Introduction
destruction Collateral des tissus sains représente un certain nombre d'effets secondaires délétères des traitements du cancer. Tout ou partie des glandes salivaires principales qui se trouvent avec les champs de rayonnement sont inévitablement détruits. Par conséquent, la plupart des patients subissant une radiothérapie pour cancer tête et cou, lymphome cervical, ou la radiothérapie du corps entier avant la transplantation de moelle osseuse souffrent l' un des effets indésirables les plus fréquents et persistants de rayonnement, la glande salivaire hypofonction 2-6.
Les cellules des glandes salivaires acineuses fluide produisant sont extrêmement sensibles aux rayonnements. Les dommages aux glandes salivaires provoque une diminution drastique du flux salivaire, une condition appelée hypofonction comme salivaire. La réduction chronique du flux salivaire altère les activités orales clés tels que la mastication, la déglutition, la parole, et le goût, mais les séquelles morbide de la douleur intense, les larmes des muqueuses, de la dysphagie, les infections opportunistes, et les caries dentaires aggrave unele patient de bien-être et la fonction 2,3.
Etant donné que la perte de cellules salivaire de radiothérapie associée est irréversible, il n'y a pas de traitement de correction de la xérostomie. Le traitement actuel qui se concentre sur soulageant les symptômes avec des substituts salivaires artificiels et les médicaments prosecretory est inefficace pour le soulagement à long terme 6. Bien que l' amélioration des techniques de délivrance de rayonnement ont permis de diminuer la gravité de l'état, de la toxicité des tissus normaux et de ses complications restent un facteur limitant dans le traitement du cancer 6,7. mesures préventives pour prévenir les complications de radiothérapie associée sont, par conséquent, deviennent la norme. Agents de radio-protection qui piègent des espèces d'oxygène des radicaux libres, repopulation des cellules d' accueil, ou améliorent la réparation d' ADN sont explorées pour éviter hypofonction salivaire 8-11.
Sécrétions des glandes salivaires exocrines se déversent dans la bouche par les principaux canaux excréteurs. cathétérisme intra-orale de the conduits excréteurs pour l'injection d'agents de contraste se fait régulièrement comme une procédure ambulatoire. Utilisant une approche similaire, les glandes salivaires peuvent être directement ciblés pour le traitement localisé 12. En plus de réduire le risque d'effets secondaires systémiques, instillation glande retroductal a des avantages supplémentaires. L'arrangement monocouche de cellules salivaires autour de l'arbre canalaire permet le ciblage de toutes les cellules épithéliales salivaires, et l'encapsulation fibreuse des actes de la glande comme une barrière pour réduire la propagation thérapeutique non désirée. En substance, les glandes salivaires sont parfaitement adaptés pour le traitement ciblé des afflictions telles que la glande salivaire induite par le rayonnement hypofonction.
rayonnement conventionnel pour le traitement du cancer est livré dans de petites doses (1,8 à 2,5 Gy / fraction / jour, cinq jours par semaine) pour une période de plusieurs semaines. Par conséquent, une thérapeutique de radio-protection qui montre l'efficacité contre un système de rayonnement prolongé dans des modèles expérimentaux a une plus grande portée clinique. Comprofonction salivaire mised après la radiothérapie fractionnée a été enregistrée chez les petits animaux, mais source de rayonnement, la fraction de dose, et les protocoles utilisés sont variés 9,10,13.
Ce rapport établit des méthodes pour la livraison retroductal au rayonnement et localisée de rat glandes sous-maxillaires en utilisant la source de rayonnement patient concerné et la fraction de dose.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par Santé LSU, Shreveport, soin des animaux et l'utilisation Comité et étaient conformes aux directives du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Cannulation du Rat Submandibulaire glandes salivaires
- Préparation de Seringue-Tubing Assemblée
- Couper une longueur de 10 cm de PE10 tube en polyéthylène avec un scalpel. Maintenir les deux extrémités du tube entre l'index et le pouce. Chauffer la partie médiane du tube au-dessus d'une flamme douce et étirer doucement le tube ramolli de doubler sa longueur en tirant les deux côtés.
- Couper le tube dans le milieu avec un scalpel à un angle de 45 o pour obtenir 2 canules - chacune avec une extrémité effilée. Étendre l'extrémité non effilée de la canule en l'ajustant sur une aiguille de 29 G de 0,5 ml d'insuline seringue.
