Retroductal Submandibular Gland Instillasjon og Lokalisert Fraksjonert Bestråling i en rottemodell av spytt hypofunksjon

Introduction

Sivile ødeleggelse av friskt vev står for en rekke skadelige bivirkninger av kreftbehandling. En del av eller hele det store spyttkjertler som ligger med stråling felt er uunngåelig ødelagt. Derfor er de fleste pasienter som gjennomgår strålebehandling for hode og nakke kreft, livmorhals lymfom, eller hele kroppen stråling før benmargstransplantasjon lider en av de vanligste og vedvarende negative effekter av stråling, spyttkjertel hypofunction ^2-6.

Fluidproduserende akinærceller av spyttkjertler er akutt følsomme for stråling. Skade på spyttkjertlene fører til en drastisk minsk av spyttstrøm, en tilstand som omtales som spytt hypofunksjon. Den kroniske reduksjon i spytt flyt svekker viktige muntlige aktiviteter som tygging, svelging, tale og smak, men sykelig følgetilstander av intens smerte, slimhinne tårer, dysfagi, opportunistiske infeksjoner og tannråte forverrer enpasientens trivsel og funksjon ^2,3.

Siden radioterapi-assosiert spytt celletap er irreversibel, er det ingen korrigerende behandling av xerostomi. Dagens behandling som fokuserer på assuaging symptomer med kunstige spytterstatninger og prosecretory narkotika er ineffektiv for langsiktig lettelse ^6. Selv om forbedrede stråling leverings teknikker har bidratt til å redusere alvorlighetsgraden av tilstanden, normalt vev toksisitet og dens komplikasjoner forbli en begrensende faktor i kreftbehandling ^6,7. Forkjøpsrett tiltak for å hindre strålebehandling assosierte komplikasjoner er derfor blitt normen. Radio-beskyttende midler som bekjemper frie radikaler oksygenforbindelser, fosterhjem celle repopulation, eller forbedre DNA reparasjon blir undersøkt for å avverge spytt hypofunction ^8-11.

Sekret av eksokrine spyttkjertler renne inn i munnen gjennom de viktigste excretory kanaler. Intra-oral kanylering av the excretory kanaler for injeksjon av kontrastmidler gjøres rutinemessig som et poliklinisk prosedyre. Ved å benytte en lignende tilnærming, kan spyttkjertlene være direkte målrettet for lokalisert behandling ^12. Bortsett fra å redusere faren for systemiske bivirkninger, har retroductal kjertel drypping tilsatt fordeler. Den monolayer arrangement av spytt cellene rundt ductal treet tillater målretting av alle spytt epitelceller, og fiber innkapsling av kjertelen fungerer som en barriere for å redusere uønsket terapeutisk spredning. I hovedsak spyttkjertler er optimalt egnet for målrettet behandling av kjertel lidelser som stråleindusert spytt hypofunction.

Konvensjonell stråling for kreftbehandling leveres i små doser (1,8 til 2,5 Gy / fraksjon / dag, fem dager i uken) for en periode på flere uker. Derfor er en radio-beskyttende terapeutisk som viser effekt mot en langvarig stråling ordningen i eksperimentelle modeller har større klinisk peiling. Compromised spytt funksjon etter fraksjonert stråling har vært registrert i små dyr, men strålingskilde, dosefraksjonen, og protokollene som brukes er varierte ^9,10,13.

Denne rapporten etablerer metoder for retroductal levering til og lokaliserte stråling av rotte submandibular kjertler ved hjelp av pasient-relevant strålekilde og dosefraksjonen.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av LSU Health, Shreveport, Animal Care og bruk komité og var i samsvar med NIH retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr.

