Introduction
Säkerheter förstörelse av frisk vävnad svarar för ett antal skadliga biverkningar av cancerbehandlingar. En del av eller hela de stora spottkörtlarna som ligger med strålningsfält oundvikligen förstörs. Därför är de flesta patienter som genomgår strålbehandling för huvud- och halscancer, livmoderhalscancer lymfom, eller hela kroppen strålning före benmärgstransplantation lider en av de vanligaste och mest ihållande negativa effekter av strålning, spottkörtel underfunktion 2-6.
De fluidproducerande acinarceller i spottkörtlarna är mycket känsliga för strålning. Skador på spottkörtlarna orsakar en drastisk minskande av salivflödet, ett tillstånd kallat saliv hypofunktion. Den kroniska minskning av salivflödet försämrar viktiga orala aktiviteter såsom tugg, svälja, tal, och smak, men den sjukliga följderna av intensiv smärta, slemhinnor tårar, dysfagi, opportunistiska infektioner och karies förvärrar enpatientens välbefinnande och funktion 2,3.
Eftersom strålbehandling associerade salivcellförlust är irreversibel, det finns ingen korrigerande behandling av muntorrhet. Nuvarande behandling som fokuserar på assuaging symtom med konstgjorda salivsubstitut och prosecretory läkemedel är ineffektiva för långvarig lindring 6. Även om förbättrade strålningsleveranstekniker har hjälpt minska svårighetsgraden hos tillståndet, normal vävnadstoxicitet och dess komplikationer förblir en begränsande faktor vid cancerbehandling 6,7. Förebyggande åtgärder för att förhindra strålbehandling relaterade komplikationer, därför blir normen. Radioskyddande medel som rensar fria radikaler syreradikaler, främja cellrepopulation eller förbättra DNA-reparation undersöks för att avvärja saliv hypofunktion 8-11.
Sekret av exokrina salivkörtlar rinna in i munnen genom huvudutsöndringskanalerna. Intra-oral kanylering av the exkretoriska kanaler för insprutning av kontrastmedel görs rutinmässigt som ett öppenvården förfarandet. Med hjälp av ett liknande tillvägagångssätt, kan spottkörtlar direkt riktade för lokaliserad behandling 12. Bortsett från att minska risken för systemiska biverkningar, har retroductal körtel tillförseln extra fördelar. Monoskiktet arrangemang av spott celler runt duktal trädet medger inriktning av alla spott epitelceller, och fiber inkapsling av körteln fungerar som en barriär för att minska oönskade terapeutisk spridning. I huvudsak spottkörtlar är optimalt lämpade för målinriktad behandling av körtel åkommor såsom strålningsinducerad salivunderfunktion.
Konventionell strålning för cancerbehandling levereras i små doser (1,8-2,5 Gy / fraktion / dag, fem dagar i veckan) under en period av veckor. Därför är en radioskyddande terapeutisk som visar effekt mot en utdragen strålning system i experimentella modeller har större klinisk betydelse. COMPROmeras saliv funktion efter fraktionerad strålning har spelats in i små djur, men strålningskälla, dosfraktionen och protokoll som används varierar 9,10,13.
Denna rapport fast metoder för retroductal leverans till och lokal strålning av rått submandibular körtlar använder patient relevant strålkälla och dosfraktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av LSU Health, Shreveport, Animal Care och användning kommittén och var i enlighet med NIH riktlinjer för vård och användning av försöksdjur.
1. kanylering av Rat Submandibular spottkörtlar
- Framställning av Spruta-Tubing Assembly
- Skär en 10 cm lång PE10 polyetylenrör med en skalpell. Håll båda ändarna av slangen mellan pekfingret och tummen. Värm den mellersta delen av röret ovanför en mild flamma, och försiktigt sträcka ut det uppmjukade slangen att fördubbla sin längd genom att dra båda sidor.
- Skär slangen i mitten med en skalpell i en vinkel på 45 ° för att få två kanyler - var och en med en avsmalnande ände. Expandera den icke-avsmalnande änden av kanylen genom att passa över en 29 G-nål av 0,5 cc Insulin spruta.