- Retirer la canule, et d'en tirer 220 pi de solution saline dans la seringue. Appuyez sur pour déloger les bulles d'air. Monter le cannula sur l'aiguille, et pousser le piston de la seringue pour expulser l'air et d'assurer la libre circulation de la solution à travers la canule. Réglez le volume à 200 pi.
- Cannulation intra-orale de Submandibulaire Gland Duct
NOTE: instruments autoclaves avant la procédure, et stériliser entre-deux procédures dans un stérilisateur à billes chaud.- Peser le rat Sprague-Dawley, et distribuer le volume calculé de kétamine (42 mg / kg) / xylazine (8 mg / kg) / acépromazine (1,4 mg / kg) de la composition dans une seringue hypodermique.
- Restreindre l'animal en saisissant la base de la queue entre l'index et le pouce d'une main et en faisant glisser l'autre main sur le corps de la saisir. Reposez l'index et le majeur le long des côtés de la tête tout en tenir le torse avec le pouce et les doigts restants.
- Injecter l'anesthésique dans le membre postérieur musculature. Confirmer la profondeur de l'anesthésie par pincement de l'orteil et le réflexe palpébral. Appliquer un lubrifiant oculaire pour prévenir la sécheresse tout enanimal est sous anesthésie.
- Placez l'animal sur une plate - forme spécialement conçue (Figure 1), et engager les incisives supérieures sur la barre transversale. Tirez la mâchoire inférieure vers le bas en faisant une boucle d'une bande de caoutchouc autour des incisives inférieures et d'ancrage à la plate-forme.
- Passez une suture stérile à travers la langue et le soulever pour élever le plancher de la bouche. Fixer les sutures avec un hémostatique, et le passer sur la barre transversale.
- Développez les joues avec une joue écarteur intégré personnalisé (Figure 1), et sous un microscope de dissection localiser les papilles sublinguale sur le plancher de la bouche.
- Saisir l'extrémité effilée du tube PE10 préformé à l'aide d'une pince délicate. manipuler délicatement la pointe de la canule dans l'orifice canalaire sur la papille sublinguale. Confirmer le placement de la canule en enfilant 3 - 5 mm dans le conduit; veiller à ce qu'elle passe sans aucune obstruction.
- Submandibulaire Gland Instillation
- Injecter de l'atropine (0,5 mg / kg) par voie sous- cutanée dans la peau du cou, et attendre 10 minutes pour une réduction des sécrétions salivaires.
- Fixer la canule à l'orifice du conduit avec une goutte de cyanoacrylate (colle), et laisser sécher. Instiller la solution dans le presse-étoupe (200 pl / glande) en pressant doucement sur le piston de la seringue à un débit de ~ 50 ul / min.
- Écraser le tube avec un hémostatique, et retirez soigneusement la seringue. Maintenir le tube dans le conduit pour 30 - 60 min jusqu'à ce que l'animal ne reprenne conscience. Retirez le fil de suture qui détient la langue.
- Transférer l'animal dans une cage séparée, et d'utiliser une lampe chauffante pour le garder au chaud pendant la récupération. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris conscience de maintenir décubitus sternale.
- Après que l'animal est entièrement ambulatoire, abriter au vivarium avec un accès illimité à la nourriture et de l'eau.
2. Localized Fractionnée Irradiationdes glandes sous-maxillaires
- Retenir l'animal, comme décrit précédemment, et anesthésier avec l'administration intramusculaire de kétamine (33 mg / kg) / xylazine (6 mg / kg) / acépromazine (1 mg / kg) de la composition dans la patte postérieure. Confirmer la profondeur de l'anesthésie, et appliquer du lubrifiant pour les yeux.
- Placez la supination animale sur l'accélérateur linéaire de table, et d'étendre son cou en inclinant la tête. Collimater le champ de rayonnement (3 cm de largeur de fente) pour englober la zone de la bordure inférieure de la mâchoire inférieure vers le haut du sternum.
- Placer un bolus équivalent tissu 1 cm sur la région, et d'ajuster la distance entre la source de rayonnement et le haut du bolus à 100 cm.
- Irradier l'animal (2,5 Gy) en utilisant un 6 MV faisceau de photons d'un accélérateur linéaire. Débit de dose, la taille du champ, et la distance de la source de rayonnement à bolus surface dictera le temps d'exposition. Dans le courant mis en place, les animaux ont été irradiés à un taux de ~ 1 Gy / min de dose.
- Répétez l'exposition; 2,5 Gy / jour pour un total de 8journées; 4 jours / semaine avec un intervalle de 2 jours entre les deux. Gardez l'animal au chaud pendant la récupération. Transférer l'animal au vivarium après qu'elle soit entièrement ambulatoire.
