Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Transkriptom Profilering av Published: January 30, 2017 doi: 10.3791/53754
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2, 3, 1
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval
* These authors contributed equally

Introduction

Tidig foster förlust i högproducerande mjölkkor är en av de största utmaningarna inom mejeriindustrin ett, två. Nötkreatur har blivit en intressant modell för att studera mänsklig preimplantatorisk embryots utveckling på grund av deras liknande utvecklingsprocess 3, 4. Dock mer forskning behövs för att få bättre förståelse om gener som är involverade i bovint tidig embryonal utveckling.

Efter tjugo år sedan den första microarray teknik som utvecklats under 1995 5, utvecklingen av mer sofistikerade sond tillverkningsteknik minskade tryckfel och variationen av arraychip inom och mellan olika microarray plattformar 6. Förbättrad microarray-teknik resulterade i en allmänt tillämpning av denna teknik i klinisk forskning 7 och mer nyligen, i början av embryo qVALITET bedömning 8.

Den stora mängden erforderlig utrustning för microarray-tekniken är den främsta anledningen till microarray-teknik initialt misslyckats med att ange ett antal forskningsområden som tidig embryonal utveckling. På senare tid har RNA amplifieringsmetoder förbättrats för att linjärt förstärka RNA upp till mikrogram nivå från undernanogram utgångs RNA material 9. Det finns flera kommersiella RNA-amplifiering kit som finns på marknaden; emellertid de mer populära välutvecklade kit relaterade till Ribo-Single Primer Isotermisk Förstärkning 10 och T7-promotor drivs 11 metoder. De mest populära antisens-RNA förstärkning använder transkription in vitro med en oligo dT primer länka till en T7-promotor vid 5'-änden 12. Denna teknik gör det möjligt att upprätthålla de mest representativa antisenstranskript efter linjär förstärkning feller arrayer hybridisering 13. Denna metod har anpassats för att amplifiera pikogram nivå av totalt RNA extraherat från bovin embryo 8.

Universal lyftsystem (ULS) är den metod märkning som direkt innehåller DNA eller förstärkt RNA med platina bundna fluorescerande färgämne antingen Cyanine 547 eller Cyanine 647, genom att bilda en samordnande obligation på N7 position guanin 14. Denna metod har anpassats i embryon forskning för att generera mer stabil förstärkt ARNA utan ändringar jämfört med aminoallyl modifierade ARNA genereras genom enzymatisk metod 15. Både enda färgämne och två färgämnen märkningsmetoder har anpassats med hjälp av Universal Linkage System i microarray. En stor microarray jämförelser studie var att det finns en god korrelation av datakvalitet mellan de en- och två-färg array plattformar 6.

Nyligen både T7-promotor enhetn antisens-RNA förstärknings- och ULS märkningsmetoder har utvecklats för att ge en mer tillförlitlig protokoll för att generera en tillräcklig mängd högkvalitativa märkt aRNA material för microarray-hybridisering 8, 16. Därför ger denna studie ett protokoll för att visa några av de viktiga steg från RNA-extraktion till dataanalys inblandad i två färger microarray med hjälp av Dag 7 embryon från nötkreatur som ett exempel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djuret delen av denna studie genomfördes vid Metabolic Research Unit vid University of Alberta, Edmonton, Kanada, med alla djurexperimentella förfaranden godkänd (Protokoll # AUP00000131) vid University of Alberta Animal Care och användning kommittén, och djur vårdas enligt till den kanadensiska rådet Animal Care riktlinjer (1993).

