Retroductal颌下腺灌输和本地化分割照射在涎腺功能减退症大鼠模型

Introduction

健康组织的侧支破坏占了许多癌症治疗的有害副作用。与该辐射场位于大唾液腺的一部分或全部都不可避免地破坏。因此，经历骨髓移植前头部和颈部癌，子宫颈癌淋巴瘤，或全身辐射放疗大多数患者遭受的辐射，唾液腺机能减退^2-6的最常见和最 ​​持久的不利效果之一。

唾液腺的流体产生腺泡细胞对辐射十分敏感。损坏唾液腺导致唾液流，称为唾液腺机能减退的条件的急剧减少。在唾液流量慢性减少损害的关键口腔活动，如咀嚼，吞咽，语言和口味，但剧烈的疼痛，黏膜撕裂，吞咽困难，机会性感染病态的后遗症，和龋齿恶化一个病人的福祉和功能^2,3。

由于放疗相关的唾液腺细胞的损失是不可逆的，有口干没有矫正治疗。专注于人工唾液替代品和药品prosecretory平息目前的症状治疗无效的长期救援^6。虽然改进的辐射递送技术已经帮助减少的病症的严重程度，正常组织的毒性及其并发症留在癌症治疗中^6,7-一个限制因素。先发制人的措施，以防止放射治疗相关的并发症，因此，成为常态。正在探索的清除自由基的氧，促进细胞再增殖，或增强DNA修复放射保护剂，以避免唾液功能减退^8-11。

外分泌腺唾液腺分泌物流入通过主排泄管道口。个的口腔内插管E对于造影剂注射排泄管道作为门诊手术常规做。利用类似的方法，唾液腺可以直接针对局部治疗^12。除了降低的全身性副作用的风险，retroductal腺滴注增加的好处。围绕导管树唾液腺细胞的单层布置允许指定所有唾液腺上皮细胞，以及腺充当屏障纤维封装，以减少不必要的治疗性传播。从本质上讲，唾液腺是最适宜于腺体的苦难，如放射性唾液腺功能减退的有针对性的治疗。

（ - 2.5格雷/分/天，每周五天1.8），为期两周的用于癌症治疗常规辐射中的小剂量输送。因此，无线电防护治疗，显示在实验模型对旷日持久的辐射方案的疗效有较大的临床影响。康博分次辐射后mised唾液腺功能已被记录在小动物，但辐射源，剂量分数，和使用的协议是多种多样^9,10,13。

该报告建立了retroductal交付使用病人相关的辐射源和剂量率大鼠颌下腺局部放射方法。

Protocol

所有的程序是由路易斯安那州立大学健康，什里夫波特，动物护理和使用委员会批准，并分别按照照顾和使用实验动物的指导方针NIH。

1.鼠颌下腺涎腺插管

1. 注射器管组件的研制
   1. 切PE10聚乙烯管的一个10cm的长度用手术刀。容纳食指和拇指之间的管道的两端。加热上述平缓火焰管的中间部分，并轻轻拉伸软化的管道通过拉双方加倍其长度。
   2. 在切割用手术刀中间管以^45°角拿到2套管-每一个锥形端。通过在0.5毫升的胰岛素注射器的29克针嵌合它扩大插管的非锥形端。
   3. 取出套管，并绘制220微升盐溶液进入注射器。点击赶走气泡。适合cannul一个在针，推动注射器的柱塞以排出空气，并确保通过套管的溶液自由流动。音量调整到200微升。
2. 颌下腺导管的口腔内插管
   注：高压灭菌仪器之前的程序，并在两者之间进行消毒在热珠灭菌程序。
   1. 权衡只SD大鼠，并分配氯胺酮的计算量（42毫克/千克）/赛拉嗪（8毫克/千克）/乙酰丙嗪（1.4毫克/千克）的混合在一个皮下注射器。
   2. 通过抓住食指和一只手的拇指之间的尾巴的基部和滑另一方面在主体把握它抑制动物。其余部分的食指和中指沿头部两侧，同时容纳用拇指和其余手指躯干。
   3. 注入在后肢肌肉组织的麻醉剂。确认通过脚趾捏和眼睑反射麻醉深度。敷眼润滑剂防止干燥而动物处于麻醉状态。
   4. 放置一个专门设计的平台（ 图1）上的动物，和横杆上接合的上门牙。通过循环围绕下门牙的橡胶带和它锚定到平台拉下颌向下。
   5. 通过无菌缝合通过舌头将其提起，以提高口底。夹住缝合用止血，并且将它传递横杆。
   6. 扩大与定制的脸颊吊具（ 图1）的脸颊，并在解剖显微镜下找到在口底舌下乳头。
   7. 掌握使用细腻镊子预制PE10管的锥形端。轻轻操纵套管的尖端插入舌下乳头乳腺导管口。通过线程它3确认导管的放置 - 5 mm产品到管道;确保它传递而没有任何阻碍。
3. 颌下腺Instillation
   1. 注射阿托品（0.5毫克/千克）皮下的颈背，并等待10分钟在唾液分泌减少。
   2. 固定在插管到导管孔用氰基丙烯酸酯（胶）的下降，并使其干燥。灌输通过在〜50微升/分钟的速度缓慢地按下针筒柱塞在压盖（200微升/腺）的溶液中。
   3. 粉碎用止血钳管道，并小心地取出注射器。保留在管道中的管道30 - 60分钟，直到动物恢复意识。卸下将舌头缝合。
   4. 动物转移到一个单独的笼子里，并用热灯恢复过程中保持温暖。不要离开无人看管的动物，直到它已恢复了意识，以保持胸骨靠着。
   5. 动物是完全卧床后，在不受限制地访问食物和水动物饲养安置它。

