Introduction
Collaterale vernietiging van gezond weefsel vertegenwoordigt een aantal schadelijke bijwerkingen van kankerbehandelingen. Een deel of geheel van de grote speekselklieren dat de stralingsvelden liggen onvermijdelijk vernietigd. Daarom zijn de meeste patiënten die radiotherapie voor hoofd- en nekkanker, baarmoederhalskanker lymfoom of volledige lichaamsbestraling voor beenmergtransplantatie lijden een van de meest voorkomende en persistente schadelijke effecten van straling, speekselklier hypofunction 2-6.
De fluïdum producerende acinaire cellen van de speekselklieren zijn uiterst gevoelig voor straling. Beschadiging van de speekselklieren veroorzaakt een drastische vermindering van de speekselproductie, een genoemd speeksel hypofunction voorwaarde. Chronische afname van speekselvloed schaadt belangrijke orale activiteiten zoals kauwen, slikken, spraak en smaak, maar de gevolgen van morbide intense pijn, mucosale tranen, dysfagie, opportunistische infecties en cariës verslechtert eenpatiënt welzijn en functie 2,3.
Aangezien radiotherapie geassocieerde speeksel celverlies onomkeerbaar is, er geen corrigerende behandeling van xerostomie. De huidige behandeling die zich richt op assuaging symptomen met kunstmatige speeksel substituten en prosecretory drugs is niet effectief voor de lange termijn verlichting 6. Hoewel verbeterde stralingsafgiftemiddelen technieken helpen verminderen de ernst van de aandoening, normaal weefsel toxiciteit en de complicaties ervan blijft een beperkende factor in kankerbehandeling 6,7. Pre-emptive maatregelen om radiotherapie bijbehorende complicaties te voorkomen zijn dan ook steeds de norm. Radio-beschermende middelen die vangen vrije radicalen oxygen species, bevorder cel herbevolking, of verbetering van DNA-reparatie worden onderzocht om speeksel hypofunction 8-11 af te wenden.
Afscheidingen van exocriene speekselklieren afwateren in de mond door de belangrijkste uitscheidingsmechanisme leidingen. Intra-orale infusen van The excretie leidingen voor injectie van contrastmiddelen wordt routinematig uitgevoerd als een poliklinische procedure. Met een soortgelijk benadering kan speekselklieren direct gericht voor het plaatselijk behandelen 12. Naast het risico van systemische bijwerkingen heeft retroductal klier indruppeling voordelen toegevoegd. De monolaag opstelling van speeksel cellen aan de ductale boom maakt targeting van speeksel epitheelcellen, en het vezelachtige inkapseling van de klier werkt als een barrière om ongewenste therapeutische spreiding reduceren. In wezen, speekselklieren zijn optimaal geschikt voor gerichte behandeling van schildklier aandoeningen, zoals door straling veroorzaakte speeksel hypofunction.
Conventionele bestraling bij de behandeling van kanker is in betrekkelijk geringe doses (1,8-2,5 Gy / fractie / dag, vijf dagen per week) gedurende weken. Daarom is een radio-beschermende therapeutische dat de werkzaamheid tegen een langdurige regeling straling blijkt in experimentele modellen heeft een grotere klinische lager. Compromaliseerde speekselklieren functie na gefractioneerde bestraling is opgenomen in kleine dieren, maar stralingsbron, fractie dosis en protocollen die gebruikt zijn gevarieerd 9,10,13.
Dit rapport stelt methoden voor retroductal levering aan en gelokaliseerde straling van rat onderkaakspeekselklier behulp van patiënt-relevante stralingsbron en fractie dosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de LSU Health, Shreveport, Animal Care en gebruik Comite en waren in overeenstemming met de NIH richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. Canulatie van Rat Submandibulaire speekselklieren
- Voorbereiding van de spuit-Tubing Assembly
- Snijd een 10 cm lengte van PE10 polyethyleen buis met een scalpel. Houd beide uiteinden van de buis tussen de wijsvinger en duim. Verwarm het middelste gedeelte van de buis boven een zachte vlam en voorzichtig rekken de zachte slang aan de lengte verdubbeld door aan beide zijden.
- Snijd de slang in het midden met een scalpel onder een hoek van 45 o 2 canules krijgen - elk met een taps toelopend uiteinde. Vouw de niet-taps toelopende einde van de canule door het aanbrengen van het over een 29 G naald van 0,5 cc insuline spuit.
