Introduction
Сопутствующий разрушение здоровых тканей составляет ряд вредных побочных эффектов лечения рака. Часть или весь из основных слюнных желез, которые лежат с полями излучения неизбежно разрушены. Таким образом, большинство пациентов , перенесших лучевую терапию для рака головы и шеи, рак шейки лимфомы или облучения всего тела перед трансплантацией костного мозга страдают одним из наиболее распространенных и стойких негативных последствий радиации, гипофункции слюнных желез 2-6.
Жидкостные продуцирующих ацинарных клеток слюнных желез крайне чувствительны к радиации. Повреждение слюнных желез вызывает резкое умалять слюноотделения, состояние называют слюнной гипофункции. Хроническое уменьшение слюноотделения ухудшает ключевые оральные мероприятия, такие как жевания, глотания, речи и вкуса, но болезненного последствиями сильной боли, слезы слизистых оболочек, дисфагия, оппортунистических инфекций, а также кариес ухудшаетпациента благополучия и функции 2,3.
Так как радиотерапия-ассоциированной потери слюнных клеток является необратимым, не существует каких-либо корректирующих лечение ксеростомией. Текущее лечение , которое фокусируется на смягчающий симптомы с искусственными заменителями слюнных и prosecretory препаратов является неэффективным для долгосрочного облегчения 6. Хотя улучшенные методы доставки излучения помогли уменьшить тяжесть состояния, нормальная токсичность ткани и его осложнения остаются ограничивающим фактором при лечении рака 6,7. Превентивные меры по предотвращению радиотерапии-ассоциированных осложнений, таким образом, становится нормой. Радио-защитные агенты , которые роются свободных радикалов кислорода, виды приемных клеток заселение, или улучшают восстановление ДНК в настоящее время изучаются , чтобы предотвратить слюнных гипофункции 8-11.
Выделения экзокринных слюнных желез стекают в рот через главные выводных протоков. Интраоральных катетеризация гое выводные протоки для инъекций контрастных агентов обычно делается в амбулаторных условиях. Используя аналогичный подход, слюнные железы могут быть направлены непосредственно на лечение локализованного 12. Помимо снижения риска развития системных побочных эффектов, retroductal железа инстилляция имеет дополнительные преимущества. Компоновка монослой клеток слюнных вокруг дерева протоковой позволяет нацеливание всех слюнных эпителиальных клеток, и волокнистый инкапсуляция железы действует как барьер для уменьшения нежелательного терапевтического распространения. В сущности, слюнные железы оптимально подходит для целенаправленного лечения железы недугов, таких как радиационно-индуцированной слюнных гипофункции.
Обычное излучение для лечения рака поставляется в малых дозах (1,8 - 2,5 Гр / фракция / день, пять дней в неделю) в течение нескольких недель. Таким образом, радио-защитное терапевтическое, который показывает эффективность против затяжного схемы излучения в экспериментальных моделях имеет большее клиническое влияние. Compromised функция слюнных после фракционированного облучения было зарегистрировано в небольших животных, но источник излучения, дозы фракция, и протоколы , используемые разнообразны 9,10,13.
Этот отчет устанавливает методы retroductal доставкой и локализованным излучением крыс подчелюстных желез с использованием пациентом соответствующего источника излучения и дозы фракции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены ЛГУ здравоохранения, Шривпорте, уходу и использованию животных комитета и были в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
1. катетеризация Rat подчелюстной слюнных железах
- Подготовка Шприц-НКТ Ассамблеи
- Сокращение длины 10 см PE10 полиэтиленовых труб с помощью скальпеля. Держите оба конца трубки между указательным и большим пальцем. Нагреть средней части трубки над нежным пламенем, и мягко растянуть размягченное трубку, чтобы удвоить свою длину, потянув обе стороны.
- Обрежьте трубку в середине скальпелем под углом 45 O , чтобы получить 2 канюль - каждый с коническим концом. Разверните Неклиновидная конец канюли, установив его в течение 29 G иглой 0,5 см инсулиновый шприц.
- Удалите канюлю, и сделать 220 мкл физиологического раствора в шприц. Нажмите, чтобы вытеснить воздушные пузыри. Установить cannulа над иглой, и толкать поршень шприца, чтобы удалить воздух и обеспечить свободный поток раствора через канюлю. Отрегулируйте громкость до 200 мкл.