1. kanylering av Rat Submandibular spyttkjertler

1. Utarbeidelse av sprøyte-Tubing Assembly
   1. Skjær en 10 cm lengde PE10 polyetylen rør med en skalpell. Hold i begge ender av slangen mellom pekefingeren og tommelen. Oppvarme den midtre delen av produksjonsrøret ovenfor en svak flamme, og forsiktig strekke den myke slangen for å fordoble sin lengde ved å trekke begge sider.
   2. Skjær røret i midten med en skalpell i en vinkel på 45 ^{o for} å få to kanyler - hver med en spiss ende. Utvide den ikke-koniske enden av kanylen ved å montere den i løpet av en 29 G nål på 0,5 cc Insulin sprøyte.
   3. Fjerne kanylen, og tegne 220 ul saltoppløsning i sprøyten. Trykk for å løsne luftbobler. Monter en kanyleen over nålen, og skyv sprøytestempelet for å drive ut luft og sikre fri flyt av løsning gjennom kanylen. Juster volumet til 200 mL.
2. Intra-oral kanylering av Submandibular Gland Duct
   MERK: Autoklaver instrumenter før prosedyren, og sterilisere i mellom prosedyrer i en varm perle sterilisator.
   1. Veie Sprague Dawley rotter, og dispensere det beregnede volumet av ketamin (42 mg / kg) / xylazin (8 mg / kg) / acepromazin (1,4 mg / kg) blanding i en hypodermisk sprøyte.
   2. Begrense dyret ved å gripe haleroten mellom pekefingeren og tommelen på en hånd og skyve den annen side over hele legemet for å gripe den. Hvil peke- og langfingeren langs sidene av hodet mens holde overkroppen med tommelen og andre fingre.
   3. Injisere bedøvelse i hind lem muskulatur. Bekreft anestesidybden ved tå klype og palpebral refleks. Påfør øye smøremiddel for å unngå tørrhet mensdyret er under narkose.
   4. Plasser dyret på en spesialdesignet plattform (figur 1), og engasjere de øvre fortennene på tverrstangen. Trekk den nedre kjeve ned ved å feste en gummibånd rundt de nedre fortennene og forankre det til plattformen.
   5. Passere en steril sutur gjennom tungen og løft det opp for å heve gulvet i munnen. Klem sting med pinsetten, og passerer det over tverrstangen.
   6. Utvid kinnene med en spesialbygd kinn spreder (figur 1), og under et dissekere mikroskop finne sublingual papiller på gulvet av munnen.
   7. Ta tak i konisk slutten av prefabrikkerte PE10 rør ved hjelp av en delikat tang. Forsiktig manipulere tuppen av kanylen inn i ductal åpningen på sublingual papiller. Bekreft plassering av kanylen ved å tre det 3-5 mm inn i kanalen; sørge for at det går uten noen hindring.
3. Submandibular Gland Instillation
   1. Injisere atropin (0,5 mg / kg) subkutant i nakkeskinnet, og vente 10 min for en reduksjon i spytt.
   2. Fest kanylen til kanalen åpningen med en dråpe Cyanoakrylat (lim), og la tørke. Innpode oppløsning i pakkboksen (200 ul / kjertel) ved langsomt å trykke på sprøytestemplet med en hastighet på ~ 50 mL / min.
   3. Knus slangen med en pinsetten, og fjern sprøyten nøye. Beholde slangen i kanalen i 30 - 60 min før dyret gjenvinner bevisstheten. Fjern den sutur som holder tungen.
   4. Overfør dyret til et eget bur, og bruke en varmelampe for å holde den varm under utvinning. Ikke la dyret uten tilsyn før den har kommet til bevissthet for å opprettholde sternal recumbence.
   5. Etter at dyret er fullt oppegående, huse den på vivarium med ubegrenset tilgang til mat og vann.

2. Lokalisert Fraksjonert Bestrålingav submandibular kjertler

1. Beherske dyret som beskrevet før, og bedøve med intramuskulær administrering av ketamin (33 mg / kg) / xylazin (6 mg / kg) / acepromazin (1 mg / kg) blanding i bakben. Bekreft anestesidybden, og smøres med glidemiddel øynene.
2. Plasser dyret liggende på lineær akselerator tabletop, og utvide sin hals ved å vippe hodet. Kollimere strålefelt (3 cm spaltebredde) til å omfatte i området fra den nedre kant av kjeven til toppen av brystbenet.
3. Plasser en 1 cm vev-ekvivalent bolus over regionen, og justere avstanden mellom strålingskilden og toppen av bolus til 100 cm.
4. Bestråle dyr (2,5 Gy) ved hjelp av en 6 MV fotonstråle fra en lineær akselerator. Dose rate, feltstørrelse, og avstanden fra strålekilde å bolus overflaten vil diktere eksponeringstiden. I dagens satt opp, ble dyrene bestrålt ved en dose på ~ 1 Gy / min.
5. Gjenta eksponering; 2,5 Gy / dag for totalt 8dager; 4 dager / uke med en 2-dagers intervall i mellom. Holde dyret varmt under utvinning. Overfør dyret til vivarium etter at det er fullt ut ambulerende.
6. Samle stimulert submandibularis spytt 8 uker etter stråling for å måle kjertel funksjon ^14. Avlive dyr under bedøvelse ved hjertepunktur perfusjon av kald 4% paraformaldehyd / fosfatbuffret saltvann pH 7,2. Utrydde submandibular kjertler for histologisk og immunhistokjemisk analyse ^14.