- Collecter stimulée glande sous - maxillaire salive 8 semaines après l' irradiation pour mesurer la fonction glande 14. Euthanasier animaux sous anesthésie par perfusion cardiaque froid paraformaldéhyde 4% / tampon phosphate salin pH 7,2. Extirpation glandes sous - maxillaires pour histologiques et immunohistochimique analyses 14.
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Representative Results
Adaptation d'une technique de sialographie mini-invasive, le traitement local des glandes salivaires principales est possible. Administration Retroductal chez le rat submandibulaire glandes salivaires a été tentée par cathétérisme intra-orale des conduits de Wharton (Figure 2). Les conduits salivaires de Wharton ouvertes sur la papille sublinguale situé sur le plancher de la bouche, mais les orifices ne sont pas facilement visibles. L'insertion de la canule a été, par conséquent, fait en sondant douce. Pour éviter un saignement fâcheux ou conduit perforation, aucune force a été utilisée tout en plaçant la canule. Passage en douceur sans résistance de la canule dans le conduit de retour a été confirmée par un mouvement doux et en arrière de la tubulure.
Canulation au cours des expériences initiales a été confirmée par la glande insufflant à l' hématoxyline ou d'une solution de bleu trypan et l' évaluation de coloration de la glande chez les animaux euthanasiés (figure 3). glet le volume de remplissage a été déterminée par la visualisation de la coloration de l'arbre canalaire des glandes extirpées. Pour les animaux pesant 150-250 g, le remplissage complet de la glande a été réalisée avec 200 - 250 pl de solution. perfusion rapide peut augmenter la pression de la glande et accroître le risque de blessure et de biospread. Afin d'éviter une destruction tissulaire, la solution a été administrée progressivement à une vitesse d'environ 50 ul / min
Les glandes sous - maxillaires de rat sont comparables aux glandes parotides dans leur sensibilité au rayonnement 15. Glandes sous - maxillaires ont été étudiés , car ils peuvent être irradiés sélectivement sans encourir de graves effets hors-cible (Figure 4). Épargner de la cavité buccale et un grand volume des glandes parotides minimisées l'influence de la mucite orale et xérostomie aiguë sur la santé animale et les résultats expérimentaux. Nos études antérieures chez le rat ont été réalisées avec un seul, de fortes doses de rayonnement 11,16, mais fracdosage rine est plus pertinente à la pratique clinique. La région du cou de l'animal a donc été exposée quotidiennement à de faibles doses de rayonnement. Pour parvenir à une accumulation uniforme de la dose de rayonnement dans les glandes sous-maxillaires situés près de la surface de la peau, un bol équivalent au tissu mou fabriqué à partir d'un gel homogène ayant une masse volumique de 1,03 g / cm a été placé au-dessus du cou pendant le rayonnement.
L'effet du schéma de rayonnement fractionné sur le flux salivaire, tel que déterminé à 8 semaines show post-rayonnement que l'exposition quotidienne à des incréments de 2,5 Gy réduit le flux salivaire précipitamment. Une réduction de près de 10 fois dans la production de salive a été enregistré chez les animaux irradiés par contraste avec les animaux non irradiés (test de Student unilatéral 2, p <0,01; figure 5) 14. Les résultats ont confirmé la mise en place de radio-induite salivaire hypofonction chez les animaux.
Figure 1. Construction d'une plate - forme sur mesure et Cheek-Spreader. Un fil rigide de 4 mm a été plié dans un rectangle 3 faces (11 cm largeur hauteur X 13 cm) , comme indiqué, et la barre transversale était courbée au centre. Les extrémités du fil ont été pliées en boucles, et les vis ont été passés à travers eux pour fixer l'ensemble sur une planche en plastique (25 cm de longueur x 15 cm de largeur x 0,8 cm de profondeur). Une vis centrale a été inséré 5 cm en arrière de l'assemblage de fils. Il a servi à ancrer la bande de caoutchouc qui ouvrit la mâchoire inférieure Encart:. A joue-écarteur sur mesure faite d'un jetable 1 mm plié fil épais dans une "forme de U" avec des extrémités évasées. Tubages en plastique ont été passés sur les extrémités du fil pour éviter d' endommager la muqueuse buccale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2. Cannulation du Rat sous - maxillaires Glande excréteurs Conduits. La langue est soulevée pour élever le plancher de la bouche, et le polyéthylène canules ont été insérés dans les orifices de conduits sous - maxillaires situés sur le plancher de la bouche. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande ce chiffre.