- Ta bort kanylen och dra 220 pl saltlösning i sprutan. Tryck här för att få bort luftbubblor. Montera cannulen över nålen och tryck sprutans kolv för att driva ut luft och säkerställa ett fritt flöde av lösning genom kanylen. Justera volymen till 200 pl.
- Intra-Oral kanylering av Submandibular Gland Duct
OBS: Autoklav instrument före proceduren, och sterilisera i-mellan förfaranden i en varm pärla autoklav.- Väga Sprague Dawley-råtta, och dispensera den beräknade volymen av ketamin (42 mg / kg) / xylazin (8 mg / kg) / acepromazin (1,4 mg / kg) blanda i en injektionsspruta.
- Hålla tillbaka djuret genom att greppa basen av svansen mellan pekfingret och tummen på en hand och dra den andra sidan över kroppen för att gripa tag i den. Vila pekfingret och långfingret längs sidorna av huvudet medan hålla bålen med tummen och återstående fingrar.
- Injicera bedövningsmedel i bakbenet muskulatur. Bekräfta djup anestesi genom tå nypa och ögonlocksreflexer. Applicera ögon smörjmedel för att förhindra torrhetdjur är under bedövning.
- Placera djuret på en speciellt utformad plattform (figur 1), och engagera de övre framtänder på den tvärgående stången. Dra underkäken ner genom looping ett gummiband runt de nedre framtänderna och förankra den till plattformen.
- Passera en steril sutur genom tungan och lyft upp för att höja golvet i munnen. Kläm suturerna med en hemostat, och passera den över den tvärgående stången.
- Expandera kinderna med en specialbyggd kinden spridare (Figur 1), och under ett dissektionsmikroskop lokalisera den sublinguala papiller på golvet i munnen.
- Ta tag i avsmalnande änden av det förformade PE10 slangen med hjälp av en känslig pincett. manipulera försiktigt spetsen av kanylen in i duktal öppningen på den sublinguala papiller. Bekräfta placering av kanylen genom att trä den 3-5 mm i kanalen; se till att det går utan några hinder.
- Submandibular Gland Instillation
- Injicera atropin (0,5 mg / kg) subkutant i nackskinnet, och vänta 10 minuter för en minskning av salivutsöndring.
- Fäst kanylen till kanalöppningen med en droppe cyanoakrylat (lim), och låt torka. Ingjuta lösning i körteln (200 | j, l / körtel) genom att långsamt trycka på sprutans kolv med en hastighet av ~ 50 | j, l / min.
- Krossa slangen med en hemostat, och försiktigt bort sprutan. Behålla slangen i kanalen för 30-60 min tills djuret återfår medvetandet. Ta suturen som håller tungan.
- Överför djuret till en separat bur, och använda en värmelampa för att hålla den varm under återhämtning. Lämna inte djuret utan uppsikt tills den har återfått medvetandet att upprätthålla sternala bakåtlutad kroppsställning.
- Efter att djuret är helt rörlig, hysa den i terrariet med obegränsad tillgång till mat och vatten.
2. Localized Fraktionerad Bestrålningav submandibulära körtlar
- Hålla tillbaka djuret, såsom beskrivits tidigare, och söva med intramuskulär administrering av ketamin (33 mg / kg) / xylazin (6 mg / kg) / acepromazin (1 mg / kg) blanda i bakbenet. Bekräfta djup anestesi, och förses med glidmedel ögonen.
- Placera djuret liggande på linjäracceleratorn tabletop, och utvidga sin hals genom att luta huvudet. Kollimera strålfältet (3 cm spaltbredd) för att omfatta området från den nedre gränsen av underkäken till toppen av bröstbenet.
- Placera en 1 cm vävnads motsvarande bolus över regionen, och justera avståndet mellan strålningskällan och övre delen av bolus till 100 cm.
- Bestråla djur (2,5 Gy) med en 6 MV fotonstråle av en linjäraccelerator. Dosrat, fältstorlek, och avståndet från strålningskällan till bolus yta kommer att diktera exponeringstiden. I den nuvarande inrätta ades djuren bestrålades vid en doshastighet på ~ 1 Gy / min.
- Upprepad exponering; 2,5 Gy / dag för totalt 8dagar; 4 dagar / vecka med en 2-dagars intervall däremellan. Håll djuret varmt under återhämtning. Överföra djuret till vivarium efter att den är helt rörlig.