- Verwijder de canule en trek 220 pi zoutoplossing in de injectiespuit. Tik om luchtbellen te verwijderen. Monteer de cannuleen over de naald en duw de zuiger om de lucht te verdrijven en te zorgen voor een vrije stroom van de oplossing door de canule. Zet het volume op 200 ul.
- Intra-orale Canulatie van Submandibulaire Gland Duct
LET OP: Autoclaaf instrumenten voorafgaand aan de procedure, en steriliseer in-tussen procedures in een hete kraal sterilisator.- Weeg de Sprague Dawley ratten, en verdeel het berekende volume van ketamine (42 mg / kg) / xylazine (8 mg / kg) / acepromazine (1,4 mg / kg) mengsel in een injectiespuit.
- Zet het dier vast door grijpen de basis van de staart tussen de wijsvinger en de duim van een hand en schuiven anderzijds over het lichaam te grijpen. Rest de wijs- en middelvinger langs de zijkanten van het hoofd, terwijl houden de romp met de duim en de resterende vingers.
- Injecteren het verdovingsmiddel in de achterste ledematen spieren. Bevestig de diepte van de anesthesie door teen knijpen en ooglidreflex. Solliciteer eye smeermiddel tot droog, terwijl voorkomendier onder narcose.
- Plaats het dier op een speciaal ontworpen platform (figuur 1), en over de bovenste snijtanden op de dwarsbalk. Trek de onderkaak door looping een rubberen band rond de onderste snijtanden en verankerd aan het platform.
- Passeren een steriele hechtdraad door de tong en til het aan de vloer van de mond te verhogen. Klem de hechtingen met een hemostat, en gaat het over de dwarsbalk.
- Vouw de wangen met een op maat gemaakte wang strooier (figuur 1), en onder een stereomicroscoop vind sublinguale papillen op de vloer van de mond.
- Pak de taps toelopende einde van de voorgevormde PE10 slang met behulp van een delicate pincet. Voorzichtig manipuleren van de punt van de canule in de ductale opening op de sublinguale papillen. Bevestig plaatsing van de canule door rijgen deze 3-5 mm in het kanaal; ervoor te zorgen dat het passeert zonder enige belemmering.
- Submandibulaire Gland Instillation
- Injecteren atropine (0,5 mg / kg) subcutaan in het nekvel en wacht 10 minuten voor een verlaging van speeksel afscheidingen.
- Bevestig de canule op het kanaal opening met een druppel cyanoacrylaat (lijm), en laten drogen. Wekt de oplossing in de gland (200 gl / klier) door langzaam indrukken van de zuiger met een snelheid van ~ 50 pl / min.
- Plet de buis met een hemostat, en verwijder voorzichtig de spuit. Bewaar de buis in het kanaal voor 30 - 60 minuten totdat het dier bijkomt. Verwijder de hechtdraad die de tong bezit.
- Breng het dier naar een aparte kooi, en het gebruik van een warmtelamp om het warm te houden tijdens het herstel. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten totdat het is weer bij bewustzijn te borstbeen recumbence handhaven.
- Nadat het dier is volledig ambulant, het huis van het op het terrarium met onbeperkte toegang tot voedsel en water.
2. Gelokaliseerde Gefractioneerde Bestralingvan onderkaakspeekselklier
- Zet het dier vast zoals eerder beschreven, en verdoven met intramusculaire toediening van ketamine (33 mg / kg) / xylazine (6 mg / kg) / acepromazine (1 mg / kg) mengen in de achterste ledematen. Bevestigen diepte van anesthesie en smeermiddel op de ogen.
- Plaats het dier in rugligging op de lineaire versneller tafelblad, en uit te breiden zijn nek door het kantelen van de kop. Richt het stralingsveld (3 cm spleetbreedte) omvatten voor het gebied van de onderrand van de mandibula naar de top van het borstbeen.
- Plaats een 1 cm weefsel equivalente bolus over het gebied en de afstand tussen de stralingsbron en de bovenkant van de bolus tot 100 cm passen.
- Bestralen het dier (2,5 Gy) met een 6 MV foton bundel een lineaire versneller. De dosering, veldgrootte, en de afstand van de stralingsbron naar de oppervlakte bolus zal de belichtingstijd te dicteren. In de set-up huidige, werden de dieren bestraald met een dosis van ~ 1 Gy / min.
- Herhaalde blootstelling; 2,5 Gy / dag voor een totaal van 8dagen; 4 dagen / week met een 2-dagen interval ertussen. Houd het dier warm tijdens het herstel. Breng het dier naar een vivarium nadat het volledig ambulant.
