlignet RIN verditil den totale RNA fra dag 7 embryoer, og dette er på grunn av en variasjon i 28S / 18S-rRNA-forhold 27.
Mengden av ekstrahert RNA fra bovine embryoer er ikke tilstrekkelig for plattformen hybridisering, dermed er RNA forsterkning kreves. Det finnes flere metoder tilgjengelig for RNA forsterkning som PCR, in vitro transkripsjon (IVT), og Ribo-SPIA (single primer isotermisk forsterkning). Selv om den sistnevnte metoden er raskere og i en dag gir tilstrekkelig materiale for matriser, det kreves minst 5 ng som utgangsmateriale 29. Derfor valgte vi IVT metode som er i stand til å arbeide med lave startmaterialer 12 (så lite som 100 pg). Videre har det allerede blitt testet for å forsterke total-RNA ekstrahert fra bovine embryo med hell 29. I studien, vår amplifiseringsmetode produsert ~ 28 mikrogram forsterket RNA per embryo fra 598 pg total RNA per embryo. tilleggsunnalt, etter at de to runde forsterkning, våre prøver viste en lignende profil og passende størrelsesområde (mellom 200 og 800 bp) som er i overensstemmelse med tidligere studier 13, 15.
I denne protokollen, brukte vi en ikke-enzymatisk merking protokollen, platina bundet cyanine (cyanine 547 og cyanine 647) fargestoffer. Denne metoden gjør merking av forsterket eller ikke-forsterket RNA. Å ha forsterkningstrinn før merking gjør det mulig å bruke naturlige nukleotider, som fører til høyere avkastning forsterkede RNA, redusere skjevhet og generere lengre fragmenter i forhold til enzymatisk metode. De cyanine 547 og cyanine 647 fargestoffer er vanlig fluorescerende fargestoffer anbefale for to-farge array. Imidlertid er cyanin fargestoff 647 følsomt overfor ozon degradering. Håndholdt ozon skjerm bør brukes for å sikre at nivået av ozon under 2 ppb. I tillegg er støvfritt miljø er nødvendig for å unngå støvpartikler som faller ned i hybridiseringsoppløsningen eller During skanning.
Microarray eksperiment kan utformes på en- eller to-farge tilnærming. Hver eksperimentell tilnærming har noen fordeler og ulemper. Ved hjelp av to-farge design reduserer variabiliteten og bakgrunnsstøy, åpner for direkte sammenligning og for loop design med å definere et felles referanseprøve. Selv dye-spesifikke skjevheter kan vesentlig påvirke resultatene når forsøkene er utført ved hjelp av to-farge design, kan disse skjevhetene reduseres ved å utføre fargebytter. Slik teknisk replikering legger til eksperimentelle kostnader, men kan forbedre både nøyaktighet og følsomhet i måling av differanse uttrykk 31.
Sammenlign med andre bioinformatikk programvare (for eksempel gorilla) PANTHER kan sammenligne datasett med Bos taurus genomet som referanse. Våre resultater tyder på at under Dag 7 storfe embryoutvikling følgende biologiske komponenter og funksjoner er involvert: regulering av meta / Anaphase overgang av cellesyklusen, regulering av mitotisk meta / anaphase overgangen, regulering av kromosom segregering, mitokondrie oversettelse, protein K48 bundet ubiquitinering, ER til Golgi vesikkel-mediert transport, kjernekraft-transkribert mRNA katabolsk prosess, translasjonsforskning initiering, mitotisk søsterkromatidutveksling segregering , mitotisk atom divisjon.
Protokollene som presenteres i denne artikkelen, fra fluorescerende merking av den forsterkede RNA til skanning av arrays bør utføres med ekstra oppmerksomhet av de ovennevnte miljøfaktorer for å opprettholde høy kvalitet data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M.
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf (2016).
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