- Интраоральных катетеризация подчелюстной железы Канальные
Примечание: Автоклавы инструменты до процедуры, и стерилизовать в промежутках между процедурами в горячей бусинка стерилизатор.- Взвешивание крыс Sprague Dawley, и дозировать расчетный объем кетамина (42 мг / кг) / ксилазина (8 мг / кг) / Ацепромазин (1,4 мг / кг), смесь в шприц для подкожных инъекций.
- Задержите животное, взявшись за основание хвоста между указательным и большим пальцами одной руки и скользя другой рукой по всему телу, чтобы понять это. Подведите указательным и средним пальцами по бокам головы в то время как держать туловище с большим и остальными пальцами.
- Вводят анестетик в задней конечности мускулатуры. Подтвердить глубину анестезии пальца щепоткой и глазной рефлекс. Нанесите смазку для глаз, чтобы предотвратить сухость времяживотное находится под анестезией.
- Поместите животное на специально разработанной платформе (рисунок 1), а также участвовать верхние резцов на поперечной панели. Потяните нижнюю челюсть вниз, обернув резинкой вокруг нижних резцов и закрепления его на платформу.
- Pass стерильный шовный материал через язык и поднимите его вверх, чтобы поднять пол рта. Зажмите швы с кровоостанавливающего, и передать его на поперечной панели.
- Раскройте щеки с заказного щек распределителем (рисунок 1), и под микроскопом рассекает найти сублингвально сосочки на дне полости рта.
- Возьмитесь конический конец предварительно сформированного PE10 трубки с использованием тонких щипцов. Аккуратно манипулировать кончик канюли в протоковой отверстие на подъязычной сосочков. Подтвердите размещение канюли, продев его 3 - 5 мм в канал; убедитесь, что она проходит без каких-либо препятствий.
- Подчелюстные Сальник INSTIllation
- Вводят атропин (0,5 мг / кг) подкожно в загривок, и подождите 10 мин для снижения слюнных выделениях.
- Закрепите канюлю к воздуховоду отверстие с каплей цианакриловым (клей), и дайте высохнуть. Закапывание раствора в железе (200 мкл / железы), медленно нажимая поршень шприца со скоростью ~ 50 мкл / мин.
- Измельчите трубку с кровоостанавливающего и осторожно удалите шприц. Сохранил трубки в канале в течение 30 - 60 мин, пока животное не приходит в сознание. Удалите шовный материал, который держит язык.
- Передача животное в отдельную клетку, а также использовать лампу высокой температуры, чтобы держать его теплым во время восстановления. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание, чтобы поддерживать грудины лежачее положение.
- После того, как животное полностью амбулаторное, он будет размещен в виварии с неограниченным доступом к пище и воде.
2. Локализованные фракционированного облученияподчелюстных железах
- Сдерживание животное, как описано ранее, и анестезию с внутримышечным введением кетамина (33 мг / кг) / ксилазином (6 мг / кг) / ацепромазина (1 мг / кг) смеси в заднюю конечность. Подтвердить глубину анестезии, и нанесите смазку для глаз.
- Поместите животное на лежачем линейного ускорителя столешницу, и продлить его шею, наклоняя голову. Сколлимировать поле излучения (3 см ширина щели), чтобы охватить область от нижней границы нижней челюсти к верхней части грудины.
- Поместите 1 см ткани-эквивалентно болюса по области, и отрегулировать расстояние между источником излучения и верхней части болюса до 100 см.
- Облучают животное (2,5 Гр), используя 6 MV фотонный пучок линейного ускорителя. Мощность дозы, размер поля, и расстояние от источника излучения до поверхности болюс будет диктовать время экспозиции. В текущем наборе вверх, животных облучали при мощности дозы ~ 1 Гр / мин.
- Повторите воздействия; 2,5 Гр / сут в течение в общей сложности 8дней; 4 дней / неделю с интервалом 2 дня между ними. Держите животное в тепле во время восстановления. Передача животных в виварии после того, как она полностью амбулаторное.
