Instrueret Evolution Method i<em> Saccharomyces cerevisiae</em>: Mutant Bibliotek Creation og Screening

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Målrettet evolution i Saccharomyces cerevisiae byder på mange attraktive fordele ved udformningen enzymer til bioteknologiske anvendelser, en proces, der indebærer opførelse, kloning og ekspression af mutant biblioteker, koblet til høj frekvens homolog DNA-rekombination in vivo. Her præsenterer vi en protokol til at skabe og skærm mutant biblioteker i gær baseret på eksemplet med en svampe aryl-alkohol oxidase (AAO) at øge sin samlede aktivitet. To protein segmenter blev underkastet fokuseret-målrettet evolution ved tilfældig mutagenese og in vivo DNA-rekombination. Udhæng af ~ 50 bp flankerende hvert segment tillod den korrekte samling af AAO-fusionsgen i en lineariseret vektor, der giver anledning til en fuldstændig autonomt replikerende plasmid. Mutantbiblioteker beriget med funktionelle AAO varianter blev screenet i S. cerevisiae supernatanter med en følsom high-throughput assay baseret på Fenton reaktionen. Den generelle proces medbibliotekskonstruktion i S. cerevisiae her beskrevne let kan anvendes til at udvikle mange andre eukaryote gener, undgå ekstra PCR-reaktioner, in vitro DNA-rekombination og ligeringstrin.

Introduction

Rettet molekylær evolution er en robust, hurtig og pålidelig metode til at designe enzymer ^{1, 2.} Gennem iterative runder af tilfældig mutation, rekombination og screening, kan genereres forbedrede versioner af enzymer, der virker på nye substrater, i hidtil ukendte reaktioner, i ikke-naturlig miljøer, eller endda at hjælpe cellen til at opnå nye metaboliske mål ^3-5. Blandt værterne, der anvendes i dirigeret evolution, den ølgær Saccharomyces cerevisiae giver et repertoire af løsninger til den funktionelle udtryk af komplekse eukaryote proteiner, der ellers ikke findes i prokaryote modstykker ^6,7.

Bruges udtømmende i cellebiologiske studier, denne lille eukaryote model har mange fordele i form af post-translationelle modifikationer, nem manipulation og transformation effektivitet, som alle er vigtige egenskaber at ingeniør enzymer ved dirigeret evolution ^8. Det høje frekvensaf homolog DNA-rekombination i S. cerevisiae koblet til dens effektive korrekturlæsning apparat åbner en bred vifte af muligheder for bibliotekets oprettelse og gen samling in vivo, fremme udviklingen af forskellige systemer fra enkelte enzymer til komplekse kunstige veje ^9-12. Vores laboratorium har brugt det sidste årti designe værktøjer og strategier for den molekylære evolution af forskellige ligninaser i gær (oxidoreduktaser involveret i nedbrydningen af lignin under naturtræ henfald) ^13-14. I denne meddelelse præsenterer vi en detaljeret protokol til at forberede og skærm mutant biblioteker i S. cerevisiae for en model flavooxidase, -aryl-alkoholoxidase (AAO ¹⁵⁾ -, der let kan oversættes til mange andre enzymer. Protokollen indebærer en fokuseret-rettet evolution metoden (Morphing: Mutagen Organized rekombinationsprocessen ved hjælp af homolog in vivo gruppering) bistået af gærcelle apparatet ^16, enda meget følsom screening assay baseret på Fenton reaktionen for at detektere AAO aktivitet udskilles i dyrkningsvæsken ^17.

Protocol

1. Mutant Bibliotek Construction Vælg regionerne at blive udsat for morphing med hjælp af beregningsmæssige algoritmer baseret på de tilgængelige krystalstruktur eller homologi modeller 18. Her målretter to områder af AAO fra Pleurotus eryngii for tilfældig mutagenese og rekombination (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mens amplificering af resten af genet (844 bp) af high-fidelity PCR (figur 1). Bemærk: Flere segmenter kan studer…

Representative Results

AAO fra P. eryngii er et ekstracellulært flavooxidase der leverer fungale peroxidaser med H2O 2 for at starte angribe lignin. To segmenter af AAO blev udsat for fokuseret-rettet evolution ved morphing for at styrke sin virksomhed og dens udtryk i S. cerevisiae 19. Uafhængigt af de udenlandske enzymer nærede af S. cerevisiae, den mest kritiske spørgsmål ved konstruktion mutantbiblioteker i gær vedrører konstruktion af spec…

Discussion

I denne artikel har vi opsummeret de fleste af de tips og tricks ansat i vores laboratorium til ingeniør enzymer ved dirigeret evolution i S. cerevisiae (under anvendelse AAO som eksempel), således at de kan tilpasses til anvendelse med mange andre eukaryot enzymsystemer ved blot at følge den fælles tilgang beskrevet her.

Med hensyn til bibliotekets skabelse morfing er en hurtig one-pot-metoden til at indføre og rekombinere tilfældige mutationer i små proteinmolekyler strækn…

Materials

1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Agarose gel stuff	–	–	–
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1Kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem, Spain	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Plates
96-well plates	Greioner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greioner Bio-One	655161	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greioner Bio-One	656171	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)