1. Embryo Produktion, isolering av total RNA och DNas behandling

  1. För djurexperimentella protokoll och embryosamlings hänvisar i våra tidigare publikationer 17, 18.
  2. Pool och knäppa frysa liknande embryon scen från varje ko i flytande kväve och sedan hålla vid -80 ° C tills RNA-extraktion.
  3. Utdrag totala RNA via en kolumnbaserad RNA-extraktion kit som gör det möjligt att extrahera RNA från pico skala prover (kit information finns i Material List).
    OBS: Rekommenderad kit innehåller: Conditioning buffert, Extraction Buffer, 70% etanol, tvättbuffert 1, tvättbuffert 2, elueringsbuffert, RNA reningskolonner med uppsamlingsrör och mikrocentrifugrör.
  4. Tillsätt 10 mikroliter Extraction Buffer till rör innehållande embryon och inkubera under 30 minuter vid 42 ° C. Centrifugera röret vid 800 xg under 2 minuter för att samla cellextraktet in i mikrocentrifugrör.
  5. Pipettera 250 mikroliter Conditioning Buffer på reningskolonnen filtermembranet. Inkubera RNA reningskolonnen med Conditioning buffert under 5 min vid rumstemperatur. Centrifugera reningskolonnen i uppsamlingsröret vid 16.000 xg i 1 min.
  6. Pipettera 10 | il av 70% etanol i blandning av RNA Extraction Buffer och embryon. Blanda väl genom att pipettera upp och ner. Pipett blandningen i kondition kolumnen rening.
  7. Att binda RNA, centrifugera kolonnrening under 2 min vid 100 xg och följ omedelbart med en centrifugering vid 16000 x g i 30 s för att ta bort flödet genom.
  8. Tillsätt 10081; L från Tvättbuffert 1 in i reningskolonnen och centrifugera i 1 min vid 8000 x g.
    OBS: DNas behandling rekommenderas om att utföra omvänd transkription eller förstärkning efter RNA-isolering.
  9. Smälta iskt DNA direkt efter steg 1,8.
    OBS: Rekommenderad DNas kit finns i Material listan. Rekommenderad kit innehåller: DNas I lager lösning och buffert.
  10. Förbered DNas inkubationsblandningen genom att blanda 5 mikroliter DNas I stamlösning med 35 mikroliter buffert. Blanda genom att försiktigt vända.
  11. Pipettera 40 | il DNas inkubationsblandningen direkt in i reningskolonnen membranet. Inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
  12. Pipettera 40 | il tvättbuffert 1 in i reningskolonnen membranet och sedan centrifugera vid 8000 xg under 15 s.
  13. Pipettera 100 mikroliter tvättbuffert 2 in i reningskolonnen och centrifugera i 1 min vid 8000 x g.
  14. Pipettera en annan 100 pl tvättbuffert 2 in i reningskolonnen och centrifugeraunder 2 minuter vid 16.000 x g.
  15. Överföra kolonnrening i ett annat 0,5 ml mikrocentrifugrör. Pipettera 11 | il av Elution Buffer direkt på membranet av kolonnen rening. För att säkerställa maximal absorption av elueringsbuffert in i membranet, försiktigt röra spetsen av pipetten till ytan av membranet medan dispense elueringsbufferten.
  16. Inkubera kolonnen under 1 min vid rumstemperatur. Centrifugera kolonnen under 1 min vid 1000 xg för att distribuera elueringsbuffert i kolonnen, och sedan snurra i 1 min vid 16.000 xg för att eluera RNA.
  17. Använd Bioanalyzer instrument enligt tillverkarens anvisningar för att utvärdera RNA kvalitet och kvantitet 19.
  18. Lagra provet RNA vid -80 ° C fram till användning.

2. RNA Förstärkning och märkning av microarray analys

OBS: För första gången användare som arbetar med RNA förstärknings- och märkningsförfaranden, använder fem ng spik i RNA Along med de faktiska aRNA prover för att kontrollera kvaliteten kontrollmätning av RNA förstärkning och hybridisering. Spetsen-i RNA mix innehåller tio syntetiserade, polyadenylerade transkript i förutbestämda förhållanden in vitro. När proceduren utförs korrekt, de märkta transkript specifikt hybridisera endast till komplementära styr sonder i matriser och data kan skannas för att spåra kvalitetskontroll försäkran med minimal själv- eller korshybridisering. Mer information beskrivning om spetsade in kontrollnivåer och normaliseringsförfarandet efter skanning matris och dataanalys är hänvisa till tidigare publikationer 20, 21. Följande procedur ges till rutinen microarray användare.

