Instrueret Evolution Method i Published: April 1, 2016 doi: 10.3791/53761

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Javier Viña-Gonzalez¹, David Gonzalez-Perez¹, Miguel Alcalde¹

¹Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Abstract

Målrettet evolution i Saccharomyces cerevisiae byder på mange attraktive fordele ved udformningen enzymer til bioteknologiske anvendelser, en proces, der indebærer opførelse, kloning og ekspression af mutant biblioteker, koblet til høj frekvens homolog DNA-rekombination in vivo. Her præsenterer vi en protokol til at skabe og skærm mutant biblioteker i gær baseret på eksemplet med en svampe aryl-alkohol oxidase (AAO) at øge sin samlede aktivitet. To protein segmenter blev underkastet fokuseret-målrettet evolution ved tilfældig mutagenese og in vivo DNA-rekombination. Udhæng af ~ 50 bp flankerende hvert segment tillod den korrekte samling af AAO-fusionsgen i en lineariseret vektor, der giver anledning til en fuldstændig autonomt replikerende plasmid. Mutantbiblioteker beriget med funktionelle AAO varianter blev screenet i S. cerevisiae supernatanter med en følsom high-throughput assay baseret på Fenton reaktionen. Den generelle proces medbibliotekskonstruktion i S. cerevisiae her beskrevne let kan anvendes til at udvikle mange andre eukaryote gener, undgå ekstra PCR-reaktioner, in vitro DNA-rekombination og ligeringstrin.

Introduction

Rettet molekylær evolution er en robust, hurtig og pålidelig metode til at designe enzymer ^{1, 2.} Gennem iterative runder af tilfældig mutation, rekombination og screening, kan genereres forbedrede versioner af enzymer, der virker på nye substrater, i hidtil ukendte reaktioner, i ikke-naturlig miljøer, eller endda at hjælpe cellen til at opnå nye metaboliske mål ^3-5. Blandt værterne, der anvendes i dirigeret evolution, den ølgær Saccharomyces cerevisiae giver et repertoire af løsninger til den funktionelle udtryk af komplekse eukaryote proteiner, der ellers ikke findes i prokaryote modstykker ^6,7.

Bruges udtømmende i cellebiologiske studier, denne lille eukaryote model har mange fordele i form af post-translationelle modifikationer, nem manipulation og transformation effektivitet, som alle er vigtige egenskaber at ingeniør enzymer ved dirigeret evolution ^8. Det høje frekvensaf homolog DNA-rekombination i S. cerevisiae koblet til dens effektive korrekturlæsning apparat åbner en bred vifte af muligheder for bibliotekets oprettelse og gen samling in vivo, fremme udviklingen af forskellige systemer fra enkelte enzymer til komplekse kunstige veje ^9-12. Vores laboratorium har brugt det sidste årti designe værktøjer og strategier for den molekylære evolution af forskellige ligninaser i gær (oxidoreduktaser involveret i nedbrydningen af lignin under naturtræ henfald) ^13-14. I denne meddelelse præsenterer vi en detaljeret protokol til at forberede og skærm mutant biblioteker i S. cerevisiae for en model flavooxidase, -aryl-alkoholoxidase (AAO ¹⁵⁾ -, der let kan oversættes til mange andre enzymer. Protokollen indebærer en fokuseret-rettet evolution metoden (Morphing: Mutagen Organized rekombinationsprocessen ved hjælp af homolog in vivo gruppering) bistået af gærcelle apparatet ^16, enda meget følsom screening assay baseret på Fenton reaktionen for at detektere AAO aktivitet udskilles i dyrkningsvæsken ^17.

