Introduction
destrucción colateral de los tejidos sanos representa un número de deletéreos efectos secundarios de los tratamientos contra el cáncer. Una parte o la totalidad de las glándulas salivales mayores que se encuentran en los campos de radiación se destruyen inevitablemente. Por lo tanto, la mayoría de los pacientes sometidos a radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello, linfoma de cuello de útero, o la radiación de todo el cuerpo antes del trasplante de médula ósea sufren uno de los efectos adversos más comunes y persistentes de la radiación, la hipofunción de las glándulas salivales 2-6.
Las células acinares de fluido productoras de las glándulas salivales son extremadamente sensibles a la radiación. El daño a las glándulas salivales causa una disminución drástica del flujo salival, una condición que se refiere como hipofunción salival. La reducción crónica del flujo salival perjudica las actividades orales clave como la masticación, deglución, el habla y el gusto, pero las secuelas morboso de un intenso dolor, las lágrimas de las mucosas, disfagia, infecciones oportunistas, y la caries dental empeora unapaciente de bienestar y 2,3 función.
Dado que la pérdida de células salival radioterapia asociada es irreversible, no existe un tratamiento correctivo de la xerostomía. El tratamiento actual que se centra en aliviando los síntomas con sustitutos salivales artificiales y drogas prosecretory es ineficaz para el alivio a largo plazo 6. Aunque las técnicas de administración de la radiación mejorados han ayudado a disminuir la gravedad de la enfermedad, la toxicidad tejido normal y sus complicaciones siguen siendo un factor limitante en el tratamiento del cáncer 6,7. medidas preventivas para evitar las complicaciones asociadas a la radioterapia son, por lo tanto, convirtiendo en la norma. Agentes de radio-protección que limpian las especies de oxígeno de radicales libres, repoblación de células de guarda, o mejoran la reparación del ADN están siendo exploradas para evitar la hipofunción salival 8-11.
Las secreciones de las glándulas salivales exocrinas drenan en la boca a través de los principales conductos excretores. canulación intra-oral de THe conductos excretores para la inyección de medios de contraste se realiza de forma rutinaria como un procedimiento ambulatorio. Utilizando un enfoque similar, las glándulas salivales pueden ser dirigidos directamente para el tratamiento localizado 12. Además de reducir el riesgo de efectos secundarios sistémicos, la instilación glándula retroductal tiene beneficios adicionales. La disposición de monocapa de células salivales alrededor del árbol ductal permite la orientación de todas las células epiteliales salivales, y la encapsulación fibrosa de los actos de la glándula como una barrera para reducir la propagación terapéutico deseado. En esencia, las glándulas salivales son óptimamente adecuadas para el tratamiento dirigido de las aflicciones de la glándula como hipofunción salivales inducida por radiación.
radiación convencional para el tratamiento del cáncer se entrega en dosis pequeñas (1.8 a 2.5 Gy / fracción / día, cinco días a la semana) durante un período de semanas. Por lo tanto, un producto terapéutico de radio-protección que muestra eficacia contra un esquema de radiación prolongada en modelos experimentales tiene mayor porte clínica. Comprofunción salival mised después de la radiación fraccionada ha sido registrado en los animales pequeños, pero fuente de radiación, la fracción de la dosis y los protocolos utilizados son variados 9,10,13.
Este informe establece procedimientos para la administración de retroductal y radiación localizada de rata utilizando glándulas submandibulares fuente de radiación en el paciente relevante y la fracción de la dosis.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por la Salud LSU, Shreveport, Cuidado de Animales y el empleo y estaban de acuerdo con las directrices del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. La canulación de rata submandibular glándulas salivales
- Preparación de la jeringuilla de la tubería de Asamblea
- Cortar una longitud de 10 cm de tubo de polietileno PE10 con un bisturí. Sostenga los dos extremos de la tubería entre el dedo índice y el pulgar. Calentar la sección media de la tubería por encima de una llama suave, y estirar suavemente el tubo ablandado para duplicar su longitud tirando de ambos lados.
- Corte el tubo en el medio con un bisturí en un ángulo de 45 ° para obtener 2 cánulas - cada uno con un extremo cónico. Expandir el extremo no afilado de la cánula por su montaje sobre una aguja 29 G de 0,5 cc jeringuilla de la insulina.
- Retire la cánula, y dibujar 220 l de solución salina en la jeringa. Toque para desalojar las burbujas de aire. Montar el cannula sobre la aguja, y empuje el émbolo de la jeringa para expulsar el aire y asegurar la libre circulación de la solución a través de la cánula. Ajuste el volumen a 200 l.