  1. Förbereda 100 pg högkvalitativt RNA-prov (RNA Integrity antal (RIN) värde som minst> 7,0) i en total volym på 10 - 11 mikroliter.
  2. Amplifiera de RNA-prover med en förstärkningssats att kunnaarbeta med pico skala prover (så lite som 100 pg).
    OBS: Rekommenderad förstärkning kit information finns i Material List och följer tillverkarens anvisningar utan några ändringar.
  3. Använda en fluorescensbaserad kvantifiering för att utvärdera profilen av det storleksintervall hos den förstärkta aRNA.
  4. Använda spektrofotometern instrumentet (baserat på absorbansen vid 260 och 280 nm) för att mäta koncentrationen av den amplifierade aRNA.
  5. Lagra den förstärkta ARNA vid -80 ° C tills redo för märkning.
  6. Använd 2 mikrogram av förstärkt RNA för fluorescerande märkning enligt ULS ARNA märkning kit manual.
    OBS: Eftersom Cyanine 547 och Cyanine 647 färgämne är känsliga för fotonedbrytning och Cyanine 647 färgämnet lätt bryts ned av ozon, tar märkningsförfarandet rum i en minimal mängd av ljus och under en ozon-fri miljö.
  7. Slå på ozonlåda (Figur 1A) tills nivån av ozon är 0,001 ppm.
    8. (Figur 1B) genom att tillsätta 2 mikroliter av Cyanine 547 eller Cyanine 647, 2 mikroliter av buffert märkning, och sedan anpassa sig till en slutlig volym på 20 mikroliter med RNas-fritt vatten under skyddsljus. Lägg mörkrum filtret till ljuskällan.
  8. Blanda försiktigt och inkubera rören i en termocykler vid 85 ° C under 15 min. Placera proverna på is under åtminstone 1 min. Spinn ner för att samla innehållet i rören innan du fortsätter med RNA-extraktion kit, förutom steg i samband med DNas behandling (1,9-1,11), för att rensa upp Cy-dye-märkt mångfaldigat RNA.
  9. Använda spektrofotometern instrument för att mäta och bestämma koncentrationen av märkt mångfaldigat RNA och hålla den märkta ARNA vid -80 ° maximum C under 3 dagar före användning.

3. microarray-hybridisering och tvättning

OBS: Följande viktiga steg anpassas efter Tvåfärgad microarray-baserad Gene Expression Analysis Protocol (version6,5 maj 2010).

  1. Lägg lika stor mängd av 825 ng från varje Cyanine 547- och Cyanine 647-märkt ARNA och blanda med 25x fragmentering och 10x blockerande buffertar.
  2. Upphetta blandningen vid 60 ° C under 15 min och kyl på is under en min.
  3. Lägga lika stor mängd av 2x hybridiseringsbuffert och blanda väl.
  4. Centrifugera vid 13000 rpm, varefter blandningen är klar för hybridisering.
  5. Ladda 100 mikroliter från blandningen på arrayen bilden och täta bilden inuti hybridisering kammaren.
  6. Ladda den monterade kammaren in i hybridiseringsugn under 17 h vid 65 ° C som roterar vid 10 varv per minut i ugnen.
  7. Tvätta matriser enligt protokoll med ozonskydd behandling genom doppning i stabilisering och torkning av lösningen under 30 s.
  8. Ta bort arrayer från lösningen och se till arrayen ytan är torr utan dammpartiklar

4. Scanning Microarray Slide

  1. Håll arrayer på mörk plats och slå på Scanner tills den är klar att använda (15 min väntetid).
  2. Ladda arrayen streckkoden på vänster i skannern och starta skanningen. Gör plats analys enligt programmet manual och spara data som (GPR) filformat.