Protocol

1. Mutant Bibliotek Construction

1. Vælg regionerne at blive udsat for morphing med hjælp af beregningsmæssige algoritmer baseret på de tilgængelige krystalstruktur eller homologi modeller ^18.
   1. Her målretter to områder af AAO fra Pleurotus eryngii for tilfældig mutagenese og rekombination (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mens amplificering af resten af genet (844 bp) af high-fidelity PCR (figur 1).
      Bemærk: Flere segmenter kan studeres ved morphing i en uafhængig eller kombineret måde ^16.
2. Forstærk de målrettede områder ved mutagen PCR. Opret overlappende områder mellem segmenter (~ 50 bp hver) ved at overlejre PCR reaktioner af de definerede regioner.
   1. Forbered mutagen PCR af målrettede segmenter i et endeligt volumen på 50 pi indeholdende DNA-template (0,92 ng / pl), 90 nM oligo forstand (RMLN for segmentet MI og AAO-BP for segmentet M-II), 90 nM antisense primer (AAO-92C for segmentet MI og RMLC for segmentet M-II), 0,3 mM dNTP'er (0,075 mM hver), 3% (v / v) dimethylsulfoxid (DMSO), 1,5 mM _MgCl2, 0,05 mM _MnCl2 og 0,05 U / pl Taq DNA-polymerase. Primere sekvenser er beskrevet i figur 1.
   2. Brug følgende PCR program: 95 ° C i 2 min (1 cyklus); 95 ° C i 45 sekunder, 50 ° C i 45 sek, 74 ° C i 45 sek (28 cyklusser); og 74 ° C i 10 minutter (1 cyklus).
3. Forstærk ikke-mutagene regioner med ultra-high fidelity-polymerase og omfatter de tilsvarende områder overlapper de mutagene segmenter og / eller lineariserede vektor udhæng.
   1. Forbered reaktionsblandinger i et endeligt volumen på 50 pi indeholdende: DNA-template (0,2 ng / pl), 250 nM oligo sense HFF, 250 nM oligo antisense HFR, 0,8 mM dNTP'er (0,2 mM hver), 3% (v / v) dimethylsulfoxid (DMSO) og 0,02 U / pl iproof DNA-polymerase. Primere sekvenser er beskrevet i <strong> Figur 1.
   2. Brug følgende PCR program: 98 ° C i 30 sekunder (1 cyklus); 98 ° C i 10 sek, 55 ° C i 25 sek, 72 ° C i 45 sek (28 cyklusser); og 72 ° C i 10 min (1 cyklus).
      Bemærk: Med betingelserne i 1.2 og 1.3 overlapninger af 43 bp (plasmid-M1-regionen); 46 bp (M1 region-HF region); 47 bp (HF region-M2-regionen) og 61 bp (M2 region- plasmid) er udformet (figur 1) til at favorisere in vivo splejsning i gær.
   3. Rense alle de PCR-fragmenter (mutagene og ikke-mutagene) med et kommercielt gelekstraktionskit i overensstemmelse med producentens protokol.
4. Linearisere vektor, således at flankerende regioner på ca. 50 bp er skabt som er homologe med 5'- og 3'-enderne af mål-genet.
   1. Forbered en linearisering reaktionsblanding indeholdende 2 ug DNA, 7,5 U BamHI, 7,5 U Xhol, 20 ug BSA og 2 pi Buffer Bam HI 10x i et endeligt volumen på 20 pi.
   2. Inkuber reaktionsblandingen ved 37 ° C i 2 timer og 40 min. Bagefter Fortsæt med inaktivering ved 80 ° C i 20 minutter.
5. Oprens lineariserede vektor ved agarosegel ekstraktion for at undgå forurening med residual cirkulært plasmid (figur 2).