- La canulación intra-oral de la glándula submandibular de conductos
NOTA: instrumentos de autoclave antes del procedimiento, y esterilizar en-entre los procedimientos en un esterilizador de cuentas caliente.- Pesar la rata Sprague Dawley, y dispensar el volumen calculado de ketamina (42 mg / kg) / xilazina (8 mg / kg) / acepromazina (1,4 mg / kg) de la mezcla en una jeringa hipodérmica.
- Sujeción del animal sujetando la base de la cola entre el dedo índice y el pulgar de una mano y deslizando la otra mano sobre el cuerpo de captarlo. Descansar el dedo índice y medio a lo largo de los lados de la cabeza mientras se mantenga el torso con el pulgar y los dedos restantes.
- Se inyecta la anestesia en la musculatura de las extremidades posteriores. Confirmar la profundidad de la anestesia mediante pizca dedo del pie y reflejo palpebral. Aplicar lubricante ocular para evitar la sequedad mientrasanimal es bajo anestesia.
- Colocar el animal en una plataforma especialmente diseñada (Figura 1), e involucrar a los dientes incisivos superiores en la barra transversal. Tirar de la mandíbula inferior hacia abajo haciendo un bucle en una banda de goma alrededor de los incisivos inferiores y anclaje a la plataforma.
- Pasar una sutura estéril a través de la lengua y la levante hacia arriba para levantar el suelo de la boca. Sujetar las suturas con una pinza hemostática, y pasarlo sobre la barra transversal.
- Expandir las mejillas con un esparcidor de mejilla a la medida (Figura 1), y bajo un microscopio de disección localizar las papilas sublingual en el piso de la boca.
- Tome el extremo cónico del tubo PE10 preformado mediante un delicado fórceps. manipular suavemente la punta de la cánula en el orificio ductal en la papila sublingual. Confirmar la colocación de la cánula enroscándolo 3-5 mm en el conducto; se asegure de pasar sin ninguna obstrucción.
- Glándula submandibular Instilación
- Inyectar atropina (0,5 mg / kg) por vía subcutánea en la piel del cuello, y esperar 10 minutos para una reducción en las secreciones salivares.
- Asegurar la cánula al orificio del conducto con una gota de cianoacrilato (pegamento), y dejar secar. Infundir la solución en la glándula (200 l / glándula) presionando lentamente el émbolo de la jeringa a una velocidad de ~ 50 l / min.
- Aplastar el tubo con una pinza hemostática, y retirar con cuidado la jeringa. Retener el tubo en el conducto durante 30 - 60 min hasta que el animal recupera la consciencia. Retire la sutura que mantiene la lengua.
- Transferir el animal a una jaula separada, y el uso de una lámpara de calor para mantener el calor durante la recuperación. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado la conciencia para mantener la posición decúbito esternal.
- Después de que el animal es totalmente ambulatoria, alojarlo en el vivero con acceso libre a alimento y agua.
2. La irradiación localizada fraccionadode glándulas submandibulares
- Restringir el animal como se ha descrito antes, y anestesiar con la administración intramuscular de ketamina (33 mg / kg) / xilazina (6 mg / kg) / acepromazina (1 mg / kg) de la mezcla en la extremidad posterior. Confirmar profundidad de la anestesia, y aplicar lubricante a los ojos.
- Coloque el decúbito supino sobre la mesa de animales acelerador lineal, y extender su cuello por la inclinación de la cabeza. Colimar el campo de radiación (3 cm ancho de la ranura) para abarcar el área desde el borde inferior de la mandíbula a la parte superior del esternón.
- Coloque un bolo equivalente a tejido 1 cm sobre la región, y ajustar la distancia entre la fuente de radiación y la parte superior del bolo de 100 cm.
- Irradiar el animal (2,5 Gy) utilizando un 6 MV de fotones de un acelerador lineal. Tasa de dosis, el tamaño del campo, y la distancia desde la fuente de radiación a la superficie de bolo dictará el tiempo de exposición. En la actual configuración, los animales se irradiaron con una dosis de ~ 1 Gy / min.
- Repita la exposición; 2,5 Gy / día para un total de 8días; 4 días / semana con un intervalo de 2 días en el medio. Mantener caliente el animal durante la recuperación. Transferir el animal para el vivero después de que esté totalmente ambulatoria.
- Recoger la saliva estimulada glándula submandibular 8 semanas después de la radiación para medir la función de la glándula 14. La eutanasia a los animales bajo anestesia mediante perfusión cardiaca de frío paraformaldehído al 4% / tampón fosfato salino pH 7,2. Extirpar las glándulas submandibulares para histológico e inmunohistoquímico análisis 14.