2.局部分割照射颌下腺

1. 抑制动物如之前描述的，并用氯胺酮肌内给药（33毫克/千克）/赛拉嗪（6毫克/公斤）/乙酰丙嗪（1毫克/千克）混合在后肢麻痹。确认麻醉深度，并使用润滑剂涂抹到眼睛。
2. 广场上的直线加速器桌面动物仰卧，并通过倾斜头部延长它的脖子。准直辐射场3厘米（狭缝宽度），以从下颌骨到胸骨的顶部的下边界包围的区域。
3. 放置1厘米组织等效丸剂以上的区域中，并调整辐射源和丸剂至100cm的顶部之间的距离。
4. 照射使用线性加速器的6 MV光子束的动物（2.5 Gy）进行。从辐射源剂量率，字段大小和距离弹丸表面将决定的曝光时间。在设置当前，动物在〜1戈瑞/分钟的剂量率照射。
5. 重复曝光;总共8 2.5格雷/天天; 4天/周，其间有2天的间隔。保持动物的体温恢复过程中。动物转移到动物饲养后，它完全卧床。
6. 收集刺激下颌下腺唾液8周照射后，测量腺体功能^14。由冷的4％多聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水pH 7.2的的心脏灌注安乐死麻醉下的动物。消灭颌下腺组织学和免疫组化分析^14。

Representative Results

适应微创技术造影，大唾液腺的局部治疗是可行的。在大鼠颌下腺唾液腺Retroductal给药试图通过沃顿管道口腔内插管（ 图2）。沃顿的唾液腺导管上位于口底的舌下乳头打开，但这些孔不容易看到。插管的插入物，因此，通过温和探测完成。为了避免不良出血或穿孔管，同时将套管没有使用武力。在导管插管的光滑无电阻的通道是由管子的平缓来回运动证实。

在最初的实验中插管通过注入用苏木或台盼蓝溶液腺体，和在实施安乐死的动物评价腺染色（图3）确认。 GL和填充体积由摘除腺体可视化导管树的染色确定。对于动物体重150 - 250微升的解决方案 - 250克，腺体完全填充用200来实现的。快速输液能增加腺压力和提高损伤和biospread的风险。为了避免组织破坏，将溶液在约50微升/分钟的速度逐渐施用

大鼠颌下腺媲美他们对辐射的敏感性¹⁵腮腺。进行了研究颌下腺，因为他们可以在不招致严重的脱靶效应（ 图4）有选择地照射。爱惜口腔和大量减少口腔粘膜炎和动物健康和实验结果急性口干症的影响腮腺的。我们此前在大鼠的研究单，大剂量辐射^11,16，但压裂进行tionated剂量更相关的临床实践。动物的颈部区域，因此被每日暴露于小剂量的辐射。实现辐射剂量的位于皮肤表面附近的颌下腺内均匀堆积，从1.03克/立方厘米的密度的均匀凝胶制成的软组织等效丸药辐射过程中放置​​在颈部。

分次放射计划对唾液流量为8周确定放疗后显示，每天暴露于2.5戈瑞的增量急剧减少唾液流量的影响。在唾液输出的近10倍的降低，记录在照射的动物中相对于未照射的动物（2面学生t-检验，P <0.01; 图^5）14。结果证实在动物中建立辐射诱发的唾液功能减退症。