   1. Indlæse fordøjelsen reaktionsblanding i mega-brønd i en semipræparativ lavt smeltepunkt agarosegel (0,75%, vægt: vol) samt en portion (5 pi) af reaktionsblandingen i den tilstødende samt en reporter.
   2. Kør DNA-elektroforese (5 V / cm mellem elektroderne, 4 ᵒC) og adskille agarosegel der svarer til den mega-godt og opbevar den ved 4 ᵒC i 1x TAE.
   3. Plette lane med molekylvægten stigen og reporteren. Visualiser båndene under UV-lys. Nick den position, hvor de lineariserede vektor steder.
      Bemærk: Da kvaliteten af de oprensede lineariseret vektor er en critical faktor for vellykket rekombination og montage i gær, undgå gel farvning for semipræparativ DNA-elektroforese. Anvendelsen af farvestoffer og UV-eksponering for gel ekstraktion kan påvirke stabiliteten af DNA-vektoren, kompromittere in vivo-rekombination effektivitet. Som alternativ til toksiske EtBr farvestoffer, er Gel Rød og SYBR farvestoffer almindeligt anvendt til gelfarvning.
   4. I fravær af UV-lys, identificere den lineariserede vektor i mega-brønd fragment under anvendelse vejledning af nicks i den farvede reporter lane så den kan isoleres.
   5. Uddrag det lineariserede vektor fra agarose og oprense det med en kommerciel gelekstraktionskit i overensstemmelse med producentens protokol.
      Bemærk: Brug high-kopi episomal shuttle vektorer med antibiotika og auxotrofi markører: I dette eksempel, vi beskæftigede uracil uafhængige og ampicillinresistens pJRoC30 vektor, under kontrol af gær GAL1 promoteren.
6. Forbered en ækvimolær mixture af PCR-fragmenterne og bland det med den lineariserede vektor ved et 2: 1-forhold, med ikke mindre end 100 ng lineariseret plasmid (test forskellige forhold af ækvimolær bibliotek / åben vektor for at opnå gode transformation udbytter).
   1. Mål absorbansen af ​​PCR-fragmenterne og lineariseret vektor ved 260 nm og 280 nm for at bestemme deres koncentration og renhed.
7. Transformere gær kompetente celler med DNA-blandingen under anvendelse af et kommercielt gærtransformation kit (se tabel for leverancer) ifølge producentens instruktioner.
   1. Her skal du bruge en protease mangelfuld, og URA3 ^- afhængig S. cerevisiae-stamme, BJ5465. Transformere cellerne med den parentale cirkulariserede vektor som en intern standard under screening (se nedenfor). Desuden kontrollere baggrunden ved at omdanne den lineariserede vektor i fravær af PCR-fragmenter.
      Bemærk: I tilfælde af at afsløre de første lave sekretion niveauer, brug S.cerevisiae protease mangelfuld stammer som BJ5465 at fremme akkumulering af aktivt protein i dyrkningssupernatanter. Hvis målenzymet undergår hyperglycosylering, anvendelse af glycosylerings-deficient stammer (f.eks Δ kre2 der kun er i stand til at binde mindre mannose oligomerer) kunne være en passende løsning.
8. Plade de transformerede celler på SC drop-out-plader og inkubere dem ved 30 ° C i tre dage. Plate (på SC drop-out-plader suppleret med uracil) URA3 ^- S. cerevisiae celler, der mangler plasmidet som negativ kontrol til screening (se nedenfor).