- Samla stimulerad submandibular körtel saliv 8 veckor efter strålning för att mäta körtel funktion 14. Avliva djuren under narkos genom hjärt perfusion av kall 4% paraformaldehyd / fosfatbuffrad saltlösning pH 7,2. Utrota submandibular körtlar för histologisk och immunohistokemisk analys 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anpassning en minimalinvasiv sialografi teknik, är lokal behandling av stora spottkörtlar möjligt. Retroductal administration i rått submandibular spottkörtlar försöktes genom intraoral kanylering av Wharton kanaler (Figur 2). Spott kanaler i Wharton öppet på den sublinguala papiller ligger på golvet i munnen, men öppningarna inte är lätt synliga. Införande av kanylen, därför görs genom försiktig sondering. För att undvika incident blödning eller kanal perforering, ingen kraft användes medan placera kanylen. Slät resistens-fri passage av kanylen i kanalen bekräftades genom försiktig fram och tillbaka rörelse av slangen.
Kanyle under inledande experiment bekräftades genom infusion körteln med hematoxylin eller trypan blå lösning och utvärdera körtel färgning i euthanized djur (Figur 3). gloch fyllnadsvolym fastställdes genom att visualisera färgning av duktal träd i utrotas körtlar. För djur som väger 150-250 g, fick fullständig fyllning av körteln uppnås med 200 - 250 ul av lösning. Snabb infusion kan öka glandtrycket och ökar risken för skador och biospread. För att undvika vävnadsnedbrytning, lösningen administrerades successivt med en hastighet av ~ 50 | j, l / min
Rått submandibular körtlar är jämförbara med öronspottkörtlarna i deras känslighet för strålning 15. Submandibular körtlar studerades eftersom de kan selektivt bestrålas utan att ådra sig allvarliga off-target effekter (Figur 4). Sparande i munhålan och en stor volym av öronspottkörtlarna minimeras påverkan av oral mukosit och akut xerostomi på djurhälsa och experimentell resultatet. Våra tidigare studier på råtta genomfördes med enstaka stora doser av strålning 11,16, men fractionated dosering är mer relevant för klinisk praxis. Halsområdet på djuret var därför utsätts dagligen för låga doser av strålning. Att uppnå en enhetlig uppbyggnad av stråldosen inom de submandibulära körtlarna belägna nära hudytan ades en mjuk vävnad-ekvivalenter bolus tillverkad av en homogen gel med en densitet av 1,03 g / cm ^ placeras över halsen under strålning.
Effekten av fraktionerad strålning schema på salivflödet, bestämd vid 8 veckor post-strålning visar att daglig exponering för steg om 2,5 Gy reducerad salivflödet förhastat. En nära 10-faldig minskning i saliv produktionen inom bestrålade djur i motsats till icke-bestrålade djur (2-sidig Students t- test, p <0,01; Figur 5) 14. Resultaten bekräftade inrättandet av strålningsinducerad salivunderfunktion i djur.