5. Statistisk analys

  1. Ladda ner FlexArray programvara http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Klicka på "import rådata" och ladda GPR-filer till FlexArray.
  2. Utför normalisering och statistisk analys vid behov genom att följa instruktionerna. Obs: Beräkna tröskeln för positiv plats val i denna studie som det beskrevs tidigare 22.
  3. Välj rullgardins handboken från tomten betraktaren av FlexArray att se alla de hybridiserade fläckar och bakgrundssignaler. Obs: En liknande bild av spetsade kontroller efter hybridisering till microarray kan ses i föregående studie 8.
  4. Välj enLöss normalisering inom matris följt av en kvantil mellan matriser normaliseringsprocess från FlexArray rullgardins manual därefter.
  5. Exportera alla normaliserade data från FlexArray till en Excel-fil för vidare användning.

6. Bioinformatics Analys

Den ursprungliga anteckning av sondsekvenser från nötkreatur Embryo specifika transkript (BESTv1) microarray har beskrivits tidigare åtta. I denna studie var 20,403 unika Gene Symboler (GS) erhålls ( Supplement FIL1 ) genom EmbryoGENE Laboratory Information Management System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). En lista över 6,765 unika gener ( Tillägg FIL2 ) valdes och motsvarade alla positiva signaler efter microarray normaliseringsprocessen (steg 50,5) från nötkreatur Dag 7 embryon genuttryck profil. Positiv signal tröskel har beräknats baserat på genomträngliga publikation 16 från signalstyrkan i ett A-värde.

  1. För att kunna utföra funktionsanalys med PANTHER (Protein analys med hjälp av evolutionära släktskap) Classification System 23, 24, öppnar följande länk (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
  2. Ladda upp en lista över 6,765 embryospecifika GS för att identifiera specifika biologiska process under embryonal utveckling med hjälp av statistiska representation prov och använda standardinställningen Bos taurus (alla gener i databasen) som referenslista 25.
    OBS: Detta möjliggör identifiering av utvecklingsstörningar relaterade processer från GO termer som är statistiskt över- eller under uttryckas med en binomial test.
  3. Inställt tröskelvärde P-värde på <0,05 mjukvara standard. Data kan laddas ner och exported till Excel-fil för ytterligare val 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett representativt resultat av total-RNA och amplifieras aRNA från dag 7 embryon från nötkreatur visas i Figur 3 och sammanfattas i Tabell 1.

RNA integritet och profil kan bedömas efter RNA-extraktion. Kvalitetsbedömning av RNA skulle kunna göras genom Bioanalyzer instrumentet (figur 3A) och endast de prover med RIN-värde högre än 7,0 är godkända för att användas för amplifiering (tabell 1).

Kvalitet och kvantitet av förstärkt RNA bör utvärderas efter förstärkning. Likheten av förstärkt RNA profil och lämplig storleksintervall är de viktigaste faktorerna för kvalitetskontroll (Figur 3B). Efter två-round-amplifiering, de amplifierade RNA-fragmenten är mycket lika i storlek, som varierar mellan 200 och 800 bp (figur 3B) ochalla Arnas av liknande storleksintervall väljs ut för vidare fluorescensmärkning. Dessutom kommer en framgångsrik amplifiering av den ursprungliga totalt RNA ge åtminstone mer än ett tusen-faldig ökning av aRNA (tabell 1).

Fluorescensmärkningseffektiviteten kan beräknas enligt graden av märkning förhållande. Formeln är tillgänglig i ULS ARNA märkningskit manual. Bruksanvisningen föreslår graden av märkning förhållandet skall vara 1,0-3,6%, vilket tyder på att i genomsnitt 1 - 3,6 ULS molekyler per 100 nukleotider.

Bildfiler efter hybridisering och skanning kan ses från FlexArray. En god kvalitet skannade bilden efter microarray-hybridisering och tvättning visas i fig 4A. Om märkta material är lägre eller högre än detta intervall, kommer signalerna vara för låg för att upptäcka eller hög bakgrundsnivåerna kommer att upptäckas efter scanning (Figur 4B).