- Собирают стимулируется подчелюстной слюной сальника 8 недель после лучевой терапии для измерения функции железы 14. Эвтаназии животных под анестезией путем сердечной перфузии холодным 4% параформальдегид / фосфатным буферным солевого раствора рН 7,2. Вытравить подчелюстные железы для гистологического и иммуногистохимического анализа 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Адаптация минимально инвазивной методики сиалография, местное лечение крупных слюнных желез возможно. Retroductal введение в крыс подчелюстной слюнных желез была предпринята попытка с помощью внутриротовой катетеризацией протоков Уортон (рисунок 2). Слюнные протоки Wharton открытых на подъязычное сосочков находится на дне полости рта, но отверстия не легко различимы. Вставка канюли, таким образом, делается путем осторожного зондирования. Чтобы избежать предосудительного кровотечение или перфорация протока, никакая сила не была использована при размещении канюлю. Гладкая резистивные свободный проход канюли в канале была подтверждена путем осторожного вперед и назад движение трубки.
Канюляция во время первых экспериментов было подтверждено вливая железы с гематоксилином или трипанового синего раствора, а также оценку окрашивания железы у умерщвленных животных (рисунок 3). Glи заполнить объем был установлено путем визуализации окрашивания дерева протоковой в искоренены желез. Для животных с массой тела 150 - 250 г, полное заполнение железы была достигнута при 200 - 250 мкл раствора. Быстрое вливание может увеличить давление железы и повышают риск получения травм и biospread. Для того, чтобы избежать разрушения тканей, раствор вводят постепенно со скоростью ~ 50 мкл / мин
Крысиный подчелюстной железы сопоставимы с околоушных желез в их чувствительности к радиации 15. Были изучены подчелюстные железы , потому что они могут быть избирательно облучают , не подвергаясь тяжелой Офф-мишени эффектов (рисунок 4). Щадящая полости рта и большого объема околоушных желез сведено к минимуму влияние мукозита полости рта и острого ксеростомией на здоровье животных и экспериментальных результатах. Наши более ранние исследования на крысах проводились с одиночными, большими дозами радиации 11,16, но гидроразрываtionated дозирования более уместен к клинической практике. Область шеи животного был, поэтому, ежедневно подвергаются малых доз радиации. Для достижения равномерного накопления дозы облучения в пределах подчелюстных желез, расположенных близко к поверхности кожи, мягких тканей-эквивалент болюс изготовлен из однородного геля с плотностью 1,03 г / см помещали над шеей во время излучения.
Влияние фракционного схемы излучения на слюноотделения, как определено через 8 недель после излучения показывают, что ежедневное воздействие с шагом 2,5 Гр уменьшенную слюнной поток стремительнее. Близкий 10-кратное снижение объемов производства слюны был зафиксирован у облученных животных в отличие от необлученных животных (t- тест 2-сторонний Стьюдента, р <0,01; рис 5) 14. Результаты подтвердили создание радиационно-индуцированной слюнных гипофункции у животных.
Рисунок 1. Построение настроенную платформы и Чик-разбрасыватель. Жесткий 4 мм провод был согнут в 3-сторонней прямоугольника (11 см ширина х высота 13 см) , как показано на рисунке, а поперечная штанга была наклонена в центре. Концы проволоки были согнуты в петли, и винты пропускают через них, чтобы обеспечить сборку на пластиковой доски (25 см длина х 15 см ширина х глубина 0,8 см). Центральный винт был вставлен 5 см кзади проволоки узла. Он служил на якорь резиновую ленту , которая распахнула нижнюю челюсть Врезка:. Пользовательская встроенный щека-расширитель , выполненный из толстой проволоки согнуты одноразовые 1 мм в "U - образный" с расширяющимися концами. Были переданы пластиковые трубки через концы проводов , чтобы предотвратить повреждение слизистой оболочки полости рта. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
: Keep-together.within-страницу = "1"> 
Рисунок 2. катетеризация крыс подчелюстной сальником выводные протоки. Язык поднимается , чтобы поднять пол рта, и полиэтилен канюль были вставлены в подчелюстной протоков отверстия , расположенные на дне полости рта. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.