Representative Results

Tilpasning en minimal invasiv sialografi teknikk, er lokal behandling av store spyttkjertler gjennomførbart. Retroductal administrasjon i rotte submandibular spyttkjertlene ble forsøkt av intra-oral kanylering av Wharton kanaler (figur 2). Spytt kanaler av Wharton åpne på sub-lingual papiller som ligger på gulvet i munnen, men åpningene ikke er lett synlig. Innsetting av kanylen ble derfor gjort ved forsiktig sondering. For å unngå uheldige blødning eller duct perforasjon, ble ingen kraft som brukes mens plassere kanylen. Jevn motstand-fri passasje av kanylen i kanalen ble bekreftet ved forsiktig frem og tilbake bevegelse av røret.

Kanylering i løpet av innledende forsøk ble bekreftet ved infusjonen kjertelen med hematoksylin eller trypan blå løsning, og evaluere kjertel farging i avlives dyrene (figur 3). Glog fylle volumet ble konstatert ved å visualisere farging av ductal treet i utryddet kjertler. For dyr som veier 150 - 250 g, ble fullstendig fylling av kjertelen oppnådd med 200 - 250 ul oppløsning. Rask infusjon kan øke kjertel trykket og øke risikoen for skader og biospread. For å unngå vevdestruksjon, oppløsningen ble administrert gradvis med en hastighet på ~ 50 mL / min

Rotte submandibular kjertler er sammenlignbare med ørespyttkjertler i deres følsomhet for stråling ^15. Submandibular kjertler ble undersøkt fordi de kan være selektivt bestråles uten å pådra seg alvorlige off-target effekter (figur 4). Sparing av munnhulen, og et stort volum av parotid kjertler minimerte påvirkning av oral mukositt og akutt xerostomia på dyrehelse og eksperimentelle resultat. Våre tidligere studier på rotter ble utført med enkle, store doser av stråling ^11,16, men fractionated dosering er mer relevant for klinisk praksis. Halsområdet av dyret ble derfor utsatt daglig for små doser av stråling. For å oppnå en jevn oppbygging av stråledose i løpet av de submandibulære kjertler som ligger nær hudens overflate, ble en bløtvev-ekvivalent bolus fremstilt av en homogen gel med en tetthet på 1,03 g / cc er lagt over halsen i løpet av stråling.

Effekten av fraksjonert stråling ordningen på spytt flyt som bestemmes ved 8 uker etter stråling viser at daglig eksponering for trinn på 2,5 Gy redusert spytt flyt bratt. En nær 10 ganger reduksjon i spytt produksjonen ble spilt inn i bestrålte dyr i motsetning til ikke-bestrålt dyr (2-sidig Students t- test, p <0,01, figur 5) ^14. Resultatene bekreftet etablering av strålingsinduserte spytt hypofunksjon i dyr.

Figur 1. Bygging av en tilpasset plattform og Cheek-spredning. En stiv 4 mm ledningen ble bøyd i en 3-sidig rektangel (11 cm høyde x 13 cm bredde) som vist, og tverrstangen var bøyd i midten. Endene av tråden ble bøyd til løkker, og skruene ble ført gjennom dem for å feste til et plastbrett (25 cm lengde x 15 cm bredde x 0,8 cm dybde). En sentral skrue ble satt 5 cm posteriort for trådsammenstillingen. Det serveres å feste strikken som trakk åpen underkjeven. Innfelt: En spesialbygd kinnet spreder laget av et engangs 1 mm tykk tråd bøyd i en "U-form" med utspilte ender. Plastslanger ble passert over kabelendene for å hindre skader på munnslimhinnen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