Figure 3. La perfusion de solution d' hématoxyline dans le Submandibulaire Gland pour confirmer la technique. Gland coloration témoigne de la bonne administration de la solution dans la glande sous - maxillaire. A noter que la glande sublinguale dans le coin supérieur gauche ne soit pas taché. Une glande de contrôle non-perfusé est indiquée sur la gauche.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Mise en place de l'animal pour Irradiation. L'animal est posé sur le dos sur la table d'accélérateur linéaire, et la tête intitulé retour à étendre le cou. La largeur de la fente collimaté était de 3 cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Effet de rayonnement fractionné sur Submandibulaire Gland Fonction. Saline a été instillé dans les glandes sous - maxillaires avant le rayonnement. Le col de l'animal a été irradié dans des fractions de 2,5 Gy / jour pendant 8 jours. La datune montre sont la moyenne ± SEM de taux stimulée submandibular salivaire d'écoulement 8 semaines après la fin du schéma de rayonnement. Le chiffre est reproduit avec la permission du droit d'auteur de Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc. éditeur 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les glandes salivaires reçoivent souvent des doses de rayonnement au-delà du seuil de récupération de tissus chez les patients subissant une radiothérapie pour le cancer de la tête du cou, l'ablation élective des ganglions lymphatiques du cou, ou hémopathies malignes régionales. Bien que les cellules acineuses de la glande de fluide sécrétrices sont définitivement différenciés, ils sont paradoxalement sensibles aux rayonnements. La fonction sécrétoire diminue au cours des premières semaines de la radiothérapie et de la glande irréversible dommage résulte en une production de salive chronique faible. Pour lutter contre la fonction des glandes pauvres et sécheresse buccale qui en découle, la conservation ou la restauration de la fonction sécrétoire est cruciale. De nouvelles thérapies pour protéger contre ou réparer les dommages de rayonnement sont à l'étude 1, 8-11, 16-20.
L'administration systémique d'un agent thérapeutique comporte un risque inhérent d'effets secondaires dans les tissus non ciblés. livraison Destiné aux glandes salivaires diminue ce risque. la thérapie génique Retroductal est efficace pour prévenir ouremédier à la radiation associée à la glande salivaire affliction 1, 9, 11, 16,17,20. Cependant, en utilisant la même technique, les glandes salivaires peuvent également être remanié pour exprimer et sécréter des protéines, de manière ectopique. Exploiter la voie endocrine sécrétoire basolatérale dans les cellules salivaires, l' expression du transgène et la sécrétion d' hormones dans le sang peuvent être atteints 21. Le transfert de gènes à des glandes salivaires peut donc être effectivement étendu à la correction de certains troubles endocriniens.
Bien que canulation des conduits des glandes salivaires chez les petits animaux peut être difficile, la pratique est au cœur de perfectionner la technique. L'extrémité effilée de la canule peut plier facilement lors de l'insertion, et de faire perfusion difficile. Augmentation de contre-pression tout en expulsant la solution doit avertir d'un coude dans le tube, et la nécessité de re-Cathétériser le conduit. Les variations anatomiques telles que l'orifice du conduit aberrant ou une augmentation de la tortuosité du conduit, ainsi que des pathologies qui limitent la boucheouverture comme trismus ou fibrose sous-muqueuse peut effectuer la livraison de la glande sous-maxillaire un défi. Infusion d'un colorant impermeant lors de la pratique de la technique peut être un indicateur utile de la livraison précise. Le positionnement correct des canules et infusion douce, sans résistance sont des facteurs importants pour le succès de la procédure.
Les patients cancéreux sont souvent traités avec des photons mégavoltage générés par un accélérateur linéaire. Le rayonnement est livré tous les jours à petites doses sur un parcours de semaines. fractionnement de la dose fournit des périodes de récupération entre les radiations afin de réduire la toxicité sur les tissus sains et sensibiliser les tumeurs. Fortement pénétrants faisceaux d'énergie d'un accélérateur linéaire sont utiles pour le traitement des tumeurs profondes. Et, pour le traitement des tumeurs plus proches de la peau, un bol équivalent au tissu est utilisé pour réduire la profondeur de pénétration des photons. Similaire à la pratique clinique, un rayonnement fractionnés accélérateur linéaire délivré peut être utilisé pour irradier localement submaglandes ndibular de petits animaux. Cependant, la position des glandes immédiatement sous la peau nécessite la mise en place d'un bol pour atteindre> dose de rayonnement de 90% dans les glandes. L'épaisseur du bol est calculée en fonction de l'énergie des photons et de la profondeur de pénétration souhaitée du tissu.