Рисунок 3. Настой гематоксилин раствора в подчелюстной слюнной железы , чтобы подтвердить технику. Сальник окрашивание свидетельствует об успешном введении раствора в подчелюстной железе. Обратите внимание, что сублингвального железа в верхнем левом углу не окрашивается. Не-вселяли управления железа показано на рисунке слева.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Размещение животных для облучения. Животное укладывают навзничь на линейном ускорителе столе, а голова под названием назад , чтобы расширить шею. Коллимированы ширина щели составляла 3 см. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Влияние излучения на фракционированного Подчелюстные железы функции. Физиологический раствор закапывают в подчелюстных железах перед радиацией. Шейка животного облучали в долях 2,5 Гр / день в течение 8 дней. ДАТа, показанный представляют собой среднее ± SEM стимулированного подчелюстной слюнной скорости потока через 8 недель после завершения схемы излучения. На рисунке воспроизводится с разрешения авторского права от Human Gene Therapy, Мэри Энн Liebert, Inc. издателя 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Слюнные железы часто получают дозы облучения за порогом восстановления тканей у пациентов, перенесших лучевую терапию по поводу рака головы шеи, выборного абляции шеи узлов или региональных гематологических злокачественных новообразований. Несмотря на то жидкость секретирующих ацинарных клеток железы являются терминально дифференцированных, они парадоксальным образом чувствительны к радиации. Секреторную функцию капель в течение первых недель радиации, а также необратимые повреждения железы приводит к хронической выход низкой слюной. Для борьбы с плохой функцией железы и сухости во рту, что вытекает, сохранение или восстановление секреторной функции имеет решающее значение. Новые методы лечения , чтобы защитить против или ремонт радиационных повреждений выясняются 1, 8-11, 16-20.
Системное введение терапевтического несет в себе неотъемлемый риск нежелательных эффектов в нецелевых тканях. Направленная доставка слюнных желез уменьшает этот риск. Retroductal генная терапия является эффективным в предотвращении илиустранение радиационно-ассоциированных слюнной железы недуг 1, 9-, 11, 16,17,20. Тем не менее, используя ту же технику, слюнные железы могут также быть переработана для экспрессии и секреции белков, эктопически. Эксплуатируя базолатеральной эндокринный секреторный путь в слюнных клеток, экспрессия трансгена и секреции гормона в крови может быть достигнут 21. Перенос генов в слюнных железах может, следовательно, быть эффективно распространена на исправление некоторых эндокринных нарушений.
Хотя катетеризация слюнных желез у мелких животных может быть сложно, практика занимает центральное место в оттачивая технику. Конический конец канюли может легко перегибать во время вставки, и сделать настой трудно. Увеличение обратного давления во время выталкивания раствора должна предостеречь изгиба в трубопроводе, а также необходимость повторно вводить иглу в канал. Анатомические вариации, такие как аберрантных воздуховода отверстие или увеличенной протока извитости, наряду с патологиями, которые ограничивают рототкрытие как тризм или подслизистого фиброза может сделать подчелюстной железы доставки вызов. Настой из impermeant красителя, практикуя техники может быть полезным индикатором точной доставки. Правильное размещение канюли и нежным, без сопротивления инфузии являются важными факторами для успеха процедуры.
Раковые больные часто обращаются с мегавольтная фотонов, генерируемых с помощью линейного ускорителя. Излучение подается ежедневно в небольших дозах в течение течение недели. Фракционирования дозы обеспечивает периоды восстановления между излучениями, чтобы снизить токсичность на здоровые ткани и повышать чувствительность опухолей. С высокой проникающей энергии пучки линейного ускорителя полезны для лечения глубоко расположенных опухолей. И, для лечения опухолей, расположенных ближе к коже, ткань-эквивалент болюс используется для уменьшения глубины проникновения фотонов. Подобно клинической практике, линейный ускоритель поставляется фракционированный излучение может быть использовано для локально облучать submandibular желез мелких животных. Тем не менее, положение желез непосредственно под кожей вызывает необходимость размещения болюса, чтобы достигнуть> 90% дозы излучения в железах. Толщина болюс рассчитывается в зависимости от энергии фотонов и желаемой глубины проникновения в ткани.