: Hold-together.within-page = "1">
Figur 2. kanylering av Rotte submandibularis Utløps Kanaler. Tungen er hevet for å heve gulvet i munnen, og polyetylen kanyler ble satt inn i submandibular kanal åpninger plassert på gulvet i munnen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Infusjon av Hematoxylin løsning i Submandibular Gland å bekrefte Technique. Gland farging vitner til en vellykket forvaltning av løsningen i submandibular kjertel. Merk at sublingual kjertel i øvre venstre hjørne ikke er farget. En ikke-tilført kontroll kjertel er vist til venstre.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Plasseringen av dyr for bestråling. Dyret blir lagt liggende på lineær akselerator bordet, og et innlegg med tittelen tilbake for å forlenge halsen. Den kollimert spaltebredden var 3 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Effekt av Fraksjonert Stråling på Submandibular Gland Funksjon. Saline ble innpodet i submandibular kjertler før stråling. Halsen på dyret ble bestrålt i fraksjoner på 2,5 Gy / dag i 8 dager. den datet vist er gjennomsnitt ± SEM av stimulert submandibulære spyttstrømnings-hastighet 8 uker etter avslutningen av stråling ordningen. Figuren er gjengitt med copyright tillatelse fra menneske Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc. utgiver ^15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Spyttkjertlene ofte får stråledoser utenfor terskelen av vev bedring hos pasienter som gjennomgår strålebehandling for hode-hals-kreft, elektiv ablasjon av nakken noder, eller regionale hematologisk kreftsykdom. Selv om fluid-utskillende akinærceller av kjertelen er terminalt differensiert, er de paradoksalt nok følsomme for stråling. Den sekretoriske funksjon synker i løpet av de første ukene av stråling, og irreversible kjertel skade resulterer i en kronisk lav spytt utgang. For å bekjempe dårlig kjertel funksjon og munntørrhet som følger, er bevaring eller restaurering av sekretoriske funksjon avgjørende. Nye behandlingsformer for å beskytte mot eller reparere stråleskader blir etterforsket ^{en, 8-11, 16-20.}

Systemisk administrasjon av en terapeutisk bærer iboende risiko for uønskede effekter på ikke-målrettede vev. Rettet levering til spyttkjertlene avtar denne risikoen. Retroductal genterapi er effektivt for å forhindre ellerbøte stråling-assosiert spyttkjertel lidelse ^{1, 9-, 11, 16,17,20.} Men ved å bruke den samme teknikken, spyttkjertlene kan også omarbeidet for å uttrykke og utskille proteiner, ectopically. Utnytte basolateral endokrine sekretoriske vei i spytt celler, kan transgene uttrykk og hormon i blodet oppnås ^21. Genoverføring til spyttkjertlene kan, derfor, bli effektivt utvidet til korrigering av visse endokrine lidelser.

Selv kanylering av spyttkjertelkanaler i små dyr kan være vanskelig, er praksis sentralt for å finslipe teknikken. Den koniske enden av kanyler kan knekkes lett under innsetting, og gjøre infusjon vanskelig. Økt baktrykket mens utviste løsningen bør advare av et bend i røret, og at det er nødvendig å re-cannulate kanalen. Anatomiske varianter som avvikende kanalåpning eller økt duct tortuosity, sammen med patologi som begrenser munnåpning som trismus eller submucous fibrose kan gjøre submandibularis levering en utfordring. Infusjon av en impermeant fargestoff ved utøvelse av teknikken kan være en nyttig indikator på nøyaktig levering. Riktig plassering av kanyler og milde, motstand fritt infusjon er viktige faktorer for å lykkes med prosedyren.

Kreftpasienter blir ofte behandlet med høyspenningsutstyr fotoner som genereres av en lineær akselerator. Stråling leveres daglig i små doser over en periode på uker. Dose fraksjone gir perioder med restitusjon mellom stråling for å redusere toksisitet på friskt vev og bevisst svulster. Sterkt gjennomtrengende energistråler av en lineær akselerator er anvendelige for behandling av dyptliggende tumorer. Og, for behandling av tumorer nærmere til huden, er et tissue-ekvivalent bolus anvendes for å redusere dybden av foton penetrasjon. I likhet med klinisk praksis, kan en lineær akselerator levert fraksjonert stråling brukes til lokalt bestråle submandibular kjertler av små dyr. Imidlertid er posisjonen til kjertler umiddelbart under huden nødvendiggjør plassering av en bolus for å oppnå> 90% strålingsdosen innenfor kjertlene. Tykkelsen av bolus beregnes avhengig av energien til fotonene og den ønskede dybde av vev penetrasjon.

I denne artikkelen gir vi eksperimentelle retningslinjer for utførelse retroductal submandibularis drypping og lokal fraksjonert bestråling av rotte submandibular kjertler. Det er vårt håp at de uthevede metoder vil hjelpe eksperimentelt oppsett for etterforskere venturing inn i feltet av spyttkjertel radiotoksisitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intramedic Polyethylene tubing (PE10)	Becton Dickson	427401
1/2 cc Insulin Syringe U-100	Becton Dickson	309306
Artificial Tears	Miller Vet Supply	5098-9840-64
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Perma-Hand silk suture	Ethicon	K833H
Graefe forcep	Fine Science Tools	11051-10
Olympus SZX16 Stereo Microscope	Hunt Optics and Imaging
6 MV Linear Accelerator	Elekta
Bolus - Skinless	Civco	MTCB410
Heat Lamp	Braintree Scientific	HL-1 110V