I nuvarande studie positiv signal tröskelvärde på 7,6 (sond signal högre än 7,6 eller bakgrund <7,6 anses vara positivt). Cirka 46% av probuppsättningar som representerar 20826 positiva punkter är markerade med rött färg hos nötkreatur Dag 7 embryon (Figur 5). Efter avlägsnande OKOMMENTERAD och dubbletter gen symboler är endast 6765 unika gen symboler kvar för PANTHER analys.

Dessa 6,765 gener representerar unika RNA-transkript som uttrycks i Dag 7 bovin blastocyst. För att finna den biologiska processen som är specifik för bovint blastocyst, är PANTHER Övertäckning Test utförs. De översta 10 Gene ontologi (GO) sikt ID med högsta faldig anrikning index väljs (Figur 6). I allmänhet är dessa specifika GO termer representerar i stort sett den aktiva celldelning process såsom mitosis och kromosomsegregation, reglering av cellcykeln och initiering av cytoplasma och mitokondriell översättning.

Figur 1
Figur 1: Ozon fri Box (A) och Array märkningsreaktionen (B). A) Ozonfri Box består av en katalysator enhet som återvinner luften och förstör ozon och en mycket känslig ozon sensor för att övervaka ozonnivån i rutan under microarray prestanda. B) Märkning förfarande och array hybridisering utför i rutan för att undvika fluorescerande Cyanine 647 färgämne nedbrytning av ozon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: PANTHER Gene List analys. Röda pilar indikerar området behöver fyllas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: En representant Bioanalyzer elektroferogram över Total RNA (A) och den Gel Foto av Amplified RNA (B). A) Visar övergripande resultatet med RIN värde, RNA-koncentrationen och rRNA-förhållande. B) Profil av förstärkt RNA efter två omgångar förstärkning. Amplifierade RNA-fragmenten förväntas vara i ett intervall mellan 200 och 800 bp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Bild av Array Intensitet Map. (A) En god bild av en matris glida visar grönt och rött kanal motsvarar cyanin 547 och Cyanine 647 signaler efter skanning med hög plats intensitet (anges till vänster med blå grön färg) och låg bakgrund (anges på höger med mörkblå Färg). (B) En dålig bild av en matris glida visar mycket hög bakgrundsbild från röda kanalen (anges från den övre panelen med liknande blå grön färg från bilden av Cyanine 647 plats intensitet). Färgkarta visar intensiteten hos signalen med numeriska värden som motsvarar olika färger. Värdet på signalstyrka är den lägsta i intervallet mörkblå färg. Klicka här för att se en storr version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: MA Tomt till Dag 7 Bovine Embryo Gene Expression profil. 20,826 röda fläckar representerade positiva signaler över bakgrundssignaler. Bakgrund fläckar är markerade i svart färg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Top 10 Gene ontologi (GO) Term ID med högsta faldig anrikning index. Dessa särskilda GO termer representerar i hög grad aktiv celldelning process som mitos och kromosomsegregation, reglering av cellcykeln och initiering av cytoplasma och mitokondriell transning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Prov Antal embryo Typ Embryo morfologisk kvalitet RNA-koncentration (pg / il) RIN Begagnade totalt RNA för förstärkning (s) Amplifierade RNA-koncentration (ng / mikroliter)
S1 4 blastocyst Grade 1 & 2 101 8,6 858,5 3498,4
S2 1 blastocyst Grade 2 142 7,4 1207 1682,4 S3 2 blastocyst Klass 1 135 8,8 1147,5 3185,3
S4 3 blastocyst Klass 1 177 9 1504,5 2906,4
S5 5 blastocyst Klass 1 636 8,3 5406 3437,5
S6 3 blastocyst Grade 1 & 2 159 9,1 1351,5 1689,8
S7 3 blastocyst Klass 1 154 9 1309 4507,1
S8 4 blastocyst Klass 1 304 8,5 2584 3089,3
S9 5 blastocyst Klass 1 282 9,1 2397 3917,8
S10 6 blastocyst Grade 1 & 2 374 9,4 3179 2979
S11 5 blastocyst Klass 1 272 9,3 2312 2576
S12 3 blastocyst Klass 1 206 9 1751 2567,9