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Representative Results
La adaptación de una técnica mínimamente invasiva sialografías, el tratamiento local de las glándulas salivales mayores es factible. Administración Retroductal en rata glándulas salivales submandibulares se intentó por canulación intra-oral de los conductos de Wharton (Figura 2). Los conductos salivales de Wharton abiertas en las papilas sub-lingual situado en el piso de la boca, pero los orificios no son fácilmente visibles. La inserción de la cánula fue, por tanto, hecho por sondaje suave. Para evitar el sangrado o perforación del conducto desfavorable, se utilizó la fuerza, mientras que la colocación de la cánula. paso libre resistencia suave de la cánula en el conducto se confirmó por la espalda suave movimiento de vaivén de la tubería.
La canulación durante los experimentos iniciales se confirmó mediante la infusión de la glándula con hematoxilina o solución de azul de tripano, y la evaluación de la tinción de glándula en animales sacrificados (Figura 3). gly el volumen de llenado se determinó mediante la visualización de la tinción del árbol ductal de las glándulas extirpadas. Para los animales que pesan 150 - 250 g, el llenado completo de la glándula se logró con 200 - 250 l de solución. La infusión rápida puede aumentar la presión de la glándula y aumentar el riesgo de lesiones y biospread. Para evitar la destrucción del tejido, la solución se administró gradualmente a una velocidad de ~ 50 l / min
Las glándulas de rata submandibular son comparables a las glándulas parótidas en su sensibilidad a la radiación 15. Glándulas submandibulares fueron estudiados debido a que pueden ser irradiados selectivamente sin incurrir en graves efectos fuera de la meta (Figura 4). Ahorradores de la cavidad oral y un gran volumen de las glándulas parótidas minimizó la influencia de la mucositis oral y la xerostomía aguda sobre la salud animal y el resultado experimental. Nuestros estudios anteriores en ratas se realizaron con grandes dosis de radiación individuales, 11,16, pero fractionated dosificación es más pertinente a la práctica clínica. La región del cuello del animal fue, por lo tanto, expuestos diariamente a pequeñas dosis de radiación. Para lograr una acumulación uniforme de dosis de radiación dentro de las glándulas submandibulares, situados cerca de la superficie de la piel, un bolo de tejido equivalente blando hecho de un gel homogéneo con una densidad de 1,03 g / cc se coloca sobre el cuello durante la radiación.
El efecto del esquema de radiación fraccionada en el flujo salival, determinada a 8 semanas después del espectáculo de radiación que la exposición diaria a incrementos de 2,5 Gy reduce el flujo salival precipitadamente. Una reducción cerca de 10 veces en la producción de saliva se registró en animales irradiados en contraste con los animales no irradiadas (prueba de la t de Student unilateral 2, p <0,01; Figura 5) 14. Los resultados confirmaron la creación de hipofunción salivales inducida por radiación en animales.
Figura 1. Construcción de una plataforma personalizada y la mejilla-esparcidor. Un alambre rígido de 4 mm se inclinó en un rectángulo de 3 lados (11 cm de ancho x 13 cm) como se muestra, y la barra transversal se inclinó en el centro. Los extremos del alambre se doblan en bucles, tornillos y se hicieron pasar a través de ellos para asegurar el montaje de un tablero de plástico (25 cm de largo x 15 cm de ancho x 0,8 cm de profundidad). Un tornillo central se insertó 5 cm por detrás del conjunto de hilo. Sirvió para anclar la banda de goma que abrió la mandíbula inferior de la inserción:. Un esparcidor de la mejilla a la medida hecha de un solo uso de 1 mm de espesor alambre doblado en una "forma de U" con los extremos ensanchados. Se aprobaron los tubos de plástico en los extremos del cable para evitar daños en la mucosa bucal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. La canulación de la rata submandibular Glándula excretores conductos. La lengua se eleva a elevar el piso de la boca, y cánulas de polietileno fueron insertados en los orificios del conducto submandibular ubicados en el piso de la boca. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La infusión de solución de hematoxilina en el submandibular Glándula Para confirmar la Técnica. Glándula tinción da fe de la administración con éxito de la solución en la glándula submandibular. Tenga en cuenta que la glándula sublingual en la esquina superior izquierda no está manchada. Una glándula control no infundir se muestra a la izquierda.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Colocación del animal por irradiación. El animal se colocó en decúbito supino sobre la mesa acelerador lineal, y la cabeza titula volver a extender el cuello. La anchura de la rendija colimado fue de 3 cm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Efecto de la radiación fraccionada en submandibular Glándula función. Saline fue inculcado en las glándulas submandibulares antes de la radiación. El cuello del animal se irradió en fracciones de 2,5 Gy / día durante 8 días. el DATuna muestra son la media ± SEM de tasa de flujo salival submandibular estimulada 8 semanas después de la finalización del esquema de radiación. La figura se reproduce con el permiso de reproducción de Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc. editor 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las glándulas salivales a menudo reciben dosis de radiación más allá del umbral de la recuperación del tejido en pacientes sometidos a radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello, la ablación electiva de los ganglios del cuello, o neoplasias malignas hematológicas regionales. Aunque las células acinares de fluidos secretores de la glándula son terminales diferenciadas, son paradójicamente sensibles a la radiación. La función secretora cae dentro de las primeras semanas de radiación, e irreversibles daños son el resultado de las glándulas en una salida de baja crónica saliva. Para combatir el mal funcionamiento de la glándula y la sequedad oral que se produce, la conservación o restauración de la función secretora es crucial. Las terapias innovadoras para proteger contra o reparar el daño por radiación están siendo investigados 1, 8-11, 16-20.