- Verzamel gestimuleerde submandibulaire klier speeksel 8 weken na straling om klierfunctie 14 te meten. Euthanaseren dieren onder verdoving door cardiale perfusie van koude 4% paraformaldehyde / fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,2. Roeien onderkaakspeekselklier voor histologische en immunohistochemische analyses 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aanpassen van een minimaal invasieve techniek sialografie, lokale behandeling van grote speekselklieren haalbaar. Retroductal toediening bij ratten submandibulaire speekselklier werd geprobeerd door intra-orale canulatie kanalen Wharton's (figuur 2). Het speeksel leidingen van Wharton open op de sublinguale papillen op de bodem van de mond, maar de openingen niet gemakkelijk toegankelijk. Het inbrengen van de canule werd dan ook gedaan door zachte sonderen. Om ongewenst bloeden of kanaal perforatie te vermijden, werd geen geweld gebruikt tijdens het plaatsen van de canule. Smooth-resistentie vrije doorgang van de canule in het kanaal werd bevestigd door voorzichtig heen en weer bewegen van de buis.
Infusen bij eerste experimenten werd bevestigd door het inbrengen van de klier met hematoxyline of trypan blauwe oplossing en evalueren klier kleuring in dieren gedood (figuur 3). Glen vul het volume werd vastgesteld door het visualiseren van kleuring van de ductale boom in uitgeroeid klieren. Voor dieren met een gewicht 150-250 g, werd volledige vulling van de klier bereikt met 200-250 ul oplossing. Rapid infusie kan klier druk te verhogen en verhogen de kans op letsel en biospread. Om weefselvernietiging voorkomen, werd de oplossing langzaam toegediend met een snelheid van ~ 50 pl / min
De rat onderkaakspeekselklier zijn vergelijkbaar met de speekselklieren in hun gevoeligheid voor straling 15. Onderkaakspeekselklier bestudeerd omdat zij selectief worden bestraald zonder dat ernstige off-target effecten (Figuur 4). Sparen van de mondholte en een groot volume van de speekselklieren tot een minimum beperkt de invloed van orale mucositis en acute xerostomie inzake diergezondheid en experimentele uitkomst. Onze eerdere studies bij ratten werden uitgevoerd met een enkele, grote doses straling 11,16, maar fractionated dosering is meer relevant zijn voor de klinische praktijk. De nek van het dier werd daarom dagelijks blootgesteld aan lage doses straling. Om een gelijkmatige opbouw van de stralingsdosis in de submandibulaire klieren vlakbij het huidoppervlak bereiken, een zacht weefsel equivalent bolus uit een homogene gel met een dichtheid van 1,03 g / cc werd over de hals tijdens bestraling.
Het effect van gefractioneerde schema straling op de speekselproductie, zoals bepaald na 8 weken na de straling tonen aan dat de dagelijkse blootstelling aan stappen van 2,5 Gy verminderde speekselproductie plotsklaps. Een bijna 10-voudige verlaging speeksel productie werd opgenomen in bestraalde dieren in tegenstelling tot niet-bestraalde dieren (t-proef 2-zijdige Student, p <0,01; figuur 5) 14. De resultaten bevestigden de oprichting van straling geïnduceerde speeksel hypofunction bij dieren.