Dans cet article, nous fournissons des directives expérimentales pour effectuer retroductal instillation de glande sous-maxillaire et l'irradiation fractionnée locale des glandes sous-maxillaires de rat. Nous espérons que les méthodes mises en évidence aideront dispositif expérimental pour les enquêteurs aventurant dans le domaine de la glande salivaire radiotoxicité.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic Polyethylene tubing (PE10) | Becton Dickson | 427401 | |
| 1/2 cc Insulin Syringe U-100 | Becton Dickson | 309306 | |
| Artificial Tears | Miller Vet Supply | 5098-9840-64 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Perma-Hand silk suture | Ethicon | K833H | |
| Graefe forcep | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Olympus SZX16 Stereo Microscope | Hunt Optics and Imaging | ||
| 6 MV Linear Accelerator | Elekta | ||
| Bolus - Skinless | Civco | MTCB410 | |
| Heat Lamp | Braintree Scientific | HL-1 110V |
References
- Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3268-3273 (1997).
- Chambers, M. S., Rosenthal, D. I., Weber, R. S.
- Sciubba, J. J., Goldenberg, D.
- Rodrigues, N. A., et al. A prospective study of salivary gland function in lymphoma patients receiving head and neck irradiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75 (4), 1079-1083 (2009).
- Coracin, F. L., et al. Major salivary gland damage in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplantation assessed by scintigraphic methods. Bone Marrow Transplant. 37 (10), 955-959 (2006).
- Jensen, S. B., et al. A systematic review of salivary gland hypofunction and xerostomia induced by cancer therapies: management strategies and economic impact. Support Care Cancer. 18 (8), 1061-1079 (2010).
- de Castro, G. Jr, Federico, M. H. Evaluation, prevention and management of radiotherapy-induced xerostomia in head and neck cancer patients. Curr Opin Oncol. 18 (3), 266-270 (2006).
- Epperly, M. W., Carpenter, M., Agarwal, A., Mitra, P., Nie, S., Greenberger, J. S. Intraoral manganese superoxide dismutase-plasmid/liposome (MnSOD-PL) radioprotective gene therapy decreases ionizing irradiation-induced murine mucosal cell cycling and apoptosis. In Vivo. 18 (4), 401-410 (2004).
- Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Mol Ther. 15 (12), 2101-2106 (2007).
- Zheng, C., et al. Prevention of radiation-induced salivary hypofunction following hKGF gene delivery to murine submandibular glands. Clin Cancer Res. 17 (9), 2842-2851 (2011).
- Palaniyandi, S., et al. Adenoviral delivery of Tousled kinase for the protection salivary glands against ionizing radiation damage. Gene Ther. 18 (3), 275-282 (2011).
- Baum, B. J., Voutetakis, A., Wang, J. Salivary glands: novel target sites for gene therapeutics. Trends Mol Med. 10 (12), 585-590 (2004).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-like growth factor-1 preserves salivary gland function after fractionated radiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 78 (2), 579-586 (2010).
- Timiri Shanmugam, P. S., et al. Recombinant AAV9-TLK1B administration ameliorates fractionated radiation-induced xerostomia. Hum Gene Ther. 24 (6), 604-612 (2013).
- Coppes, R. P., Vissink, A., Konings, A. W. T. Comparison of radiosensitivity of rat parotid and submandibular glands after different radiation schedules. Radiother Oncol. 63 (3), 321-328 (2002).
- Sunavala-Dossabhoy, G., Palaniyandi, S., Richardson, C., De Benedetti, A., Schrott, L., Caldito, G. TAT-mediated delivery of Tousled protein to salivary glands protects against radiation-induced hypofunction. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 84 (1), 257-265 (2012).
- Baum, B. J., et al. Transfer of the AQP1 cDNA for the correction of radiation-induced salivary hypofunction. Biochim Biophys Acta. 1758 (8), 1071-1077 (2006).
- Tran, S. D., et al. Paracrine effects of bone marrow soup restore organ function, regeneration, and repair in salivary glands damaged by irradiation. PLoS One. 8 (4), e61632 (2013).
- Nanduri, L. S., et al. Salisphere derived c-Kit+ cell transplantation restores tissue homeostasis in irradiated salivary gland. Radiother Oncol. 108 (3), 458-463 (2013).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Mol Ther. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Voutetakis, A., et al. Reengineered salivary glands are stable endogenous bioreactors for systemic gene therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 3053-3058 (2004).