2. High-Throughput Screening Assay (figur 3)

1. Fyld et passende antal sterile plader med 96 brønde (23 plader til at analysere et bibliotek af 2.000 kloner) med 50 pi minimalt medium per brønd ved hjælp af en pipetteringsrobot.
2. Pick individuelle kolonier fra SC-drop out plader og overføre dem til de plader med 96 brønde.
   1. I hver plade, pode kolonne nummer 6 med forældretypen som intern standard og godt H1 med URA3 ^- S. cerevisiae-celler (i SC medium suppleret med uracil) uden plasmid som en negativ kontrol.
      Bemærk: Well H1 er fyldt specifikt med drop-out medier suppleret med uracil. En tom brønd indeholdende medier uden celler kan også fremstilles som en yderligere sterilitet kontrol.
3. Dæk pladerne med deres låg og pak dem i Parafilm. Pladerne inkuberes i 48 timer ved 30 ° C, 225 rpm og 80% relativ fugtighed i et fugtigt shaker.
4. Fjern Parafilm, tilsættes 160 pi ekspression medium til hver brønd ved hjælp af pipettering robot, forsegl pladerne og inkuberes dem i yderligere 24 timer.
   Bemærk: Minimal medium og udtryk medium er forberedt som rapporteret andetsteds ^19. Sekretionsniveauer kan variere afhængigt af genet under undersøgelse og i overensstemmelse hermed, than inkubationstider skal optimeres i hvert enkelt tilfælde at synkronisere cellevækst i alle brøndene.
5. Centrifuger plader (Master plader) ved 2.800 x g i 10 min ved 4 ° C.
6. Transfer 20 pi af supernatanten fra brøndene i master pladen til replika plade ved anvendelse af en væske håndtering robot multistation.
   Bemærk: At fremme enzymsekretion det tilrådeligt at erstatte det native signalpeptid af målproteinet ved signalpeptider almindeligvis anvendes til heterolog ekspression i gær (fx den α faktor prepro-leder, lederen af K ₁ Killer toksin fra S. cerevisiae, eller endda kimære versioner af begge peptider ^13). Alternativt kan det native signalpeptid udelukkende udviklet til sekretion i gær.
7. Tilsæt 20 pi 2 mM p -methoxybenzylalcohol i 100 mM natriumphosphatpuffer pH 6,0 ved hjælp af pipetteringsrobot. Rør pladerne kortvarigt med en 96-vill plade mixer og inkuber dem i 30 minutter ved stuetemperatur.
8. Med pipetteringsrobot, tilsættes 160 pi af FOX reagens til hver replika plade og rør kortvarigt med blanderen (slutkoncentration af FOX blandingen i brønden: 100 uM xylenol orange, 250 uM Fe _{(NH4) 2 (SO4) 2} og 25 mM H ₂ SO _4).
   1. Tilføj flere additiver til reagenset for at forbedre følsomheden, såsom organiske co-opløsningsmidler (DMSO, ethanol, methanol) eller sorbitol ^17. Her, forstærke responset ved tilsætning sorbitol til en endelig koncentration på 100 mM (figur 4).
9. Læs pladerne (end-point-tilstand, t ₀₎ ved 560 nm på en pladelæser.
10. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur, indtil farven udvikler og måle absorptionen igen (t _1).
    1. Beregne den relative aktivitet af forskellen mellem Abs værdien efter inkubering og af den første måling normaliseret til parental type for hver plade (AT ₁ - t _0).
11. Emne de bedste mutant hits til to på hinanden følgende re-screeninger for at udelukke falske positiver.
    Bemærk: Typisk re-screeninger omfatter plasmid isolering fra gær, forstærkning og rensning i Escherichia coli, efterfulgt af transformation af friske gærceller med plasmidet ^19. Hver udvalgt klon er re-screenet i pentaplicate.

Representative Results

AAO fra P. eryngii er et ekstracellulært flavooxidase der leverer fungale peroxidaser med _{H2O 2 for} at starte angribe lignin. To segmenter af AAO blev udsat for fokuseret-rettet evolution ved morphing for at styrke sin virksomhed og dens udtryk i S. cerevisiae ^19. Uafhængigt af de udenlandske enzymer nærede af S. cerevisiae, den mest kritiske spørgsmål ved konstruktion mutantbiblioteker i gær vedrører konstruktion af specifikke overlappende områder at favorisere splejsning mellem fragmenter og deres kloning i lineariserede vektor. I det foreliggende eksempel for hver PCR-reaktion, alle fragmenterne havde udhæng på ca. 50 bp for at fremme in vivo splejsning i gær. Antallet af rekombinationsbegivenheder er afhængig af antallet af segmenter, der skal samles og klonet med den lineariserede vektor (dvs. to crossover begivenheder fandt sted mellemtre PCR-segmenter -de to mutagene segmenter flankerer den ikke-mutageniserede segment- plus to yderligere crossovers med den lineariserede vektor, figur 1). Ifølge vores erfaring, overlappende sekvenser længere end 50 bp mindske sandsynligheden for interne rekombination, mens de ikke forbedrer transformation effektivitet.