Tabell 1: Prov och RNA information. Koncentrationen och kvalitet av RNA bör utvärderas efter extraktion. kan bedömas RNA integritet och koncentration av någon Bioanalyzer. RNA integritet Numret ska vara mer än 7,0. RNA-koncentrationen bör undersökas av spektrofotometer instrument efter förstärkning. Embryo kvalitet utvärderades enligt handboken från International Embryo Transfer Society (3: e upplagan., Savoy, IL).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det första problemet att utföra microarray analys med hjälp av Dag 7 embryon från nötkreatur inte får tillräckliga mängder av hög kvalitet RNA för att studera genuttryck. Traditionella fenol / kloroform RNA-extraktion och etanolutfällning metod rekommenderas inte för Dag 7 embryon, vilket resulterar i lågt utbyte och eventuell kvarvarande fenol hämmande RNA amplifieringsreaktionen. I stället är en standard kolumnbaserad metod bättre att isolera total-RNA och därefter eluera RNA med minimal elueringsbuffert för att öka koncentrationen. I genomsnitt 780 pg av total RNA per embryo erhålls i aktuella studien som är jämförbar med andra rapporter med en identisk metod 26 och samma RNA Extraction Kit 27, 28 används för närvarande. För RNA-extraktion, är det rekommenderat att upplösa fällningen före användning genom att blanda ordentligt eller värma extraktionsbuffert flaskan med att åter upplösa extraktionsbuffert föreatt använda. Dessutom är inkubationstiden också viktigt för RNA utbytet vid extraktionssteget. Inkubationstid mindre än en full 30 minuter vid 42 ° C minskade RNA avkastning.

På kolumn är DNas matsmältning nödvändigt att avlägsna genom-DNA kontaminering under total RNA rening. DNas enzymet är mycket känslig för virvel och centrifugera. Därför DNas och buffert bör blandas genom att försiktigt vända.

Kvaliteten av RNA är mycket viktigt i mikromatrisanalys och prover med en RIN lägre än 7 inte bör övervägas för hybridisering. I aktuella studien, totalt RNA profiler som erhållits genom Bioanalyzer liknar de som observerats tidigare i studier från blastocyster nötkreatur 26, 27. Det är värt att notera att när man använder pre-streckade embryon, särskilt RNA från oocyter och embryon innan moderns till embryonala övergång, är ofta lägre än 7 jämfört RIN värdeden totala RNA från dag 7 embryon och detta beror på en variation i 28S / 18S rRNA förhållandet 27.

Mängden extraherat RNA från embryon från nötkreatur är inte tillräckligt för plattformen hybridisering, hence, är RNA-amplifiering erfordras. Det finns flera metoder tillgängliga för RNA-förstärkning såsom PCR, in vitro transkription (IVT), och Ribo-SPIA (enda primer isotermisk förstärkning). Även den senare metoden är snabbare och i en dag ger tillräckligt material för matriser, krävs det minst fem ng som utgångsmaterial 29. Därför valde vi IVT metod som kan arbeta med låga utgångsmaterial 12 (så lite som 100 pg). Dessutom har det redan testats för att förstärka den totala RNA som extraherats från bovin embryo framgångsrikt 29. I aktuella studien, vår amplifieringsmetod produceras ~ 28 mikrogram förstärkt RNA per embryo från 598 pg totalt RNA per embryo. Additiointernt, efter två omgångar förstärkning, våra prover visade en liknande profil och lämplig storleksintervall (mellan 200 och 800 bp) som överensstämmer med tidigare studier 13, 15.