Figur 1. Konstruktion av en anpassad plattform och kinden-spridare. En styv 4 mm tråd böjdes i en tre-sidig rektangel (11 cm höjd x 13 cm bredd) som visas, och den tvärgående stången var böjt i mitten. Ändarna av tråden böjdes till öglor, och skruvar fick passera genom dem för att fästa aggregatet till en plastkortet (25 cm längd x 15 cm bredd x 0,8 cm djup). En central skruv insattes 5 cm posteriort om trådsammansättningen. Det tjänade att förankra gummiband som drog öppna underkäken Infällt:. En specialbyggd kind-spridare gjord av en engångs 1 mm tjock tråd böjd i en "U-form" med utsvängda ändar. Plast slangar fördes över kabeländarna för att förhindra skador på munslemhinnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
: Keep-together.within-page = "1"> 
Figur 2. kanylering av Rat submandibular Gland utsöndringskanaler. Tungan höjs för att höja golvet i munnen, och polyeten kanyler infördes i submandibular kanalmynningarna ligger på golvet i munnen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Infusion av hematoxylin lösning i Submandibular Gland att bekräfta tekniken. Gland färgning vittnar om god administration av lösningen i submandibular körteln. Observera att den sublinguala körtel i det övre vänstra hörnet är inte färgas. En icke-infunderas kontroll körtel visas till vänster.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Placering av djur för bestrålning. Djuret som liggande på linjäracceleratorn bordet och huvudet titeln tillbaka att förlänga halsen. Den kollimerade spaltbredd var 3 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Effekt av fraktione strålning på Submandibular Gland funktion. Saline droppades i submandibular körtlar före strålning. Halsen på djuret bestrålades i fraktioner om 2,5 Gy / dag under 8 dagar. daten som visas är medel ± SEM för stimulerad submandibular salivflödeshastighet 8 veckor efter fullbordande av strålning schema. Figuren återges med upphovsrätts tillstånd från Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc. utgivare 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spottkörtlar får ofta stråldoser över tröskeln av vävnad återhämtning hos patienter som genomgår strålbehandling för huvud halscancer, elektiv ablation av nack noder, eller regionala hematologiska maligniteter. Även om vätske utsöndrar acinarceller av körteln är terminalt differentierade, de är paradoxalt känsliga för strålning. Sekretoriska funktion sjunker inom de första veckorna av strålning, och irreversibla körtel skada resulterar i en kronisk låg saliv utgång. För att bekämpa dålig körtel funktion och muntorrhet som följer, är avgörande att bevara eller återupprätta sekretoriska funktion. Nya behandlingar för att skydda mot eller reparera strålskador utreds en, 8-11, 16-20.
Systemisk administrering av en terapeutisk bär den inneboende risken för oönskade effekter på icke-målvävnader. Syftar leverans till spottkörtlarna minskar denna risk. Retroductal genterapi är effektivt för att förebygga elleravhjälpa strålningsrelaterade spottkörtel åkomma 1, 9-, 11, 16,17,20. Men med hjälp av samma teknik, spottkörtlar kan också omarbetade för att uttrycka och utsöndra proteiner, ektopiskt. Utnyttja den basolaterala endokrina sekretoriska vägen i saliv celler kan transgenexpression och hormon i blodet uppnås 21. Genöverföring till spottkörtlarna kan därför effektivt utsträckas till korrigering av vissa endokrina störningar.
Även kanylering av spottkörtel kanaler i små djur kan vara svårt, är praxis central honing tekniken. Den avsmalnande änden av kanyler kan krökas lätt under insättning, och göra infusion svår. Ökat baktryck medan utdrivning av lösningen bör förvarna av en böj i slangen, och nödvändigheten att åter kanylera kanalen. Anatomiska variationer såsom avvikande kanalmynningen eller ökad kanal tortuosity, tillsammans med sjukdomar som begränsar munöppning som trismus eller submukös fibros kan göra submandibular körtel leverans en utmaning. Infusion av en ogenomtränglig färgämne vid utövandet av teknik kan vara en användbar indikator på exakt leverans. Korrekt placering av kanyler och mild, motståndsinfusions är viktiga faktorer för att lyckas med förfarandet.
Cancerpatienter behandlas ofta med megavoltage fotoner som genereras av en linjäraccelerator. Strålning levereras dagligen i små doser under loppet av veckor. Dos fraktione ger perioder av återhämtning mellan strålning för att minska toxicitet på friska vävnader och medvetandegöra tumörer. Starkt penetrerande energistrålar av en linjäraccelerator är användbara för behandling av djupt liggande tumörer. Och, för behandling av tumörer närmare huden, är ett vävnads ekvivalent bolusdos som används för att minska djupet av fotonpenetrationen. I likhet med klinisk praxis, kan en linjäraccelerator levererade fraktion strålning användas för att lokalt bestråla Submandibular körtlar hos små djur. Emellertid nödvändiggör positionen för de körtlar omedelbart under huden placeringen av en bolus för att uppnå> 90% stråldosen inom de körtlar. Tjockleken av bolus beräknas beroende på energin hos fotonerna och det önskade djupet av vävnadspenetration.