Mutations belastninger blev justeret ved prøveudtagning mutant biblioteker med forskellige landskaber, beregning af antallet af kloner med <10% af forældrenes enzymaktivitet, og yderligere at kontrollere dem ved sekventering en tilfældig stikprøve af aktive og ikke-aktive varianter (figur 5A). Til bestemmelse af koefficienten varians S. cerevisiae-celler blev transformeret med det parentale AAO og udpladet på SC-drop out plader. Individuelle kolonier blev opsamlet og inokuleret i en 96 brønds-plade og aktiviteten af ​​klonerne blev evalueret fra friske præparater. Mutagen prøve2 (Taq / _MnCl2 0,05 mM) blev valgt som udgangspunkt for bibliotek konstruktion og screening.

Som den biologiske aktivitet af AAO øger H ₂ O ₂ koncentrationen i reaktionsmediet, søgte vi efter en følsom og nøjagtig analyse for at kvantificere mindre ændringer i H ₂ O _2. FOX er en kemisk fremgangsmåde baseret på Fenton reaktionen ^20, hvorved oxidation af H ₂ O ₂ drev Omsætningen af Fe ³⁺ med xylenol orange til dannelse af en blå-violet kompleks (o -cresolsulfone-phthalein 3 ', 3' '- bis (methylimino) diacetat ε ₅₆₀ = 1,5 x 10 ^{4 M-1cm-1).} Ferro oxidationstrin blev amplificeret ved tilsætning sorbitol for at forbedre analysens følsomhed og øgede udbredelse af radikaler med en tilsyneladende ε ₅₆₀ = 2,25 x 10 ⁵ M ^{-1 cm-1} (Figur 4).

Detektionsgrænsen for dette assay (i uM området) blev beregnet ved blindforsøget metode i en 96-brønds plade med standarder i tre eksemplarer (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 og 4 uM H ₂ O ₂ ) og ved hjælp af flere supernatanter fra S. cerevisiae mangler URA3 ^- plasmidet (figur 5B). Assayet var lineært i nærvær af sorbitol (op til 8 uM H ₂ O _2), og selv om linearitet var mere vedholdende i fravær af dette sukker (mindst op til 30 uM H ₂ O ₂₎ reaktion var svagere (f.eks ved 6 pM af H ₂ O _2, en 4 ganges forøgelse blev opnået i nærvær af sorbitol -Deep purple- fra en absorbans på 0,24 i dens fravær -Dark orange- (figur 5B)). Forholdet mellem Abs og AAO koncentrationen blev evalueret med stigende mængder af enzyme (fra gærsupernatanter) og en lineær respons blev observeret; ^R2 = 0,997 (figur 5C).

Det er bemærkelsesværdigt, at FOX signalet var stabil i flere timer uden nogen synlig forstyrrelse af de forskellige elementer i dyrkningsbouillonen. Den anslåede følsomhed FOX var ~ 0,4 uM af H ₂ O ₂ produceret af AAO i supernatanten i nærværelse af sorbitol og ~ 2 uM i dens fravær.

En mutant bibliotek af 2.000 kloner blev konstrueret og screenet med denne analyse. Adskillige AAO mutanter blev identificeret med især forbedret sekretion og aktivitet mod p-methoxybenzyl alkohol (figur 5D) ^19.