I detta protokoll använde vi en icke-enzymatisk märkning protokoll, platina bunden cyanin (Cyanine 547 och Cyanine 647) färgämnen. Denna metod tillåter märkning av amplifierade eller icke-amplifierade RNA. Med amplifieringssteget före märkning tillåter att använda naturliga nukleotider, vilket leder till högre avkastning förstärkta RNA, minska fördomar och skapa längre fragment jämfört med enzymatisk metod. Cyanin 547 och Cyanine 647 färgämnen är vanliga fluorescerande färgämnen rekommendera för tvåfärgad array. Dock är Cyanine 647 färgämne känsligt för ozonnedbrytning. Handhållna ozon monitor bör användas för att se till att nivån av ozon under 2 ppb. Dessutom är det nödvändigt dammfri miljö för att undvika dammpartiklar att falla in i hybridiseringslösning eller During scanning.

Microarray experiment kan utformas i en- eller två-färg strategi. Varje experimentell metod har vissa fördelar och nackdelar. Med hjälp av två färger mönster minskar variationen och bakgrundsljud, möjliggör direkt jämförelse och för loop design med att definiera en gemensam referensprov. Även färgämnesspecifika fördomar väsentligt kan påverka resultaten när experiment utförs med två färger mönster, kan dessa fördomar mildras genom att utföra färgswappar. Sådant tekniskt replikering ökar experimentella kostnader, men kan förbättra både noggrannhet och känslighet vid mätning av differentiellt uttryck 31.

Jämför med andra bioinformatik programvara (t.ex. gorilla) PANTHER kan jämföra dataset med Bos taurus genomet som referens. Våra resultat visar att under Dag 7 bovin embryonal utveckling följande biologiska komponenter och funktioner är inblandade: reglering av meta / ANAPhase övergång av cellcykeln, reglering av mitotisk metafas / anafas övergången, reglering av kromosomsegregation, mitokondrie översättning, protein K48 bunden ubikitinering ER till Golgi vesikler-medierad transport, kärnkraft-transkriberade mRNA nedbrytningsprocess, translationell initiering, mitotiska systerkromatidutbyten segregation , mitotiska kärn division.

De protokoll som presenteras i detta dokument, från fluorescerande märkning av mångfaldigat RNA skanning av fälten ska utföras med extra medvetenhet om ovanstående miljöfaktorer för att bibehålla högkvalitativa data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PicoPure RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT0204
RNase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit Applied Biosystems KIT0505
2100 Bioanalyzer Instruments Agilent Technologies G2940CA
RNA Screen Tape Agilent Technologies 5067-5576
ULS Fluorescent Labeling Kit Kreatech Diagnostics EA-021
Custom Gene Expression Microarrays Agilent Technologies G2514F
Agilent Gene Expression wash buffer 1 Agilent Technologies Part #5188-5325
Agilent Gene Expression wash buffer 2 Agilent Technologies Part #5188-5326
2x Hi-RPM Hybridization buffer Agilent Technologies  Part #5190-0403
25x Fragment buffer Agilent Technologies Part #5185-5974
10x GE Blocking Agent Agilent Technologies Part #5188-5281
Stabilization and drying solution Agilent Technologies  Part #5185-5979
Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy Agilent Technologies G2524-60012 Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide
Two-Color RNA Spike-In Kit Agilent Technologies  Cat# 5188-5279
GenePix 4000B array scanner Molecular Devices GENEPIX 4000B-U
Ozone Free Box BioTray OFB_100x200
GAL file Agilent Technologies -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
  2. Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
  3. Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
  4. Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
  5. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  6. Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
  7. Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
  8. Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
  9. Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
  10. Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
  11. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
  12. Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
  13. Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
  14. Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
  15. Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
  16. Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
  17. Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
  18. Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
  19. Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf (2016).
  20. Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
  21. Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
  22. Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
  23. Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  24. Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
  25. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
  26. Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
  27. Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
  28. Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
  29. Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
  30. Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).
  31. Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).

Tags

Utvecklingsbiologi embryon RNA förstärkning RNA märkning tvåfärgad microarray ozon miljö nötkreatur
Transkriptom Profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Producerad Bovina Preimplantatorisk embryon med hjälp av två-färg microarray plattform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salehi, R., Tsoi, S. C. M., Colazo,… More

Salehi, R., Tsoi, S. C. M., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Robert, C., Dyck, M. K. Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform. J. Vis. Exp. (119), e53754, doi:10.3791/53754 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter