Retroductal Submandibularis Gland Instillation og Lokaliseret Fraktioneret Bestråling i en rotte model af spyt hypofunktion

Introduction

Collateral destruktion af sundt væv udgør en række skadelige bivirkninger af kræftbehandling. En del af eller hele de store spytkirtler, der ligger med den stråling felter er uundgåeligt ødelagt. Derfor er de fleste patienter, der gennemgår strålebehandling for hoved-halscancer, livmoderhalskræft lymfom, eller hele kroppen stråling før knoglemarvstransplantation lide en af de mest almindelige og vedvarende bivirkninger af stråling, spytkirtel hypofunction ^2-6.

Fluidet-producerende acinære celler af spytkirtlerne er akut følsomme for stråling. Skader på spytkirtlerne forårsager en drastisk formindskelse af spyt flow, en tilstand kaldet spyt hypofunktion. Den kroniske reduktion i spyt flow svækker centrale mundtlige aktiviteter såsom tygning, synkning, tale, og smag, men morbid følgesygdomme af intens smerte, slimhinder tårer, dysfagi, opportunistiske infektioner, og caries forværrer enpatientens velbefindende og funktion ^2,3.

Da radioterapi-associeret spyt celletab er irreversibel, er der ingen korrigerende behandling af xerostomi. Aktuel behandling, der fokuserer på at lindre symptomerne med kunstige spyt erstatninger og prosecretory lægemidler er ineffektiv for langsigtet nødhjælp ^6. Selvom forbedrede stråling leveringsteknikker har hjulpet mindske sværhedsgraden af den tilstand, normale væv toksicitet og dens komplikationer fortsat en begrænsende faktor i kræftbehandlingen ^6,7. Forebyggende foranstaltninger for at forhindre strålebehandling-associerede komplikationer er derfor ved at blive normen. Radio-beskyttende stoffer, der bekæmper frie radikaler ilt arter, fremme cellerepopulation, eller øge DNA-reparation bliver udforsket at afværge spyt hypofunktion ^8-11.

Sekreter af eksokrine spytkirtler dræne ind i munden gennem de vigtigste udskillelsesvej kanaler. Intra-oral kanylering af the ekskretionsorganerne kanaler til injektion af kontrastmidler sker rutinemæssigt som en ambulant procedure. Ved hjælp af en lignende fremgangsmåde, kan spytkirtler direkte målrettet til lokaliseret behandling ^12. Bortset fra at reducere risikoen for systemiske bivirkninger, har retroductal kirtel instillation ekstra fordele. Den monolag arrangement af spyt celler omkring duktalt træet tillader målretning af alle spyt epitelceller, og det fibrøse indkapsling af kirtel virker som en barriere for at reducere uønskede terapeutisk spredning. I det væsentlige, spytkirtler er optimalt egnet til målrettet behandling af kirtel lidelser såsom stråling-induceret spyt hypofunktion.

Konventionel stråling til kræftbehandling leveres i små doser (1,8-2,5 Gy / fraktion / dag, fem dage om ugen) i en periode på uger. Derfor er en radio-beskyttende terapeutisk, der viser effekt mod en langvarig stråling ordning i forsøgsmodeller har større klinisk betydning. Compromised spyt funktion efter fraktioneret stråling er blevet registreret i små dyr, men stråling kilde, fraktion dosis og protokoller, der anvendes er varierede ^9,10,13.

Denne rapport fastslår metoder til retroductal levering til og lokaliseret stråling af rotte submandibulære kirtler hjælp patient-relevant strålekilde og fraktion dosis.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af LSU Health, Shreveport, Animal Care og brug Udvalg og var i overensstemmelse med NIH retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr.

1. Kanylering af Rat Submandibularis spytkirtler

1. Udarbejdelse af Sprøjte-Tubing Assembly
   1. Skær en 10 cm længde af PE10 polyethylenslange med en skalpel. Hold begge ender af slangen mellem pegefinger og tommelfinger. Opvarm den midterste del af røret over en blid flamme, og forsigtigt strække den blødgjorte rør at fordoble sin længde ved at trække begge sider.
   2. Skær slangen i midten med en skalpel i en vinkel på 45 ^{o for} at få 2 kanyler - hver med en tilspidset ende. Udvide ikke-tilspidsede ende af kanylen ved at montere den over en 29 G nål på 0,5 cc insulinsprøjte.
   3. Fjern kanylen, og trække 220 pi saltvand ind i sprøjten. Tryk for at løsne luftbobler. Monter cannulen over nålen, og skub sprøjtens stempel for at fjerne luft og sikre en fri strøm af løsningen gennem kanylen. Juster lydstyrken til 200 pi.
2. Intra-Oral Kanylering af Submandibularis Gland Duct
   BEMÆRK: Autoklave instrumenter forud for proceduren, og sterilisere i-mellem procedurerne i en varm perle sterilisator.
   1. Afvej Sprague Dawley rotte, og dispensere den beregnede mængde af ketamin (42 mg / kg) / xylazin (8 mg / kg) / acepromazin (1,4 mg / kg) blanding i en injektionssprøjte.
   2. Begrænse dyret ved at gribe haleroden mellem pegefingeren og tommelfingeren på den ene hånd og skubbe den anden side over hele kroppen kan gribe fat i. Hvil indekset og midterste fingre langs siderne af hovedet, mens holde torso med tommelfingeren og de resterende fingre.
   3. Sprøjt bedøvelsesmiddel i bagbenet muskulatur. Bekræft dybde af anæstesi ved tå knivspids og øjenlågsreflekser. Påfør øjet smøremiddel for at forhindre tørhed mensdyr er under anæstesi.
   4. Sende dyret på en specialdesignet platform (figur 1), og engagere de øvre fortænder på tværbjælken. Træk underkæben ned ved looping en elastik omkring de nederste fortænder og forankring det til platformen.
   5. Passerer en steril sutur gennem tungen og løfte den op for at hæve gulvet i munden. Spænd suturerne med en hæmostat, og videregive det over den tværgående bar.
   6. Udvid kinderne med en specialbygget kind sprederen (figur 1), og under et dissektionsmikroskop lokalisere sublingual papiller på gulvet af munden.
   7. Forstå den tilspidsede ende af den præformede PE10 rør ved hjælp af en delikat pincet. manipulere forsigtigt spidsen af ​​kanylen ind i duktalt åbning på den sublinguale papiller. Bekræft placering af kanylen ved at skrue 3 - 5 mm ind i kanalen; sikre, at det går, uden nogen forhindring.
3. Submandibularis Gland Instillation
   1. Sprøjt atropin (0,5 mg / kg) subkutant i nakkeskindet, og vent 10 min for en reduktion i spytsekretionerne.
   2. Fastgør kanylen til kanalen åbningen med en dråbe cyanoacrylat (lim), og lad det tørre. Indgyde opløsning i kirtlen (200 pi / kirtel) ved langsomt at trykke sprøjtens stempel ved en hastighed på ~ 50 pl / min.
   3. Knus slangen med en hæmostat, og fjern forsigtigt sprøjten. Behold slangen i kanalen i 30 - 60 min, indtil dyret kommer til bevidsthed. Fjern suturen, der holder tungen.
   4. Overfør dyret til en separat bur, og bruge en varmelampe til at holde den varm under opsving. Lad ikke dyret uden opsyn, indtil det har genvundet bevidstheden at opretholde brystbenslymfeknuderne recumbence.
   5. Efter at dyret er fuldt ambulant, huse det på terrariet med ubegrænset adgang til mad og vand.

2. Lokaliseret Fraktioneret Bestrålingaf submandibulære Kirtler

1. Begrænse dyret som beskrevet før, og bedøver med intramuskulær indgivelse af ketamin (33 mg / kg) / xylazin (6 mg / kg) / acepromazin (1 mg / kg) mix i bagbenet. Bekræft anæstesidybden, og smøres øjnene.
2. Placer dyret liggende på den lineære accelerator bordplade, og udvide sin hals ved at vippe hovedet. Kollimere strålefeltet (3 cm spaltebredde) at omfatte området fra den nedre kant af underkæben til toppen af ​​brystbenet.
3. Placer en 1 cm tissue-ækvivalent bolus over regionen, og justere afstanden mellem strålingskilden og toppen af ​​bolusen til 100 cm.
4. Bestråle dyret (2,5 Gy) ved anvendelse af en 6 MV foton stråle af en lineær accelerator. Dosering, felt størrelse, og afstand fra stråling kilde til bolus overflade vil diktere eksponeringstiden. I den nuværende oprettet blev dyrene bestrålet i en dosis på ~ 1 Gy / min.
5. Gentag eksponering; 2,5 Gy / dag i i alt 8dage; 4 dage / uge med en 2-dages interval i mellem. Hold dyret varm under opsving. Overfør dyret for vivarium når det er fuldt oppegående.
6. Indsamle stimuleret glandula submandibularis spyt 8 uger efter stråling at måle kirtelfunktion ^14. Aflive dyr under bedøvelse ved hjerteperfusion af kold 4% paraformaldehyd / phosphatpufferholdigt saltvand pH 7,2. Udrydde submandibulære kirtler til histologisk og immunhistokemisk analyse ^14.

Representative Results

Tilpasning af en minimalt invasiv sialography teknik, lokal behandling af større spytkirtler er mulig. Retroductal administration i rotte submandibulære spytkirtler blev forsøgt ved intraoral kanylering af Whartons kanaler (figur 2). Spyt aftrækskanaler Wharton åbne på den sublinguale papiller placeret på gulvet i munden, men åbningerne er ikke umiddelbart synlige. Insertion af kanylen blev derfor udført ved forsigtig sondering. For at undgå uheldige blødning eller kanal perforation, blev ingen kraft bruges, mens placere kanylen. Glat modstand-fri passage af kanylen i kanalen blev bekræftet ved forsigtig frem og tilbage bevægelse af slangen.

Kanylering under indledende forsøg blev bekræftet ved infusion pakdåsen med hematoxylin eller trypan blå opløsning, og evaluering kirtel farvning i aflivede dyr (Figur 3). Glog fylde volumen blev konstateret ved at visualisere farvning af duktalt træ i udryddet kirtler. For dyr vejer 150 - 250 g, blev fuldstændig fyldning af kirtlen opnået med 200 - 250 pi opløsning. Hurtig infusion kan øge kirtel tryk og øge risikoen for skader og biospread. For at undgå vævsnedbrydning blev opløsningen administreres gradvist ved en hastighed på ~ 50 pl / min

Rotte submandibulære kirtler er sammenlignelige med parotideale kirtler i deres følsomhed over for stråling ^15. Submandibulære kirtler blev undersøgt, fordi de kan selektivt bestråles uden at pådrage alvorlige ikke-tilsigtede virkninger (figur 4). Køligt i mundhulen og et stort volumen af ​​de parotideale kirtler minimerede indflydelse af oral mucositis og akut xerostomi om dyresundhed og eksperimenterende resultat. Vores tidligere undersøgelser på rotter blev udført med enkelt, store doser af stråling ^11,16, men fractionated dosering er mere relevant at klinisk praksis. Halsregionen af ​​dyret blev derfor udsat dagligt for små doser af stråling. For at opnå en ensartet opbygning af stråledosis inden submandibulære kirtler placeret nær hudoverfladen, blev et blødt væv-ækvivalent bolus fremstillet af en homogen gel med en densitet på 1,03 g / cc anbragt over halsen under stråling.

Effekten af ​​fraktioneret stråling ordning på spyt flow, som bestemt ved 8 uger efter stråling viser, at daglig eksponering for trin på 2,5 Gy reduceret spytsekretion stejlt. En nær 10 gange reduktion i spyt produktion blev registreret i bestrålede dyr i modsætning til ikke-bestrålede dyr (2-sidet Student t-test, p <0,01, figur 5) ^14. Resultaterne bekræftede etableringen af ​​stråling-induceret spyt hypofunction hos dyr.

Figur 1. Opførelse af en Customized Platform og Cheek-Spreader. En stiv 4 mm wire blev bøjet i en 3-sidet rektangel (11 cm højde x 13 cm bredde) som vist, og den tværgående bar blev bøjet i midten. Enderne af tråden blev bøjet til sløjfer, og skruer blev ledt gennem dem at fastgøre til en plastik plade (25 cm længde x 15 cm bredde x 0,8 cm dybde). En central skrue blev indsat 5 cm posteriort for tråden forsamling. Det tjente til at forankre elastikken, der trak åbne underkæben Indsat:. En specialbygget kind-spreder lavet af en engangs 1 mm tyk wire bøjet i en "U form" med tragtformet ender. Plastic slanger blev forbigået trådenderne at forhindre skader på mundslimhinden. Klik her for at se en større version af dette tal.

: Holde-together.within-side = "1">
Figur 2. Kanylering af Rotte glandula submandibularis ekskretionsorganerne Kanaler. Tungen er hævet for at hæve gulvet i munden, og polyethylen kanyler blev indsat i submandibulære kanal åbninger placeret på gulvet i munden. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3. Infusion af hematoxylinopløsning i glandula submandibularis at Bekræft Teknik. Gland farvning vidner til en vellykket administration af løsningen i submandibulære kirtel. Bemærk, at den sublinguale kirtel i øverste venstre hjørne ikke farves. En ikke-infused kontrol kirtel er vist til venstre.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Placering af Animal for bestråling. Dyret lægges liggende på den lineære accelerator tabellen, og hovedet titlen tilbage at forlænge halsen. Den kollimeret slids bredde var 3 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Virkning af fraktioneret bestråling på glandula submandibularis Funktion. Saltvand blev inddryppet i de submandibulære kirtler før stråling. Halsen af ​​dyret blev bestrålet i fraktioner på 2,5 Gy / dag i 8 dage. Den datet vist er gennemsnit ± SEM af stimuleret submandibulære spyt strømningshastighed 8 uger efter afslutning af stråling ordning. Figuren er gengivet med copyright tilladelse fra Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc. udgiver ^15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Spytkirtler modtager ofte stråledoser ud over tærsklen af ​​væv opsving i patienter, der gennemgår strålebehandling for hoved-halscancer, elektiv ablation af halsen noder, eller regionale hæmatologiske maligniteter. Selvom fluidet-udskillende acinarceller af kirtlen er terminalt differentieret, er de paradoksalt følsomme for stråling. Den sekretoriske funktion falder inden for de første uger af stråling, og irreversible kirtel skaden skyldes en kronisk lav spyt output. For at bekæmpe dårlig kirtel funktion og mundtørhed, som indledes, bevarelse eller genoprettelse af sekretorisk funktion er afgørende. Nye behandlingsformer til at beskytte mod eller reparere skader stråling bliver undersøgt ^{en, 8-11, 16-20.}

Systemisk administration af en terapeutisk bærer iboende risiko for uønskede virkninger i andre målrettede væv. Rettet levering til spytkirtlerne mindsker denne risiko. Retroductal genterapi er effektivt til at forebygge ellerafhjælpning stråling-associeret spytkirtel lidelse ^{1, 9, 11, 16,17,20.} Men ved hjælp af den samme teknik, spytkirtlerne kan også reengineered, til at udtrykke og udskille proteiner, ektopisk. Udnyttelse den basolaterale endokrine sekretoriske vej hos spyt celler, kan transgen ekspression og hormon sekretion i blodet opnås ^21. Genoverførsel til spytkirtlerne kan derfor effektivt udvides til korrektionen af ​​visse endokrine lidelser.

Selv kanylering af spytkirtel kanaler i små dyr kan være en vanskelig opgave, praksis er centralt for honing teknikken. Den tilspidsede ende af kanylerne kan kinke let under indføring og gøre infusion vanskelig. Øget modtryk samtidig uddrivelse opløsningen skal advare af en bøjning i røret, og nødvendigheden af ​​at re-kanyle kanalen. Anatomiske variationer såsom afvigende kanal åbning eller forøget kanal snoning, sammen med patologier, der begrænser mundenåbning ligesom trismus eller submukøs fibrose kan gøre submandibulære kirtel levering en udfordring. Infusion af en impermeabel farvestof, når praktisere teknikken kan være en nyttig indikator for præcis levering. Korrekt placering af kanyler og blide, modstand-fri infusion er vigtige faktorer for succes i proceduren.

Cancerpatienter er ofte behandlet med megavolt fotoner genereret af en lineær accelerator. Stråling leveres dagligt i små doser over en løbet af uger. Dosis fraktionering giver perioder med opsving mellem stråling til at reducere toksicitet på sundt væv og bevidstgøre tumorer. Stærkt gennemtrængende energi bjælker af en lineær accelerator er nyttige til behandling af dybtliggende tumorer. Og, til behandling af tumorer tættere på huden, er et væv-ækvivalent bolus anvendes til at reducere dybden af ​​foton penetration. Ligner den kliniske praksis, kan en lineær accelerator leveret fraktioneret bestråling anvendes til lokalt at bestråle submandibular kirtler af små dyr. positionen af ​​kirtler umiddelbart under huden nødvendiggør imidlertid placeringen af ​​en bolus til opnåelse> 90% dosis stråling indenfor kirtler. Tykkelsen af ​​bolusen beregnes afhængigt af energi fotoner og den ønskede dybde af vævspenetration.

I denne artikel giver vi eksperimentelle retningslinjer for udførelse af retroductal submandibulære kirtel instillation og lokal fraktioneret bestråling af rotte submandibulære kirtler. Det er vores håb, at de fremhævede metoder vil hjælpe forsøgsopstilling for efterforskerne venturing ind i området for spytkirtel radiotoksicitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intramedic Polyethylene tubing (PE10)	Becton Dickson	427401
1/2 cc Insulin Syringe U-100	Becton Dickson	309306
Artificial Tears	Miller Vet Supply	5098-9840-64
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Perma-Hand silk suture	Ethicon	K833H
Graefe forcep	Fine Science Tools	11051-10
Olympus SZX16 Stereo Microscope	Hunt Optics and Imaging
6 MV Linear Accelerator	Elekta
Bolus - Skinless	Civco	MTCB410
Heat Lamp	Braintree Scientific	HL-1 110V