Figur 1.. Morphing Protokol for AAO Evolution To forskellige regioner i AAO var rettet til tilfældig mutagenese og rekombination: M1 (blå, 590 bp), der omfatter signalpeptidet (SP), M2 (gul, 528 bp). HF-regionen (grå, 844 bp) blev forstærket med high fidelity polymeraser. Mutagene regioner blev kortlagt i krystalstrukturen af AAO (FBF ID: 3FIM). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Fremstilling af PCR-produkter og det lineariserede vektor (A) Analytisk agarosegel (1% vægt: volumen). Indeholdende en molekylvægtmarkør (1 kb stige) i bane 1 og 7; BamHI og XhoI lineariseret vektor, bane 2; PCR segment M1, bane 3; PCR segment M2, bane 4; PCR segment HF, bane 5; in vivo samles vektor lineariseret med Nhel (indeholdende den fulde AAO genet med regioner MI, HF og M-II), bane 6. (B) Vector linearisering, bane 1 og 6 molekylære standarder, 1 Kb ladder; plasmid miniprep, bane 2; plasmid lineariseret med Nhel, bane 3; plasmid lineariseret med Bam HI og Xho I, bane 4; lineariseret plasmid opnået ved gel ekstraktion og oprydning efter fordøjelse, bane 5. (C) Protokol til plasmid oprensning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. High-throughput screening-protokollen. Oversigt over processen. Klik her for at se et større version af dette tal.

Figur 4. FOX Method. White rådsvamp angribe cellevæggen af træ gennem en Fenton reaktion, der frembringer hydroxyl radikal OH ^•. FOX metode par denne reaktion at xylenol orange (XO), og absorbansen af XO-Fe ³⁺ kompleks måles ved 560 nm. Jern oxidation forstærkes ved tilsætning af sorbitol til blandingen reagens. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. mutagene Landscapes for morphing biblioteker ved hjælp af forskellige risiko for fejl PCR Betingelser og Validering af Screening Assay. (A ng>) Morphing landskaber. Solid vandret linje viser aktiviteten af ​​forældretypen i assayet, mens de stiplede linjer angiver varianskoefficient af assayet. Procenterne angiver antallet af kloner med mindre end 10% af den parentale enzymaktivitet. Aktiviteter er plottet i faldende rækkefølge. (B) FOX Detektionsgrænsen blev evalueret med stigende koncentrationer af H ₂ O ₂ i nærvær (sorte cirkler) og fravær (hvide firkanter) sorbitol. (C) Lineær korrelation mellem AAO koncentration (transformerede supernatanter) og Abs _{560 nm.} Hvert point svarer til gennemsnittet af 8 forsøg og inkluderer standardafvigelsen. (D) Mutant bibliotek landskab. De valgte varianter (skygget firkantede) blev screenet igen som rapporteret andetsteds ^19. Solid linje viser aktiviteten af ​​AAO forældrenes type.> Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne artikel har vi opsummeret de fleste af de tips og tricks ansat i vores laboratorium til ingeniør enzymer ved dirigeret evolution i S. cerevisiae (under anvendelse AAO som eksempel), således at de kan tilpasses til anvendelse med mange andre eukaryot enzymsystemer ved blot at følge den fælles tilgang beskrevet her.