Figuur 1. Bouw van een aangepaste Platform en Cheek-strooier. Een stijf 4 mm draad werd omgebogen in een 3-zijdige rechthoek (11 cm hoog x 13 cm breed), zoals aangegeven, en de dwarse bar werd gebogen in het midden. De uiteinden van de draad werden gebogen in loops, en schroeven werden door hen naar de vergadering te bevestigen aan een plastic bord (25 cm lang x 15 cm breedte x 0,8 cm diepte). Een centrale schroef werd geplaatst 5 cm posterior om de draad assemblage. Het diende de rubberen band die open de onderkaak Inzet getrokken verankeren. Een op maat gebouwde wang-verspreider van een wegwerpbare 1 mm dikke draad gebogen in een "U-vorm" met uitlopende uiteinden. Plastic buizen werden doorgegeven over de draadeinden om schade aan het mondslijmvlies te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
: Keep-together.within-page = "1"> 
Figuur 2. Canulatie van Rat Submandibulaire Gland afvoergangen. De tong wordt verhoogd tot de vloer van de mond te verheffen, en polyethyleen canules werden in de submandibulaire duct openingen gelegen op de verdieping van de mond is geplaatst. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
Figuur 3. Infusie van hematoxyline oplossing in de Submandibulaire Gland de techniek bevestigen. Gland kleuring getuigt van de succesvolle toediening van de oplossing in de submandibulaire klier. Merk op dat de sublinguale klier in de linkerbovenhoek niet wordt gekleurd. Een niet-geïnfuseerde control klier wordt links getoond.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Plaatsing van de Animal voor bestraling. Het dier wordt liggende gelegd op de lineaire versneller tafel, en het hoofd met de titel terug naar de nek uit te breiden. De gecollimeerde spleetbreedte was 3 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Effect van gefractioneerde straling op Submandibulaire klierfunctie. Saline werd ingeprent in de onderkaakspeekselklier voor straling. De hals van het dier werd bestraald in fracties van 2,5 Gy / dag gedurende 8 dagen. de DATa getoond zijn gemiddelden ± SEM van gestimuleerde submandibulaire speekselklieren debiet 8 weken na de voltooiing van de straling regeling. Het cijfer wordt weergegeven met auteursrechtelijke toestemming van Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc. uitgever 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Speekselklieren ontvangen vaak stralingsdoses boven de drempel van weefsel herstel bij patiënten die radiotherapie voor hoofd-halskanker, electieve ablatie van de nek knooppunten, of regionale hematologische maligniteiten. Hoewel de vloeistof afscheidende acinaire cellen van de klier gedifferentieerd zijn, zij paradoxaal stralingsgevoelige. De secretoire functie laat binnen de eerste weken van straling en onherstelbare schade klier leidt tot een chronische lage speeksel output. Ter bestrijding van slechte klierfunctie en droge mond die volgt, het behoud of herstel van de secretoire functie is van cruciaal belang. Nieuwe therapieën te beschermen tegen of te repareren stralingsschade worden onderzocht 1, 8-11, 16-20.
Systemische toediening van een therapeutische draagt het inherente risico van ongewenste effecten in niet-doelweefsel. Gericht levering aan de speekselklieren vermindert dit risico. Retroductal gentherapie is effectief bij het voorkomen ofverhelpen stralingsgeassocieerde speekselklier verdrukking 1, 9, 11, 16,17,20. Het gebruik van dezelfde techniek, speekselklieren kan ook reengineered uitdrukken en afscheiden eiwitten, ectopisch. Het benutten van de basolaterale endocriene secretieroute in speeksel cellen, kan transgenexpressie en hormoon in het bloed worden bereikt 21. Genoverdracht naar speekselklieren kan derhalve effectief worden uitgebreid tot de correctie van bepaalde endocriene aandoeningen.
Hoewel infusen van speekselklier leidingen in kleine dieren kan lastig zijn, de praktijk staat centraal in het slijpen van de techniek. De taps toelopende einde van de canules kan gemakkelijk knikken tijdens het inbrengen, en maak infuus moeilijk. Verhoogde tegendruk, terwijl verwijdering van de oplossing moet waarschuwen van een bocht in de buis, en de noodzaak om de canule opnieuw het kanaal. Anatomische varianten zoals afwijkende kanaal opening of verhoogde duct kronkeligheid, samen met de pathologieën die de mond te beperkenopening zoals trismus of submukeuze fibrosis kan submandibulaire klier levering een uitdaging te maken. Infusie van een impermeant kleurstof bij het beoefenen van de techniek kan een nuttige indicator precieze levering. Juiste plaatsing van de canules en zachte, resistentie-infusie zijn belangrijke factoren voor het welslagen van de procedure.
Kankerpatiënten worden vaak behandeld megavoltage fotonen gegenereerd door een lineaire versneller. Straling wordt dagelijks geleverd in kleine doses over een cursus van weken. Dosis fractionering biedt perioden van herstel tussen de stralingen van toxiciteit op gezonde weefsels te verminderen en te sensibiliseren tumoren. Zeer doordringende energiestralen van een lineaire versneller bruikbaar voor de behandeling van diepliggende tumoren. En voor de behandeling van tumoren dichter bij de huid, een weefselspecifieke equivalente bolus wordt gebruikt om de diepte van penetratie foton verminderen. Soortgelijke klinische praktijk, kan een lineaire versneller geleverd gefractioneerde bestraling worden gebruikt om plaatselijk bestralen Submandibular klieren van kleine dieren. De positie van de klieren direct onder de huid vereist de plaatsing van een bolus tot> 90% stralingsdosis in de klieren bereiken. De dikte van de bolus wordt berekend afhankelijk van de energie van fotonen en de gewenste diepte van penetratie.
