Summary

Instrueret Evolution Method i<em> Saccharomyces cerevisiae</em>: Mutant Bibliotek Creation og Screening

Published: April 01, 2016
doi:

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Målrettet evolution i Saccharomyces cerevisiae byder på mange attraktive fordele ved udformningen enzymer til bioteknologiske anvendelser, en proces, der indebærer opførelse, kloning og ekspression af mutant biblioteker, koblet til høj frekvens homolog DNA-rekombination in vivo. Her præsenterer vi en protokol til at skabe og skærm mutant biblioteker i gær baseret på eksemplet med en svampe aryl-alkohol oxidase (AAO) at øge sin samlede aktivitet. To protein segmenter blev underkastet fokuseret-målrettet evolution ved tilfældig mutagenese og in vivo DNA-rekombination. Udhæng af ~ 50 bp flankerende hvert segment tillod den korrekte samling af AAO-fusionsgen i en lineariseret vektor, der giver anledning til en fuldstændig autonomt replikerende plasmid. Mutantbiblioteker beriget med funktionelle AAO varianter blev screenet i S. cerevisiae supernatanter med en følsom high-throughput assay baseret på Fenton reaktionen. Den generelle proces medbibliotekskonstruktion i S. cerevisiae her beskrevne let kan anvendes til at udvikle mange andre eukaryote gener, undgå ekstra PCR-reaktioner, in vitro DNA-rekombination og ligeringstrin.

Introduction

Rettet molekylær evolution er en robust, hurtig og pålidelig metode til at designe enzymer 1, 2. Gennem iterative runder af tilfældig mutation, rekombination og screening, kan genereres forbedrede versioner af enzymer, der virker på nye substrater, i hidtil ukendte reaktioner, i ikke-naturlig miljøer, eller endda at hjælpe cellen til at opnå nye metaboliske mål 3-5. Blandt værterne, der anvendes i dirigeret evolution, den ølgær Saccharomyces cerevisiae giver et repertoire af løsninger til den funktionelle udtryk af komplekse eukaryote proteiner, der ellers ikke findes i prokaryote modstykker 6,7.

Bruges udtømmende i cellebiologiske studier, denne lille eukaryote model har mange fordele i form af post-translationelle modifikationer, nem manipulation og transformation effektivitet, som alle er vigtige egenskaber at ingeniør enzymer ved dirigeret evolution 8. Det høje frekvensaf homolog DNA-rekombination i S. cerevisiae koblet til dens effektive korrekturlæsning apparat åbner en bred vifte af muligheder for bibliotekets oprettelse og gen samling in vivo, fremme udviklingen af forskellige systemer fra enkelte enzymer til komplekse kunstige veje 9-12. Vores laboratorium har brugt det sidste årti designe værktøjer og strategier for den molekylære evolution af forskellige ligninaser i gær (oxidoreduktaser involveret i nedbrydningen af lignin under naturtræ henfald) 13-14. I denne meddelelse præsenterer vi en detaljeret protokol til at forberede og skærm mutant biblioteker i S. cerevisiae for en model flavooxidase, -aryl-alkoholoxidase (AAO 15) -, der let kan oversættes til mange andre enzymer. Protokollen indebærer en fokuseret-rettet evolution metoden (Morphing: Mutagen Organized rekombinationsprocessen ved hjælp af homolog in vivo gruppering) bistået af gærcelle apparatet 16, enda meget følsom screening assay baseret på Fenton reaktionen for at detektere AAO aktivitet udskilles i dyrkningsvæsken 17.

Protocol

1. Mutant Bibliotek Construction Vælg regionerne at blive udsat for morphing med hjælp af beregningsmæssige algoritmer baseret på de tilgængelige krystalstruktur eller homologi modeller 18. Her målretter to områder af AAO fra Pleurotus eryngii for tilfældig mutagenese og rekombination (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mens amplificering af resten af genet (844 bp) af high-fidelity PCR (figur 1). Bemærk: Flere segmenter kan studer…

Representative Results

AAO fra P. eryngii er et ekstracellulært flavooxidase der leverer fungale peroxidaser med H2O 2 for at starte angribe lignin. To segmenter af AAO blev udsat for fokuseret-rettet evolution ved morphing for at styrke sin virksomhed og dens udtryk i S. cerevisiae 19. Uafhængigt af de udenlandske enzymer nærede af S. cerevisiae, den mest kritiske spørgsmål ved konstruktion mutantbiblioteker i gær vedrører konstruktion af spec…

Discussion

I denne artikel har vi opsummeret de fleste af de tips og tricks ansat i vores laboratorium til ingeniør enzymer ved dirigeret evolution i S. cerevisiae (under anvendelse AAO som eksempel), således at de kan tilpasses til anvendelse med mange andre eukaryot enzymsystemer ved blot at følge den fælles tilgang beskrevet her.

Med hensyn til bibliotekets skabelse morfing er en hurtig one-pot-metoden til at indføre og rekombinere tilfældige mutationer i små proteinmolekyler strækn…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

Materials

1. Culture media
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar Difco 214010
Cloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378 CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G0750 CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich 83400 CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone Difco 211677
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil Sigma Aldrich U1128
Yeast Extract Difco 212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids Difco 291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil Sigma-Aldrich Y1501
Name Company Catalog Number Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix Agilent genomics 200415-51 25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase Bio-rad 172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M8054 CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D4545 For error prone PCR
Name Company Catalog Number Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme New England Biolabs R0136S
Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9001S
XhoI restriction enzyme New England Biolabs R0146S
Gel Red Biotium 41003 For staining DNA
Name Company Catalog Number Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich F3754 CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol Sigma Aldrich W209902 CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876 CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30% Merck Millipore 1072090250 FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt Sigma-Aldrich 52097 CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Agarose gel stuff
Agarose Norgen 28035 CAS Nº 9012-36-6
Gel Red Biotium 41003 DNA analysis dye
GeneRuler 1Kb Ladder Thermo Scientific SM0311 DNA M.W. standard
Loading Dye 6x Thermo Scientific R0611
Low-melting temperature agarose Bio-rad 161-3112 CAS Nº 39346-81-1
Name Company Catalog Number Comments
5. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465 LGC Promochem, Spain ATTC 208289 Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells Agilent genomics 200150 For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740,609,250 DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit Macherey-Nagel 740,588,250 Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit Sigma-Aldrich YEAST1-1KT Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I Zymo research D2001 Plasmid extraction from yeast
Name Company Catalog Number Comments
6. Plates
96-well plates Greioner Bio-One 655101 Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)
96-well plates Greioner Bio-One 655161 Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid Greioner Bio-One 656171 Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)

References

  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
  4. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  5. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
  6. Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).
  7. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
  8. Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
  9. Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
  10. Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
  11. Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).
  13. Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
  14. Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , 1-22 (2014).
  15. Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
  16. Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919 (2014).
  17. Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
  18. Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
  19. Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
  20. Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
  21. Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  22. Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , .
  23. Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).

Play Video

Cite This Article
Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Alcalde, M. Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening. J. Vis. Exp. (110), e53761, doi:10.3791/53761 (2016).

View Video