Med hensyn til bibliotekets skabelse morfing er en hurtig one-pot-metoden til at indføre og rekombinere tilfældige mutationer i små proteinmolekyler strækninger mens de resterende områder af proteinet uforandret ^16. Biblioteker med flere mutationelle belastninger kan let fremstilles og rekombineret in vivo, sammen med det lineariserede plasmid, til at generere en fuld autonomt replikerende vektor. Det er afgørende, at overlappende sekvenser flankerer hver strækning at tillade fragmenter af den fulde gen, der skal samles igen gennem in vivo rekombination, undgå ekstra PCR-reaktioner og in vitro ligeringstrin. I denne protokol, frekvensen af ​​crossover begivenheder mellem PCR-fragmenter kan øges ved at reducere størrelsen af ​​de overlappende områder, selv om dette kan kompromittere transformationseffektiviteten. Uanset de DNA-polymeraser, der anvendes til mutagen PCR, kan de mutationelle belastninger justeres ved tidligere konstruere og analysere små mutantbibliotek landskaber (figur 5A). Anvendes GeneMorph II Kit, er det stadig tilrådeligt at følge denne fremgangsmåde, da in vivo-DNA rekombination især kan ændre mutationsmønstre belastninger anslået af producenten. Generelt mutante landskaber i heraf 35 - 50% af de samlede screenede kloner har mindre end 10% af den parentale aktivitet er egnede til målrettet evolution kampagner, selvom dette antal varierer i funktion af målproteinet og dets aktivitet. Typisk er analysen af ​​mutant biblioteker landskaber yderligere verificeret ved DNA-sekventering af en stikprøve af mutanter. I det foreliggende eksempel TaqDNA-polymerase blev anvendt på grund af sin høje fejlprocent, som er knyttet til den manglende 3'→ 5'proof-læsning exonukleaseaktivitet. De mutationelle belastninger i Taq-biblioteker blev modificeret ved tilsætning af forskellige koncentrationer af _MnCI2, men brugen af ubalancerede dNTP'er og / eller reduktionen af gen-skabelon-koncentrationer er også egnede muligheder. Iboende begrænsninger ved morphing kommer fra antallet af segmenter, der skal rekombineres. Ifølge vores erfaring, kan op til fire protein blokke (fem crossover begivenheder tælle de rekombination områder med den lineariserede vektor) splejses med gode transformation udbytter (~ 10 ⁵ kloner pr transformation reaktion). Denne metode kan let modificeres til udført flere site-mætning mutagenese (fx ved brug NDT degenererede primere eller skabe degenerering i 22 unikke codon) at udforske flere positioner samtidigt mens en markant nedsættelse af screening indsats ^21,22.

"blind" screening protokol for AAO er ekstremt følsom og pålidelig (baseret på direkte påvisning af H ₂ O ₂ uanset det anvendte substrat af enzymet), som repræsenterer en komplementær assay til andre veletablerede indirekte protokoller til at opdage peroxider (for det meste kobling peroxidaser med kolorimetriske substrater). Faktisk har FOX assay rutinemæssigt blevet anvendt til at måle H ₂ O ₂ i biologiske væsker, og det kan nu let omsættes til protokoller til at udvikle sig AAO og enhver anden H ₂ O ₂ producerende enzymer (f.eks glucoseoxidaser, cellobiose dehydrogenaser, glyoxal oxidaser, methanol oxidaser), især for aktivitet på ikke-naturlige substrater hvor reaktioner ellers svært at opdage.

S. cerevisiae er den mest passende vært til målrettet evolution af eukaryote gener, da det giver høje transformationseffektiviteter (op til 1 x 10⁶ transformanter / ug DNA), udfører komplekse posttranslationel processering og modifikationer (herunder N- og C-terminale forarbejdning, og glycosylering) og det eksporterer fremmede proteiner i dyrkningsbouillonen via en sekretoriske bane. Desuden veletablerede molekylærbiologiske værktøjer til rådighed til at arbejde med denne gær, herunder uni- eller tovejs episomale (ikke-integrativ) shuttle-vektorer under kontrol af initiativtagerne til forskellige styrker. Sidst men ikke mindst, har den høje frekvens af homolog DNA-rekombination tilladt en række metoder, der skal udvikles til at opnå DNA mangfoldighed, der i øjeblikket anvendes til at udvikle enkelt proteiner, såvel som mere komplekse enzymveje ^{8, 12, 13, 23.} in vivo hul reparation og korrekturlæsning indretning af denne gær kan også anvendes til at skabe kimærer når rekombinere forskellige gener (med ca.. 60% af DNA-sekvens identitet), samt at blande bedste afkom / mutationer fra en directed evolution kampagne, eller at samle in vitro og in vivo-rekombination metoder i en runde af evolution, hvorved berigende mutantbiblioteker i form af Sammenfoldelighedsindekset og funktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)