In dit artikel geven we experimentele richtlijnen voor het uitvoeren van retroductal submandibulaire klier instillatie en lokale gefractioneerde bestraling van rat onderkaakspeekselklier. Het is onze hoop dat de gemarkeerde methoden experimentele opstelling zal de steun voor de onderzoekers venturing in het gebied van de speekselklier radiotoxiciteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic Polyethylene tubing (PE10) | Becton Dickson | 427401 | |
| 1/2 cc Insulin Syringe U-100 | Becton Dickson | 309306 | |
| Artificial Tears | Miller Vet Supply | 5098-9840-64 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Perma-Hand silk suture | Ethicon | K833H | |
| Graefe forcep | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Olympus SZX16 Stereo Microscope | Hunt Optics and Imaging | ||
| 6 MV Linear Accelerator | Elekta | ||
| Bolus - Skinless | Civco | MTCB410 | |
| Heat Lamp | Braintree Scientific | HL-1 110V |
References
- Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3268-3273 (1997).
- Chambers, M. S., Rosenthal, D. I., Weber, R. S.
- Sciubba, J. J., Goldenberg, D.
- Rodrigues, N. A., et al. A prospective study of salivary gland function in lymphoma patients receiving head and neck irradiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75 (4), 1079-1083 (2009).
- Coracin, F. L., et al. Major salivary gland damage in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplantation assessed by scintigraphic methods. Bone Marrow Transplant. 37 (10), 955-959 (2006).
- Jensen, S. B., et al. A systematic review of salivary gland hypofunction and xerostomia induced by cancer therapies: management strategies and economic impact. Support Care Cancer. 18 (8), 1061-1079 (2010).
- de Castro, G. Jr, Federico, M. H. Evaluation, prevention and management of radiotherapy-induced xerostomia in head and neck cancer patients. Curr Opin Oncol. 18 (3), 266-270 (2006).
- Epperly, M. W., Carpenter, M., Agarwal, A., Mitra, P., Nie, S., Greenberger, J. S. Intraoral manganese superoxide dismutase-plasmid/liposome (MnSOD-PL) radioprotective gene therapy decreases ionizing irradiation-induced murine mucosal cell cycling and apoptosis. In Vivo. 18 (4), 401-410 (2004).
- Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Mol Ther. 15 (12), 2101-2106 (2007).
- Zheng, C., et al. Prevention of radiation-induced salivary hypofunction following hKGF gene delivery to murine submandibular glands. Clin Cancer Res. 17 (9), 2842-2851 (2011).
- Palaniyandi, S., et al. Adenoviral delivery of Tousled kinase for the protection salivary glands against ionizing radiation damage. Gene Ther. 18 (3), 275-282 (2011).
- Baum, B. J., Voutetakis, A., Wang, J. Salivary glands: novel target sites for gene therapeutics. Trends Mol Med. 10 (12), 585-590 (2004).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-like growth factor-1 preserves salivary gland function after fractionated radiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 78 (2), 579-586 (2010).
- Timiri Shanmugam, P. S., et al. Recombinant AAV9-TLK1B administration ameliorates fractionated radiation-induced xerostomia. Hum Gene Ther. 24 (6), 604-612 (2013).
- Coppes, R. P., Vissink, A., Konings, A. W. T. Comparison of radiosensitivity of rat parotid and submandibular glands after different radiation schedules. Radiother Oncol. 63 (3), 321-328 (2002).
- Sunavala-Dossabhoy, G., Palaniyandi, S., Richardson, C., De Benedetti, A., Schrott, L., Caldito, G. TAT-mediated delivery of Tousled protein to salivary glands protects against radiation-induced hypofunction. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 84 (1), 257-265 (2012).
- Baum, B. J., et al. Transfer of the AQP1 cDNA for the correction of radiation-induced salivary hypofunction. Biochim Biophys Acta. 1758 (8), 1071-1077 (2006).
- Tran, S. D., et al. Paracrine effects of bone marrow soup restore organ function, regeneration, and repair in salivary glands damaged by irradiation. PLoS One. 8 (4), e61632 (2013).
- Nanduri, L. S., et al. Salisphere derived c-Kit+ cell transplantation restores tissue homeostasis in irradiated salivary gland. Radiother Oncol. 108 (3), 458-463 (2013).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Mol Ther. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Voutetakis, A., et al. Reengineered salivary glands are stable endogenous bioreactors for systemic gene therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 3053-3058 (2004).