La administración sistémica de un agente terapéutico conlleva el riesgo inherente de efectos no deseados en los tejidos no objetivo. entrega dirigida a las glándulas salivales disminuye este riesgo. terapia génica Retroductal es efectivo en la prevención oremediar las glándulas salivales aflicción radiación asociada a 1, 9, 11, 16,17,20. Sin embargo, utilizando la misma técnica, glándulas salivales pueden también ser rediseñado para expresar y secretar proteínas, ectópica. La explotación de la vía secretora endocrina basolateral en células salivales, la expresión del transgen y la secreción de la hormona en la sangre se pueden lograr 21. La transferencia de genes a las glándulas salivales puede, por lo tanto, extenderse eficazmente a la corrección de ciertos trastornos endocrinos.
A pesar de que la canalización de los conductos de las glándulas salivales en animales pequeños puede ser complicado, la práctica es fundamental para perfeccionar la técnica. El extremo cónico de las cánulas puede doblar fácilmente durante la inserción, y hacer la infusión difícil. Aumento de la presión de retorno, mientras que la expulsión de la solución debe advertir de una curva en el tubo, y la necesidad de re-canular el conducto. Las variaciones anatómicas, tales como orificio del conducto aberrante o aumento de la tortuosidad del conducto, además de patologías que limitan la bocaabriéndose como trismo o fibrosis submucosa puede hacer la entrega glándula submandibular un reto. La infusión de un colorante impermeable en la práctica de la técnica puede ser un indicador útil de la entrega precisa. La correcta colocación de las cánulas e infusión suave y sin resistencia son factores importantes para el éxito del procedimiento.
Los pacientes de cáncer a menudo son tratados con fotones megavoltage generados por un acelerador lineal. La radiación se suministra todos los días en pequeñas dosis durante un transcurso de semanas. fraccionamiento de la dosis proporciona períodos de recuperación entre las radiaciones para reducir la toxicidad en los tejidos sanos y sensibilizar a los tumores. Altamente penetrantes rayos de energía de un acelerador lineal son útiles para el tratamiento de tumores profundamente asentados. Y, para el tratamiento de tumores más cerca de la piel, un bolo de tejido equivalente se usa para reducir la profundidad de penetración de fotones. Al igual que en la práctica clínica, una radiación fraccionada acelerador lineal entregado puede ser utilizado para irradiar localmente submaglándulas ndibular de pequeños animales. Sin embargo, la posición de las glándulas inmediatamente debajo de la piel requiere la colocación de un bolo para alcanzar> 90% de la dosis de radiación dentro de las glándulas. El espesor del bolo se calcula en función de la energía de los fotones y la profundidad deseada de penetración en el tejido.
En este artículo, proporcionamos directrices experimentales para la realización de la instilación retroductal glándula submandibular y la irradiación fraccionada local de glándulas submandibulares de rata. Tenemos la esperanza de que los métodos resaltados ayudarán montaje experimental para los investigadores que se aventuran en el campo de la radiotoxicidad de las glándulas salivales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic Polyethylene tubing (PE10) | Becton Dickson | 427401 | |
| 1/2 cc Insulin Syringe U-100 | Becton Dickson | 309306 | |
| Artificial Tears | Miller Vet Supply | 5098-9840-64 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Perma-Hand silk suture | Ethicon | K833H | |
| Graefe forcep | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Olympus SZX16 Stereo Microscope | Hunt Optics and Imaging | ||
| 6 MV Linear Accelerator | Elekta | ||
| Bolus - Skinless | Civco | MTCB410 | |
| Heat Lamp | Braintree Scientific | HL-1 110V |
References
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