I denna artikel ger vi experimentella riktlinjer för att utföra retroductal submandibular körtel instillation och lokal fraktion bestrålning av råtta submandibular körtlar. Det är vår förhoppning att de markerade metoderna kommer att hjälpa experimentuppställning för utredarna bege sig in i området för spottkörtel radiotoxicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic Polyethylene tubing (PE10) | Becton Dickson | 427401 | |
| 1/2 cc Insulin Syringe U-100 | Becton Dickson | 309306 | |
| Artificial Tears | Miller Vet Supply | 5098-9840-64 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Perma-Hand silk suture | Ethicon | K833H | |
| Graefe forcep | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Olympus SZX16 Stereo Microscope | Hunt Optics and Imaging | ||
| 6 MV Linear Accelerator | Elekta | ||
| Bolus - Skinless | Civco | MTCB410 | |
| Heat Lamp | Braintree Scientific | HL-1 110V |
References
- Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3268-3273 (1997).
- Chambers, M. S., Rosenthal, D. I., Weber, R. S.
- Sciubba, J. J., Goldenberg, D.
- Rodrigues, N. A., et al. A prospective study of salivary gland function in lymphoma patients receiving head and neck irradiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75 (4), 1079-1083 (2009).
- Coracin, F. L., et al. Major salivary gland damage in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplantation assessed by scintigraphic methods. Bone Marrow Transplant. 37 (10), 955-959 (2006).
- Jensen, S. B., et al. A systematic review of salivary gland hypofunction and xerostomia induced by cancer therapies: management strategies and economic impact. Support Care Cancer. 18 (8), 1061-1079 (2010).
- de Castro, G. Jr, Federico, M. H. Evaluation, prevention and management of radiotherapy-induced xerostomia in head and neck cancer patients. Curr Opin Oncol. 18 (3), 266-270 (2006).
- Epperly, M. W., Carpenter, M., Agarwal, A., Mitra, P., Nie, S., Greenberger, J. S. Intraoral manganese superoxide dismutase-plasmid/liposome (MnSOD-PL) radioprotective gene therapy decreases ionizing irradiation-induced murine mucosal cell cycling and apoptosis. In Vivo. 18 (4), 401-410 (2004).
- Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Mol Ther. 15 (12), 2101-2106 (2007).
- Zheng, C., et al. Prevention of radiation-induced salivary hypofunction following hKGF gene delivery to murine submandibular glands. Clin Cancer Res. 17 (9), 2842-2851 (2011).
- Palaniyandi, S., et al. Adenoviral delivery of Tousled kinase for the protection salivary glands against ionizing radiation damage. Gene Ther. 18 (3), 275-282 (2011).
- Baum, B. J., Voutetakis, A., Wang, J. Salivary glands: novel target sites for gene therapeutics. Trends Mol Med. 10 (12), 585-590 (2004).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-like growth factor-1 preserves salivary gland function after fractionated radiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 78 (2), 579-586 (2010).
- Timiri Shanmugam, P. S., et al. Recombinant AAV9-TLK1B administration ameliorates fractionated radiation-induced xerostomia. Hum Gene Ther. 24 (6), 604-612 (2013).
- Coppes, R. P., Vissink, A., Konings, A. W. T. Comparison of radiosensitivity of rat parotid and submandibular glands after different radiation schedules. Radiother Oncol. 63 (3), 321-328 (2002).
- Sunavala-Dossabhoy, G., Palaniyandi, S., Richardson, C., De Benedetti, A., Schrott, L., Caldito, G. TAT-mediated delivery of Tousled protein to salivary glands protects against radiation-induced hypofunction. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 84 (1), 257-265 (2012).
- Baum, B. J., et al. Transfer of the AQP1 cDNA for the correction of radiation-induced salivary hypofunction. Biochim Biophys Acta. 1758 (8), 1071-1077 (2006).
- Tran, S. D., et al. Paracrine effects of bone marrow soup restore organ function, regeneration, and repair in salivary glands damaged by irradiation. PLoS One. 8 (4), e61632 (2013).
- Nanduri, L. S., et al. Salisphere derived c-Kit+ cell transplantation restores tissue homeostasis in irradiated salivary gland. Radiother Oncol. 108 (3), 458-463 (2013).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Mol Ther. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Voutetakis, A., et al. Reengineered salivary glands are stable endogenous bioreactors for systemic gene therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 3053-3058 (2004).