图1.定制化平台的建设和面颊吊具。僵硬4毫米丝弯成如图3双面矩形（11厘米高×13厘米宽），并在中心鞠躬横杆。导线的端部被弯曲成环，和螺杆通过它们传递到组件固定到塑料板（25厘米长×15厘米宽×0.8厘米深）。中央螺钉插入5厘米后方线组件。它有助于锚的拉开下颌内陷的橡皮筋：与扩口端制作的一次性1毫米弯曲的粗丝的定制脸颊吊具在一个“U形”。塑料管材是越过线端，以防止口腔粘膜损伤。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2.插管大鼠颌下腺排泄管道的，舌头上调至提升口底，和聚乙烯套管插入到位于口底的颌下腺导管口。 请点击此处查看大图这个数字。

图3.颌下腺苏木素液输注，以确认技术。腺染色证明在颌下腺解决方案的成功管理。注意，在左上角的舌下腺不染色。非输注控制腺体显示在左侧。e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图4.辐照放置动物，动物被放置在仰卧直线加速器表，头回题为延长脖子。准直狭缝宽度为3厘米。 请点击此处查看该图的放大版本。

分次辐射对颌下腺功能。盐碱地图5.影响辐射之前，颌下腺滴注。动物的颈部在2.5格雷/天的级分，照射8天。该DAT显示一个是平均辐射方案完成8周后刺激颌下唾液流率的±SEM。下图是复制与人类基因治疗，玛丽·安·博特，公司发行¹⁵版权许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

唾液腺经常接受的辐射剂量超出经历了头颈部肿瘤，颈淋巴结选修消融或地区血液系统恶性肿瘤放疗的病人组织恢复的门槛。尽管腺的流体分泌腺泡细胞终末分化，它们是矛盾的对辐射敏感。分泌功能辐射和不可逆转的破坏腺体结果的第一周内滴在慢性低口水输出。为了打击穷人腺体功能和随之而来的口腔干燥，保存或分泌功能的恢复是至关重要的。新的治疗方法，以防止或修复辐射的伤害正在调查^{1，8-11，16-20。}

治疗的全身施用携带在非靶组织不希望的效应的固有风险。旨在递送到唾液腺减少这种风险。 Retroductal基因治疗是预防或有效补救辐射相关唾液腺苦恼^{1，9，11，16,17,20。}然而，使用相同的技术，唾液腺，也可以重新设计，以表达和分泌的蛋白质，异位。利用唾液中的细胞基底外侧内分泌分泌途径，转基因表达和分泌激素进入血液可达到^21。基因转移到唾液腺可以，因此，可以有效地扩展到某些内分泌紊乱的纠正。

虽然在小动物唾液腺导管插管可能会非常棘手，实际上是中央对珩磨技术。插管的锥形端部可在插入期间容易扭结，并使输注困难。增加的背压而排出溶液应预先警告在油管弯曲的，并且有必要重新导管插入导管。解剖变异，如迷走胆管口或增加管道迂曲，随着病变沿口限制像牙关紧闭或黏膜下纤维开放可以使颌下腺交付是一个挑战。一个不通透性染料输注当实践本技术可以精确递送的一个有用的指标。插管和温和，无阻力输液的妥善安置是对手术成功的重要因素。

癌症患者常常与由线性加速器产生的兆伏光子处理。辐射是在周为一疗程小剂量每天交付。剂量分馏提供恢复的时期之间辐射，以减少对健康组织的毒性和敏感肿瘤。直线加速器的穿透力极强的能量束是深部肿瘤的治疗。并且，用于治疗肿瘤接近皮肤的，一个组织等效丸剂用于减少光子穿透的深度。类似于临床实践中，线性加速器递送分次辐射可以用于局部地照射subma小动物ndibular腺体。然而，立即皮下腺体的位置就必须大丸剂的放置腺体内达到> 90％的辐射剂量。弹丸的厚度取决于光子的能量和组织渗透的期望深度来计算。

在这篇文章中，我们提供了进行retroductal颌下腺灌输和大鼠颌下腺的地方分割照射实验的指导方针。这是我们希望强调的方法将有助于实验装置的研究人员冒险进入唾液腺放射性毒性的领域。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intramedic Polyethylene tubing (PE10)	Becton Dickson	427401
1/2 cc Insulin Syringe U-100	Becton Dickson	309306
Artificial Tears	Miller Vet Supply	5098-9840-64
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Perma-Hand silk suture	Ethicon	K833H
Graefe forcep	Fine Science Tools	11051-10
Olympus SZX16 Stereo Microscope	Hunt Optics and Imaging
6 MV Linear Accelerator	Elekta
Bolus - Skinless	Civco	MTCB410
Heat Lamp	Braintree Scientific	HL-1 110V