В этой статье мы предлагаем экспериментальные рекомендации для выполнения retroductal подчелюстной закапывания железы и местного фракционированного облучения крыс подчелюстных желез. Мы надеемся на то, что выделенные методы помогут экспериментальную установку для исследователей углубляясь в области слюнной железы радиотоксичностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic Polyethylene tubing (PE10) | Becton Dickson | 427401 | |
| 1/2 cc Insulin Syringe U-100 | Becton Dickson | 309306 | |
| Artificial Tears | Miller Vet Supply | 5098-9840-64 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Perma-Hand silk suture | Ethicon | K833H | |
| Graefe forcep | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Olympus SZX16 Stereo Microscope | Hunt Optics and Imaging | ||
| 6 MV Linear Accelerator | Elekta | ||
| Bolus - Skinless | Civco | MTCB410 | |
| Heat Lamp | Braintree Scientific | HL-1 110V |
References
- Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3268-3273 (1997).
- Chambers, M. S., Rosenthal, D. I., Weber, R. S.
- Sciubba, J. J., Goldenberg, D.
- Rodrigues, N. A., et al. A prospective study of salivary gland function in lymphoma patients receiving head and neck irradiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75 (4), 1079-1083 (2009).
- Coracin, F. L., et al. Major salivary gland damage in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplantation assessed by scintigraphic methods. Bone Marrow Transplant. 37 (10), 955-959 (2006).
- Jensen, S. B., et al. A systematic review of salivary gland hypofunction and xerostomia induced by cancer therapies: management strategies and economic impact. Support Care Cancer. 18 (8), 1061-1079 (2010).
- de Castro, G. Jr, Federico, M. H. Evaluation, prevention and management of radiotherapy-induced xerostomia in head and neck cancer patients. Curr Opin Oncol. 18 (3), 266-270 (2006).
- Epperly, M. W., Carpenter, M., Agarwal, A., Mitra, P., Nie, S., Greenberger, J. S. Intraoral manganese superoxide dismutase-plasmid/liposome (MnSOD-PL) radioprotective gene therapy decreases ionizing irradiation-induced murine mucosal cell cycling and apoptosis. In Vivo. 18 (4), 401-410 (2004).
- Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Mol Ther. 15 (12), 2101-2106 (2007).
- Zheng, C., et al. Prevention of radiation-induced salivary hypofunction following hKGF gene delivery to murine submandibular glands. Clin Cancer Res. 17 (9), 2842-2851 (2011).
- Palaniyandi, S., et al. Adenoviral delivery of Tousled kinase for the protection salivary glands against ionizing radiation damage. Gene Ther. 18 (3), 275-282 (2011).
- Baum, B. J., Voutetakis, A., Wang, J. Salivary glands: novel target sites for gene therapeutics. Trends Mol Med. 10 (12), 585-590 (2004).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-like growth factor-1 preserves salivary gland function after fractionated radiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 78 (2), 579-586 (2010).
- Timiri Shanmugam, P. S., et al. Recombinant AAV9-TLK1B administration ameliorates fractionated radiation-induced xerostomia. Hum Gene Ther. 24 (6), 604-612 (2013).
- Coppes, R. P., Vissink, A., Konings, A. W. T. Comparison of radiosensitivity of rat parotid and submandibular glands after different radiation schedules. Radiother Oncol. 63 (3), 321-328 (2002).
- Sunavala-Dossabhoy, G., Palaniyandi, S., Richardson, C., De Benedetti, A., Schrott, L., Caldito, G. TAT-mediated delivery of Tousled protein to salivary glands protects against radiation-induced hypofunction. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 84 (1), 257-265 (2012).
- Baum, B. J., et al. Transfer of the AQP1 cDNA for the correction of radiation-induced salivary hypofunction. Biochim Biophys Acta. 1758 (8), 1071-1077 (2006).
- Tran, S. D., et al. Paracrine effects of bone marrow soup restore organ function, regeneration, and repair in salivary glands damaged by irradiation. PLoS One. 8 (4), e61632 (2013).
- Nanduri, L. S., et al. Salisphere derived c-Kit+ cell transplantation restores tissue homeostasis in irradiated salivary gland. Radiother Oncol. 108 (3), 458-463 (2013).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Mol Ther. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Voutetakis, A., et al. Reengineered salivary glands are stable endogenous bioreactors for systemic gene therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 3053-3058 (2004).
